TTC用于尿液菌落计数的探讨
作者：楼永良 杜季梅 郑美琴
单位：楼永良 杜季梅(温州医学院 检验医学系，浙江 温州 325027)；郑美琴(温州医学院附属第二医院 检验科，浙江 温州 325027)
关键词：尿液；氯化三苯四氮唑；菌落计数
温州医学院学报000240 [摘 要] 目的:了解氯化三苯四氮唑(TTC)能否用于尿液菌落计数。 方法:对模拟尿液和临床尿液分别行平板倾注法和TTC法，对测得数据进行分析处理。 结果:两种方法对模拟尿液和临床尿液的菌落计数结果差异无显著性(P>0.05)。结论:TTC可用于尿液菌落计数，且易于鉴别计数。
[中图分类号] R466.12 [文献标识码] B [文章编号] 1000-2138(2000)02-0166-02
尿液培养和菌落计数对尿路感染的诊断具有重要意义。一般临床尿液菌落计数采用平板倾注法或定量接种法。有人利用多数细菌生长时能还原无色的氯化三苯四氮唑(TTC)为红色的三苯甲形成红色菌落的特性，将TTC应用于菌落计数，认为该法较平板倾注法易观察计数，对菌落总数没有影响[1～3]。国内报道多见于食品、水等卫生微生物学方面的应用[4，5]，为了解TTC法菌落计数是否适用于尿液标本，对普通琼脂平板倾注法和TTC法进行模拟和临床尿液菌落计数并比较，结果报告如下。
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1 实验方法
1.1 材料来源与制备
1.1.1 试剂和培养基的来源与制备：①普通营养琼脂培养基：卫生部上海生物制品研究所，批号981120，按照说明书配制并高压灭菌，部分分装15ml每管。②氯化三苯四氮唑(TTC)：上海试剂三厂，AR，批号980619，用无菌生理盐水配制1.000mg/ml、0.500mg/ml、0.250mg/ml、0.100mg/ml的TTC溶液[2，4，5]，备用。
1.1.2 标准菌株及模拟尿液：① 大肠埃希菌：中国药品生物制品检定所，44113(ATCC25922)。② 金黄色葡萄球菌：中国药品生物制品检定所，26112(ATCC25923)。③模拟尿液：取尿液置沸水浴30分钟，无菌分装。
1.1.3 菌悬液的制备： 标准菌株用普通营养肉汤增菌4小时后，配制成1/2麦氏浊度，用无菌生理盐水做100倍稀释后，用模拟尿液做10倍倍比稀释，取稀释度为104、105、106、107的菌液做菌落计数。
, 百拇医药
1.1.4 临床尿液：无菌收集急性尿路感染病人，导尿管插管病人及正常人尿液。
1.2 实验步骤
1.2.1 平板法：按照《临床微生物学及检验》的方法进行[6]。
1.2.2 TTC法：在上述方法的基础上，参照王素英等[2，4，5]加入不同浓度的TTC溶液1.0ml，使最终浓度为10.0、5.0、2.5、1.0μg/ml。
1.2.3 无菌操作。分别用无菌吸管取模拟尿液稀释的标准菌液1ml注入无菌空平皿中，每一菌株取一个稀释度(相当于细菌含量为102 cfu/ml)。用普通琼脂和不同浓度的TTC琼脂分别倾注，每一浓度10个平皿。37℃培养24小时观察结果，取菌落数在30～300之间的平板进行计数和统计处理，选择合适的TTC浓度。
, 百拇医药
1.2.4 无菌操作。分别用无菌吸管取模拟尿液稀释的标准菌液1ml注入无菌空平皿中，每一菌株取四个稀释度(相当于细菌含量为103 、102 、101 、100 cfu/ml)。用普通琼脂和TTC琼脂分别倾注，每稀释度各9个平皿。37℃培养24小时观察结果。
1.2.5 无菌操作。分别用无菌生理盐水将临床尿液作10倍倍比稀释，取稀释度为103、104、105的尿液行平板倾注法和TTC法菌落计数，每个稀释度各九个平皿，37℃培养24小时观察结果，取菌落数30～300之间进行计数和统计处理。
1.3 统计学方法处理 t检验。
2 结果
2.1 TTC用于菌落计数的合适含量 TTC用于菌落计数的用量各家报道不一，我们按照文献报道的含量[2,4,5]设置了四个浓度和一个空白对照，每一浓度做10个平行平皿，每100ml培养基中TTC的含量及菌落计数结果见表1。
, 百拇医药
从表 1 结果看出，在模拟尿液中加入TTC的合适含量为2.5μg/ml。经统计处理，在此含量时大肠埃希菌(44113)和金黄色葡萄球菌(26112)的计数结果与平板倾注法结果差异无显著性(P>0.05)。
表1 TTC 用于菌落计数的合适用量(37℃24小时)(
±s) 单位：cfu/ml
n
TTC (μg/ml)
10.0
5.0
2.5
1.0
, http://www.100md.com 0(平板倾注法)
E.coli(44113)
10
101±2.45
173.8±2.57
209.1±3.56
219.8±3.10
211.2±2.09
S.aures(26112)
10
96.9±2.75
169 ±3.12
, http://www.100md.com
188±4.30
194.7±3.83
191.4±2.89
注：TTC浓度为1.0 μg/ml，菌落出现浅色或无色2.2 两种方法对模拟尿液的菌落计数结果 见表2。从表2结果可以看出，TTC含量在2.5μg/ml时，对模拟尿液的菌落计数结果与平板倾注法比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 两种方法对临床尿液的菌落计数结果 见表3。从表3可以看出，TTC含量在2.5μg/ml时，对尿液的菌落计数与平板倾注法计数结果比较差异无显著性(P>0.05)。
表2 模拟尿液平板倾注法和TTC法菌落计数结果(37℃24小时)(±s) 单位：cfu/ml 稀释度
, 百拇医药
n
平板倾注法
TTC法
104
105
106
107
104
105
106
107
, http://www.100md.com
E.coli(44113)
9
>300
226±2.92
25
2
>300
223.9±3.22
23
1
S.aures(26112)
9
>300
, http://www.100md.com
>300
182±2.90
16
>300
>300
180±4.06
14
表3 临床尿液平板倾注法和TTC法菌落计数结果(37℃24小时)
(±s) 单位：103cfu/ml
n
, 百拇医药 平板倾注法
TTC法
急性尿路感染病人
9
140±3.12
142±2.95
导尿管插管病人
9
<3
<3
正常人
9
<3
, 百拇医药
<3
3 讨论
临床对尿液的菌落计数多采用直接倾注或定量接种。用普通琼脂倾注法因为形成的菌落细小无色或乳白色，琼脂深层细小菌落极易遗漏，不利于标本结果的观察，对于细菌含量高的标本检出率较高，而对于在判断临界值附近的标本和监测治疗后的尿液则可能出现漏诊。在普通琼脂中加入TTC，可使菌落呈现紫红色或浅红色，易于鉴别计数。
根据实验结果，我们认为TTC可以用于尿液菌落计数，较合适的含量为2.5μg/ml。虽然此含量可引起平板表面的部分菌落呈浅红色，但不影响计数。低于此含量，在琼脂内的菌落可呈浅红色和无色，不利于临床日常工作的菌落计数。该浓度与文献报道[4,5]相比较低，可能与尿液中所含成分有关，需进一步探讨。
作者简介：楼永良(1965-)，男，浙江诸暨人，主要从事临床微生物学检验。
, 百拇医药
参考文献
[1] 李桂生，崔淑珍，王锡连，等.细菌总数测定方法的改进[J].微生物学通报,1979，6(6):22-25.
[2] 王素英.细菌平板菌落计数的改进方法[J].生物学通报,1993，28(2):41.
[3] 郭炳才.应用TTC菌落计数总数的探讨[J].中国公共卫生,1989,4(5):30.
[4] 张淑兰,韩秀媛,路金爽，等.游泳池水微生物标准检验方法的研究[J].中国卫生检验杂志,1999，2:83-87.
[5] 于国芹,王克利,肖红，等.关于TTC法用于食品菌落计数适用性的研究与探讨[J].中国卫生检验杂志,1999，2:133-135.
[6] 李影林.临床微生物学及检验[M].北京:人民出版社,1995.
收稿日期：2000-02-14
修回日期：2000-04-24, http://www.100md.com
单位：楼永良 杜季梅(温州医学院 检验医学系，浙江 温州 325027)；郑美琴(温州医学院附属第二医院 检验科，浙江 温州 325027)
关键词：尿液；氯化三苯四氮唑；菌落计数
温州医学院学报000240 [摘 要] 目的:了解氯化三苯四氮唑(TTC)能否用于尿液菌落计数。 方法:对模拟尿液和临床尿液分别行平板倾注法和TTC法，对测得数据进行分析处理。 结果:两种方法对模拟尿液和临床尿液的菌落计数结果差异无显著性(P>0.05)。结论:TTC可用于尿液菌落计数，且易于鉴别计数。
[中图分类号] R466.12 [文献标识码] B [文章编号] 1000-2138(2000)02-0166-02
尿液培养和菌落计数对尿路感染的诊断具有重要意义。一般临床尿液菌落计数采用平板倾注法或定量接种法。有人利用多数细菌生长时能还原无色的氯化三苯四氮唑(TTC)为红色的三苯甲形成红色菌落的特性，将TTC应用于菌落计数，认为该法较平板倾注法易观察计数，对菌落总数没有影响[1～3]。国内报道多见于食品、水等卫生微生物学方面的应用[4，5]，为了解TTC法菌落计数是否适用于尿液标本，对普通琼脂平板倾注法和TTC法进行模拟和临床尿液菌落计数并比较，结果报告如下。
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1 实验方法
1.1 材料来源与制备
1.1.1 试剂和培养基的来源与制备：①普通营养琼脂培养基：卫生部上海生物制品研究所，批号981120，按照说明书配制并高压灭菌，部分分装15ml每管。②氯化三苯四氮唑(TTC)：上海试剂三厂，AR，批号980619，用无菌生理盐水配制1.000mg/ml、0.500mg/ml、0.250mg/ml、0.100mg/ml的TTC溶液[2，4，5]，备用。
1.1.2 标准菌株及模拟尿液：① 大肠埃希菌：中国药品生物制品检定所，44113(ATCC25922)。② 金黄色葡萄球菌：中国药品生物制品检定所，26112(ATCC25923)。③模拟尿液：取尿液置沸水浴30分钟，无菌分装。
1.1.3 菌悬液的制备： 标准菌株用普通营养肉汤增菌4小时后，配制成1/2麦氏浊度，用无菌生理盐水做100倍稀释后，用模拟尿液做10倍倍比稀释，取稀释度为104、105、106、107的菌液做菌落计数。
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1.1.4 临床尿液：无菌收集急性尿路感染病人，导尿管插管病人及正常人尿液。
1.2 实验步骤
1.2.1 平板法：按照《临床微生物学及检验》的方法进行[6]。
1.2.2 TTC法：在上述方法的基础上，参照王素英等[2，4，5]加入不同浓度的TTC溶液1.0ml，使最终浓度为10.0、5.0、2.5、1.0μg/ml。
1.2.3 无菌操作。分别用无菌吸管取模拟尿液稀释的标准菌液1ml注入无菌空平皿中，每一菌株取一个稀释度(相当于细菌含量为102 cfu/ml)。用普通琼脂和不同浓度的TTC琼脂分别倾注，每一浓度10个平皿。37℃培养24小时观察结果，取菌落数在30～300之间的平板进行计数和统计处理，选择合适的TTC浓度。
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1.2.4 无菌操作。分别用无菌吸管取模拟尿液稀释的标准菌液1ml注入无菌空平皿中，每一菌株取四个稀释度(相当于细菌含量为103 、102 、101 、100 cfu/ml)。用普通琼脂和TTC琼脂分别倾注，每稀释度各9个平皿。37℃培养24小时观察结果。
1.2.5 无菌操作。分别用无菌生理盐水将临床尿液作10倍倍比稀释，取稀释度为103、104、105的尿液行平板倾注法和TTC法菌落计数，每个稀释度各九个平皿，37℃培养24小时观察结果，取菌落数30～300之间进行计数和统计处理。
1.3 统计学方法处理 t检验。
2 结果
2.1 TTC用于菌落计数的合适含量 TTC用于菌落计数的用量各家报道不一，我们按照文献报道的含量[2,4,5]设置了四个浓度和一个空白对照，每一浓度做10个平行平皿，每100ml培养基中TTC的含量及菌落计数结果见表1。
, 百拇医药
从表 1 结果看出，在模拟尿液中加入TTC的合适含量为2.5μg/ml。经统计处理，在此含量时大肠埃希菌(44113)和金黄色葡萄球菌(26112)的计数结果与平板倾注法结果差异无显著性(P>0.05)。
表1 TTC 用于菌落计数的合适用量(37℃24小时)(
±s) 单位：cfu/mln
TTC (μg/ml)
10.0
5.0
2.5
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E.coli(44113)
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101±2.45
173.8±2.57
209.1±3.56
219.8±3.10
211.2±2.09
S.aures(26112)
10
96.9±2.75
169 ±3.12
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188±4.30
194.7±3.83
191.4±2.89
注：TTC浓度为1.0 μg/ml，菌落出现浅色或无色2.2 两种方法对模拟尿液的菌落计数结果 见表2。从表2结果可以看出，TTC含量在2.5μg/ml时，对模拟尿液的菌落计数结果与平板倾注法比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 两种方法对临床尿液的菌落计数结果 见表3。从表3可以看出，TTC含量在2.5μg/ml时，对尿液的菌落计数与平板倾注法计数结果比较差异无显著性(P>0.05)。
表2 模拟尿液平板倾注法和TTC法菌落计数结果(37℃24小时)(
±s) 单位：cfu/ml 稀释度, 百拇医药
n
平板倾注法
TTC法
104
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106
107
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E.coli(44113)
9
>300
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S.aures(26112)
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表3 临床尿液平板倾注法和TTC法菌落计数结果(37℃24小时)
(
±s) 单位：103cfu/mln
, 百拇医药 平板倾注法
TTC法
急性尿路感染病人
9
140±3.12
142±2.95
导尿管插管病人
9
<3
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正常人
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3 讨论
临床对尿液的菌落计数多采用直接倾注或定量接种。用普通琼脂倾注法因为形成的菌落细小无色或乳白色，琼脂深层细小菌落极易遗漏，不利于标本结果的观察，对于细菌含量高的标本检出率较高，而对于在判断临界值附近的标本和监测治疗后的尿液则可能出现漏诊。在普通琼脂中加入TTC，可使菌落呈现紫红色或浅红色，易于鉴别计数。
根据实验结果，我们认为TTC可以用于尿液菌落计数，较合适的含量为2.5μg/ml。虽然此含量可引起平板表面的部分菌落呈浅红色，但不影响计数。低于此含量，在琼脂内的菌落可呈浅红色和无色，不利于临床日常工作的菌落计数。该浓度与文献报道[4,5]相比较低，可能与尿液中所含成分有关，需进一步探讨。
作者简介：楼永良(1965-)，男，浙江诸暨人，主要从事临床微生物学检验。
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参考文献
[1] 李桂生，崔淑珍，王锡连，等.细菌总数测定方法的改进[J].微生物学通报,1979，6(6):22-25.
[2] 王素英.细菌平板菌落计数的改进方法[J].生物学通报,1993，28(2):41.
[3] 郭炳才.应用TTC菌落计数总数的探讨[J].中国公共卫生,1989,4(5):30.
[4] 张淑兰,韩秀媛,路金爽，等.游泳池水微生物标准检验方法的研究[J].中国卫生检验杂志,1999，2:83-87.
[5] 于国芹,王克利,肖红，等.关于TTC法用于食品菌落计数适用性的研究与探讨[J].中国卫生检验杂志,1999，2:133-135.
[6] 李影林.临床微生物学及检验[M].北京:人民出版社,1995.
收稿日期：2000-02-14
修回日期：2000-04-24, http://www.100md.com