甘草酸、熊果苷及氢醌对小鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究
作者：雷铁池 朱文元 夏明玉 张美华 范卫新
单位：雷铁池 朱文元 张美华 范卫新(南京医科大学第一附属医院皮肤科，210029)；夏明玉(南京医科大学基础医学院电镜室)
关键词：甘草酸熊果苷氢醌酪氨酸酶；抑制剂
临床皮肤科杂志000202
摘要 比较观察了18α-甘草酸双胺盐、熊果苷及氢醌对体外 培养B16F10鼠黑素瘤细胞细胞形态、酪氨酸酶活性、黑素含量 和细胞增殖率的影响，结果发现3种化合物均显示有抑制黑素 生成的作用，其中以50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和黑素含 量抑制作用最为明显，其次是100μmol/L18α-甘草酸双胺盐， 但二者并无统计学上的差异(P>0.05)。氢醌对酪氨酸酶活性的影 响呈双向作用，即低浓度(0.1～0.5μmol/L)时下调酶活性，高浓 度(1～10μmol/L)时则能轻度上调。细胞增殖率测定结果显示18α -甘草酸双胺盐、熊果苷在实验浓度(10～5000μmol/L)对细胞增 殖率无明显抑制，而氢醌浓度超过5μmol/L时能明显抑制细胞增 殖或呈现细胞毒性。细胞形态观察发现1～10μmol/L氢醌作用24 h，细胞胞体变小，树状突明显增多且变得细长，部分树状突 呈串珠状改变。提示18α-甘草酸双胺盐、熊果苷的皮肤脱色 作用机制与氢醌可能不同，后者低浓度时以抑制酪酸酶活性为 主，高浓度时主要是细胞毒，且细胞早期的损伤部位可能发 生在树状突。18α-甘草酸双胺盐能否成为一种无细胞毒酪氨 酸酶抑制型皮肤脱色剂有待进一步临床加以验证。
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Comparative studies on regulation of melanogenesis in the responese of murine melanoma cells to ammonium glycyrrhizinate, arbutin and hydroquinone
Lei Tiechi, Zhu Wenyuan, Xia Minyu, Zhang Meihua, Fan Weixin
(Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 210029)
Abstract Ammonium glycyrrhizinate(18α - GL),arbutin and hydroquinone were investigated in vitro for the action on tyrosinase activity, melanin content, and cell proliferation in cultured B16F10 murine melanoma cells.The results showed that all of them exhibited an inhibitory effect on tyrosinase activity and melanin production, more marked effect showed by 50μ mol/L arbutin, and the 100μ mol/L 18α - GL, but with no statistical significance between them(P >0.05).Hydroquinone had biphasic effect on tyrosinase activity, at low concentration(0.1～ 0.5μ mol/L) it showed inhibitory effect, and at high concentration(1～ 10μ mol/L) it showed slight up regulation. Detecmination of cell proliferation rate showed that 18α - GL and arbutin had no marked inhibitory effect on cell proliferation rate at concentretion(10～ 5000μ mol/L),but bydroquinone could markedly inhibit cell prolhiferation rate or showed cytotoxicity when the concentration over 5μ mol/L. Hydroquinone caused a marked change in cellular morphology, the cell body became small, with many elongate and thin cell processes, some of them were rosary- like. This effect was observed clearly at final concentration between 1 and 10μ mol/L after treating for 24 hours. We concluded that the possible mechanisms of hydroquinone bleaching hyperpigmented skin were through its inhibition of tyrosinase activity at lower concentration and its cytotoxicity at higher one.
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Key words Ammonium glycyrrhizinate Arbutin Hydroquinone Tyrosinase Inhibitor
早期研究我们发现甘草等中药的乙醇提取物对蘑菇酪氨酸 酶(mushroomtyrosinase)活性的有明显抑制作用[1]。本研究用体外培 养的B16F10鼠黑素瘤细胞作模型进一步观察甘草活性成分18α- 甘草酸双胺盐、熊果苷及氢醌对B16F10细胞的形态、酪氨酸酶 活性、黑素含量以及细胞增殖率的影响，旨在比较研究这3种 化合物的皮肤脱色作用机制，为18α-甘草酸双胺盐作为一种无细胞毒酪氨酸酶抑制型皮肤脱色剂应用临床提供实 验室依据。
图11μmol/L氢醌作用24h即能发现细胞胞体变小，树状
突明显增多且变得细长(×200)
, 百拇医药
1材料和方法
1.1试剂和材料：Eagle'sMEM培养基(Sigma)，新生小牛血清(NCS)( 南京医科大学寄生虫分子生物学研究室提供)，HEPES(Farco)，左 旋谷氨酰胺，左旋多巴(L-dopa)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶( 均为Sigma产品)，脱氧胆酸钠，噻唑兰(MTT)(Serva产品)，18α-甘 草酸双胺盐(江苏正大天晴制药总厂提供)，氢醌(宜兴市第二化 学试剂厂)，熊果苷(上海奥利精细化工厂提供)。分光光度计( 上海第三分析仪器厂)，DG3022酶联免疫检测仪(第四军医大学、 华东电子管厂联合研制)。
1.2B16F10细胞培养：参照我们以前报道的方法[2]。B16F10鼠黑 素瘤细胞株由日本神户大学医学院皮肤科HideyaAndo博士惠赠。 待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶和EDTA0.02%消化 ，用含有10%NCS，10mmol/LHEPES和2mmol/L左旋谷氨酰胺的Eagle'sMEM 培养液传代，置CO2孵箱37℃，5%CO2，饱和湿度环境常规进行培 养，每一次实验均取自同一传代细胞，根据实验设计要求和 培养瓶规格选定细胞初始接种浓度为5000个/cm2左右。细胞接种 24小时后，用添加药物的新鲜培养基换液1次。继续孵育72小时 后收获细胞，用台盼兰排斥法计数活细胞数，随后将细胞分为 两份分别用于酪氨酸酶活性和黑素含量测定。
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1.3试剂配制与实验分组：氢醌贮液用生理盐水新鲜配制。1 8α-甘草酸双胺盐、熊果苷贮液用DMSO新鲜配制，避光保存在 -20℃冰箱两周内使用。临床用时用新鲜培养基调至终浓度。 18α-甘草酸双胺盐和熊果苷的实验终浓度分别设定为10、50、 100、500、1000μmol/L，氢醌终浓度设定为0.1、0.5、1、5、10μmol /L。空白对照组仅加入测试药物所用相应溶媒(DMSO)或生理盐水 )。
1.4酪氨酸酶活性和黑素含量测定：参照我们以前报道的方 法[2]。
1.5MTT法测定细胞增殖率[3]：取指数生长期的B16F10细胞，经 消化分散制备单细胞悬液，调整细胞浓度，将细胞接种至24孔 Corning细胞培养板，初始细胞接种浓度为2000个/孔，液体量2mL/ 孔。孵育6～12小时待细胞贴壁后，吸去培养液，用含有不同浓 度处理因素(0.1、0.5、1、5、10、50μmol/L氢醌5种浓度；10、50、 100、500、1000μmol/L，18α-甘草酸双胺盐和熊果苷5种浓度)的 新鲜培养基换液1次，继续培养3天。临测细胞增殖率时，向每 孔加入0.5%MTT贮液20μL(每孔MTT约0.1mg)。置CO2孵箱继续培养4小 时。此时MTT经线粒体膜琥珀酸脱氢酶转化为甲替(formazan)，镜 下可见细胞内外有大量紫红色针状结晶。小心吸取培养液，每 孔加入200μLDMSO充分振摇培养板，使甲替结晶完全溶解。立 即置酶标仪于570nm测光吸收值A570，每一实验重复3次，用下列 公式计算各组细胞增殖率。%细胞增殖率=实验组A570/对照组A5 70×100
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1.6数据处理：所测实验数据采用配对计量资料t或t'检验。 统计过程使用SPSS统计软件完成。
2结果
2.13种化合物对B16F10细胞形态的影响：传代培养的B16F10细胞 主要为两极，偶见三极的贴壁生长上皮型细胞。1μmol/L氢醌作 用24h即能发现细胞胞体变小，树状突明显增多且变得细长， 部分树状突呈串株状改变(图1)，5或10μmol/L时作用最为明显， 18α-甘草酸双胺盐和熊果苷与空白对照组相比细胞形态无特 殊变化。
2.23种化合物对B16F10细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响： 结果见表1。3种化合物均显示有抑制黑素生成的作用，其中以 50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和黑素含量抑制作用最为明显 ，其次是100μmol/L18α-甘草酶双胺盐，但二者并无统计学上 的差异(P>0.05)。氢醌对B16F10细胞的黑素生成呈双向调节，低浓 度(0.1～0.5μmol/L)能下调酪氨酸酶活性和黑素含量，高浓度(1 ～10μmol/L)则能轻度上调酪氨酸酶活性并呈现明显细胞毒性。
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2.3不同浓度18α-甘草酸双胺盐、熊果苷和氢醌对细胞增殖 率影响：用MTT比色法测6种不同浓度18α-甘草酸双胺盐、熊 果苷和氢醌分别对体外培养B16F10细胞增殖率的影响，结果见表 2。10～5000μmol/L18α-甘草酸双胺盐对细胞增殖率无明显抑 制作用，而熊果苷浓度超过1000μmol/L、氢醌浓度超过5μmol/L则 呈现明显的细胞增殖抑制。
表1 3种化合物对B16F10细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响(χ±s，%) 处理因素
实验浓度*(μmol/L)
10(0.1)
50(0.5)
100(1)
500(5)
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1000(10)
18α甘草酸双胺盐
酪氨酸酶活性
74.17±25.32
73.10±20.38
65.24±12.66**
74.45±16.69
126.59±21.02
黑素含量
25.64±6.16
27.29±7.42
, http://www.100md.com 56.37±10.86**
58.76±10.21
163.72±27.12
熊果苷
酪氨酸酶活性
76.08±30.79
48.15±7.93
91.59±33.58
118.72±39.67
115.36±36.95
黑素含量
44.92±19.98
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46.27±10.12
56.67±14.34
56.56±4.86
68.80±10.84
氢醌
酪氨酸酶活性
77.14±9.88
74.79±23.84
138.99±21.64
205.77±10.57
116.08±65.42
, 百拇医药 黑素含量
74.35±6.43
27.45±3.61
52.89±12.73
ND
ND
注： 酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分率表示；* 括号内浓度为氢醌实验浓度；ND：未测出； ** 与50μmol/L，熊果苷组相比，P >0.05
表2 不同浓度18α-甘草酸双胺盐、氢醌和熊果苷对B16F10鼠黑素瘤细胞增殖率影响(χ±s，%) 处理因素
实验浓度*(μmol/L)
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10(0.1)
50(0.5)
100(1)
500(5)
1000(10)
5000(50)
18α甘草酸双胺盐
117.45±6.65
98.75±4.5
98.26±1.29
87.93±0.77
142.50±5.40
, 百拇医药
100.59±5.5
熊果苷
110.88±6.08
105.11±4.99
110.45±6.25
118.99±6.47
86.92±5.12
59.61±10.01
氢醌
117.04±6.36
121.42±8.54
115.49±9.17
, 百拇医药
82.10±3.40
78.55±3.48
36.78±0.54
注： 细胞存活率以处理组占对照组A值的百分率表示；每一实验重复4次； * 括号内浓度为氢醌实验浓度 3讨论
人们最早认识的皮肤脱色剂是分子结构与酪氨酸酶底物酪 氨酸类似的单酚类化合物氢醌[4]。但氢醌及其它酚类化合物的 外用制剂化学性质不稳定易氧化变色，且有引起皮肤永久性 白斑的报告[5]，限制了这类药物的临床应用和开发。1988年日 本学者Akiu等从杜鹃花科植物熊果(Arctoataphylosuva-ursi)的叶中 分离到一种具有脱色作用的单体化合物熊果苷(arbutin)[6～8]， 自此从药用植物中分离天然黑素生成调节剂再度引起人们的关 注。早期研究我们发现甘草等中药的乙醇提取物对蘑菇酪氨 酸酶活性有明显抑制作用[1]。本研究用体外培养的B16F10鼠黑素 瘤细胞作模型进一步观察了甘草活性成分18α-甘草酸双胺盐 、熊果苷及氢醌对B16F10细胞的形态、酪氨酸酶活性、黑素含 量以及细胞增殖率的影响，从表1可看出3种化合物均显示有抑 制黑素生成的作用，其中以50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和 黑素含量抑制作用最为明显，其次是100μmol/L18α-甘草酸双 胺盐，但二者并无统计学上的差异(P>0.05)。氢醌对B16F10细胞的 黑素生成呈双向调节，低浓度能下调酪氨酸酶活性和黑素含 量，高浓度则能轻度上调酪氨酸酶活性并呈现明显细胞毒性。
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尽管氢醌作为一种皮肤脱色剂在临床使用已久[5]，但其确 切的脱色机制至今仍不清楚。一种观点认为氢醌作为酪氨酸酶 的底物较酪氨酸本身更为合适，其脱色机制可能与竞争抑制 酪氨酸酶活性有关；另一观点认为氢醌脱色实质上是一酪氨酸 酶介导的细胞毒作用(tyrosinase-mediatedcytotoxity)。氢醌分子易 扩散进入黑素细胞的黑素小体，阻断黑素生成途径的一个或多 个步骤，同时氢醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半 醌基(semiquinoneradicals)物质，后者使细胞膜脂质发生过氧化， 破坏细胞膜性结构，最终导致细胞死亡[4,5]。我们的研究结果 显示不同浓度的氢醌其脱色作用的机制可能不同，低浓度时以 抑制酪氨酸酶活性为主，高浓度时主要是细胞毒，且早期细 胞损伤部位可能发生在树状突。
近来日本学者也注意到中药甘草的皮肤脱色作用。YokotaT 等报道甘草的水溶成分Glabridin有抑制B16F10细胞黑素生成和抗炎 作用[9]。18α-甘草酸双胺盐能否成为一种无细胞毒酪氨酸酶 抑制型皮肤脱色剂有待进一步临床加以验证。
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国家自然科学基金资助项目(基金编号39570658、39870701)
参考文献
1，雷铁池，朱文元，夏明玉，等.中药对黑素生物合成影响研究.中草药，1999，30(5)：336～339
2，雷铁池，朱文元，夏明玉，等.8-甲氧补骨脂素对小鼠黑 素瘤细胞黑素生成的调节及相关信号转导研究.中华皮肤科杂 志，1999，32(2)：115～118
3， Alley MC, Scudiero DA, Monks A, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cells lines a microculture tetrazolium assay. Cancer Res, 1988,48(1):589～ 601
, 百拇医药
4，Maeda K, Fukuda M. In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J Soc Cosmet Chem, 1991,42(2):361～ 368
5，Grimes PE. Melasma(etiologic and therapeutic considerations). Arch Dermatol, 1995,131(12):1453～ 1457
6，Nakajima M, Shinoda I, Fukuwatari T, et al. Arbutin increases the pigmentation of cultured human melanocytes through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity. Pigment Cell Res, 1998,11(1)12～ 17
, 百拇医药
7，Chakraborty A, Funasaka Y, Komoto M, et al. Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocyted. Pigment Cell Res, 1998,11(4):206～ 212
8，Maeda K, Fukuda M. Arbutin: mechanism of its depigmenting action in human melanocyte culture. J Pharmaceutical Exp Therapeut, 1996,276(2):765～ 769
9，Yokota T, Nishio H, Kubota T, et al. The inhibitory effect of glabridin from licorice extracts on melanogenesis and inflammation. Pigment Cell Res, 1998,11(6):355～ 361
(收稿：1999-06-18), http://www.100md.com
单位：雷铁池 朱文元 张美华 范卫新(南京医科大学第一附属医院皮肤科，210029)；夏明玉(南京医科大学基础医学院电镜室)
关键词：甘草酸熊果苷氢醌酪氨酸酶；抑制剂
临床皮肤科杂志000202
摘要 比较观察了18α-甘草酸双胺盐、熊果苷及氢醌对体外 培养B16F10鼠黑素瘤细胞细胞形态、酪氨酸酶活性、黑素含量 和细胞增殖率的影响，结果发现3种化合物均显示有抑制黑素 生成的作用，其中以50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和黑素含 量抑制作用最为明显，其次是100μmol/L18α-甘草酸双胺盐， 但二者并无统计学上的差异(P>0.05)。氢醌对酪氨酸酶活性的影 响呈双向作用，即低浓度(0.1～0.5μmol/L)时下调酶活性，高浓 度(1～10μmol/L)时则能轻度上调。细胞增殖率测定结果显示18α -甘草酸双胺盐、熊果苷在实验浓度(10～5000μmol/L)对细胞增 殖率无明显抑制，而氢醌浓度超过5μmol/L时能明显抑制细胞增 殖或呈现细胞毒性。细胞形态观察发现1～10μmol/L氢醌作用24 h，细胞胞体变小，树状突明显增多且变得细长，部分树状突 呈串珠状改变。提示18α-甘草酸双胺盐、熊果苷的皮肤脱色 作用机制与氢醌可能不同，后者低浓度时以抑制酪酸酶活性为 主，高浓度时主要是细胞毒，且细胞早期的损伤部位可能发 生在树状突。18α-甘草酸双胺盐能否成为一种无细胞毒酪氨 酸酶抑制型皮肤脱色剂有待进一步临床加以验证。
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Comparative studies on regulation of melanogenesis in the responese of murine melanoma cells to ammonium glycyrrhizinate, arbutin and hydroquinone
Lei Tiechi, Zhu Wenyuan, Xia Minyu, Zhang Meihua, Fan Weixin
(Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 210029)
Abstract Ammonium glycyrrhizinate(18α - GL),arbutin and hydroquinone were investigated in vitro for the action on tyrosinase activity, melanin content, and cell proliferation in cultured B16F10 murine melanoma cells.The results showed that all of them exhibited an inhibitory effect on tyrosinase activity and melanin production, more marked effect showed by 50μ mol/L arbutin, and the 100μ mol/L 18α - GL, but with no statistical significance between them(P >0.05).Hydroquinone had biphasic effect on tyrosinase activity, at low concentration(0.1～ 0.5μ mol/L) it showed inhibitory effect, and at high concentration(1～ 10μ mol/L) it showed slight up regulation. Detecmination of cell proliferation rate showed that 18α - GL and arbutin had no marked inhibitory effect on cell proliferation rate at concentretion(10～ 5000μ mol/L),but bydroquinone could markedly inhibit cell prolhiferation rate or showed cytotoxicity when the concentration over 5μ mol/L. Hydroquinone caused a marked change in cellular morphology, the cell body became small, with many elongate and thin cell processes, some of them were rosary- like. This effect was observed clearly at final concentration between 1 and 10μ mol/L after treating for 24 hours. We concluded that the possible mechanisms of hydroquinone bleaching hyperpigmented skin were through its inhibition of tyrosinase activity at lower concentration and its cytotoxicity at higher one.
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Key words Ammonium glycyrrhizinate Arbutin Hydroquinone Tyrosinase Inhibitor
早期研究我们发现甘草等中药的乙醇提取物对蘑菇酪氨酸 酶(mushroomtyrosinase)活性的有明显抑制作用[1]。本研究用体外培 养的B16F10鼠黑素瘤细胞作模型进一步观察甘草活性成分18α- 甘草酸双胺盐、熊果苷及氢醌对B16F10细胞的形态、酪氨酸酶 活性、黑素含量以及细胞增殖率的影响，旨在比较研究这3种 化合物的皮肤脱色作用机制，为18α-甘草酸双胺盐作为一种无细胞毒酪氨酸酶抑制型皮肤脱色剂应用临床提供实 验室依据。
图11μmol/L氢醌作用24h即能发现细胞胞体变小，树状
突明显增多且变得细长(×200)
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1材料和方法
1.1试剂和材料：Eagle'sMEM培养基(Sigma)，新生小牛血清(NCS)( 南京医科大学寄生虫分子生物学研究室提供)，HEPES(Farco)，左 旋谷氨酰胺，左旋多巴(L-dopa)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶( 均为Sigma产品)，脱氧胆酸钠，噻唑兰(MTT)(Serva产品)，18α-甘 草酸双胺盐(江苏正大天晴制药总厂提供)，氢醌(宜兴市第二化 学试剂厂)，熊果苷(上海奥利精细化工厂提供)。分光光度计( 上海第三分析仪器厂)，DG3022酶联免疫检测仪(第四军医大学、 华东电子管厂联合研制)。
1.2B16F10细胞培养：参照我们以前报道的方法[2]。B16F10鼠黑 素瘤细胞株由日本神户大学医学院皮肤科HideyaAndo博士惠赠。 待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶和EDTA0.02%消化 ，用含有10%NCS，10mmol/LHEPES和2mmol/L左旋谷氨酰胺的Eagle'sMEM 培养液传代，置CO2孵箱37℃，5%CO2，饱和湿度环境常规进行培 养，每一次实验均取自同一传代细胞，根据实验设计要求和 培养瓶规格选定细胞初始接种浓度为5000个/cm2左右。细胞接种 24小时后，用添加药物的新鲜培养基换液1次。继续孵育72小时 后收获细胞，用台盼兰排斥法计数活细胞数，随后将细胞分为 两份分别用于酪氨酸酶活性和黑素含量测定。
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1.3试剂配制与实验分组：氢醌贮液用生理盐水新鲜配制。1 8α-甘草酸双胺盐、熊果苷贮液用DMSO新鲜配制，避光保存在 -20℃冰箱两周内使用。临床用时用新鲜培养基调至终浓度。 18α-甘草酸双胺盐和熊果苷的实验终浓度分别设定为10、50、 100、500、1000μmol/L，氢醌终浓度设定为0.1、0.5、1、5、10μmol /L。空白对照组仅加入测试药物所用相应溶媒(DMSO)或生理盐水 )。
1.4酪氨酸酶活性和黑素含量测定：参照我们以前报道的方 法[2]。
1.5MTT法测定细胞增殖率[3]：取指数生长期的B16F10细胞，经 消化分散制备单细胞悬液，调整细胞浓度，将细胞接种至24孔 Corning细胞培养板，初始细胞接种浓度为2000个/孔，液体量2mL/ 孔。孵育6～12小时待细胞贴壁后，吸去培养液，用含有不同浓 度处理因素(0.1、0.5、1、5、10、50μmol/L氢醌5种浓度；10、50、 100、500、1000μmol/L，18α-甘草酸双胺盐和熊果苷5种浓度)的 新鲜培养基换液1次，继续培养3天。临测细胞增殖率时，向每 孔加入0.5%MTT贮液20μL(每孔MTT约0.1mg)。置CO2孵箱继续培养4小 时。此时MTT经线粒体膜琥珀酸脱氢酶转化为甲替(formazan)，镜 下可见细胞内外有大量紫红色针状结晶。小心吸取培养液，每 孔加入200μLDMSO充分振摇培养板，使甲替结晶完全溶解。立 即置酶标仪于570nm测光吸收值A570，每一实验重复3次，用下列 公式计算各组细胞增殖率。%细胞增殖率=实验组A570/对照组A5 70×100
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1.6数据处理：所测实验数据采用配对计量资料t或t'检验。 统计过程使用SPSS统计软件完成。
2结果
2.13种化合物对B16F10细胞形态的影响：传代培养的B16F10细胞 主要为两极，偶见三极的贴壁生长上皮型细胞。1μmol/L氢醌作 用24h即能发现细胞胞体变小，树状突明显增多且变得细长， 部分树状突呈串株状改变(图1)，5或10μmol/L时作用最为明显， 18α-甘草酸双胺盐和熊果苷与空白对照组相比细胞形态无特 殊变化。
2.23种化合物对B16F10细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响： 结果见表1。3种化合物均显示有抑制黑素生成的作用，其中以 50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和黑素含量抑制作用最为明显 ，其次是100μmol/L18α-甘草酶双胺盐，但二者并无统计学上 的差异(P>0.05)。氢醌对B16F10细胞的黑素生成呈双向调节，低浓 度(0.1～0.5μmol/L)能下调酪氨酸酶活性和黑素含量，高浓度(1 ～10μmol/L)则能轻度上调酪氨酸酶活性并呈现明显细胞毒性。
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2.3不同浓度18α-甘草酸双胺盐、熊果苷和氢醌对细胞增殖 率影响：用MTT比色法测6种不同浓度18α-甘草酸双胺盐、熊 果苷和氢醌分别对体外培养B16F10细胞增殖率的影响，结果见表 2。10～5000μmol/L18α-甘草酸双胺盐对细胞增殖率无明显抑 制作用，而熊果苷浓度超过1000μmol/L、氢醌浓度超过5μmol/L则 呈现明显的细胞增殖抑制。
表1 3种化合物对B16F10细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响(χ±s，%) 处理因素
实验浓度*(μmol/L)
10(0.1)
50(0.5)
100(1)
500(5)
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1000(10)
18α甘草酸双胺盐
酪氨酸酶活性
74.17±25.32
73.10±20.38
65.24±12.66**
74.45±16.69
126.59±21.02
黑素含量
25.64±6.16
27.29±7.42
, http://www.100md.com 56.37±10.86**
58.76±10.21
163.72±27.12
熊果苷
酪氨酸酶活性
76.08±30.79
48.15±7.93
91.59±33.58
118.72±39.67
115.36±36.95
黑素含量
44.92±19.98
, http://www.100md.com
46.27±10.12
56.67±14.34
56.56±4.86
68.80±10.84
氢醌
酪氨酸酶活性
77.14±9.88
74.79±23.84
138.99±21.64
205.77±10.57
116.08±65.42
, 百拇医药 黑素含量
74.35±6.43
27.45±3.61
52.89±12.73
ND
ND
注： 酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分率表示；* 括号内浓度为氢醌实验浓度；ND：未测出； ** 与50μmol/L，熊果苷组相比，P >0.05
表2 不同浓度18α-甘草酸双胺盐、氢醌和熊果苷对B16F10鼠黑素瘤细胞增殖率影响(χ±s，%) 处理因素
实验浓度*(μmol/L)
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10(0.1)
50(0.5)
100(1)
500(5)
1000(10)
5000(50)
18α甘草酸双胺盐
117.45±6.65
98.75±4.5
98.26±1.29
87.93±0.77
142.50±5.40
, 百拇医药
100.59±5.5
熊果苷
110.88±6.08
105.11±4.99
110.45±6.25
118.99±6.47
86.92±5.12
59.61±10.01
氢醌
117.04±6.36
121.42±8.54
115.49±9.17
, 百拇医药
82.10±3.40
78.55±3.48
36.78±0.54
注： 细胞存活率以处理组占对照组A值的百分率表示；每一实验重复4次； * 括号内浓度为氢醌实验浓度 3讨论
人们最早认识的皮肤脱色剂是分子结构与酪氨酸酶底物酪 氨酸类似的单酚类化合物氢醌[4]。但氢醌及其它酚类化合物的 外用制剂化学性质不稳定易氧化变色，且有引起皮肤永久性 白斑的报告[5]，限制了这类药物的临床应用和开发。1988年日 本学者Akiu等从杜鹃花科植物熊果(Arctoataphylosuva-ursi)的叶中 分离到一种具有脱色作用的单体化合物熊果苷(arbutin)[6～8]， 自此从药用植物中分离天然黑素生成调节剂再度引起人们的关 注。早期研究我们发现甘草等中药的乙醇提取物对蘑菇酪氨 酸酶活性有明显抑制作用[1]。本研究用体外培养的B16F10鼠黑素 瘤细胞作模型进一步观察了甘草活性成分18α-甘草酸双胺盐 、熊果苷及氢醌对B16F10细胞的形态、酪氨酸酶活性、黑素含 量以及细胞增殖率的影响，从表1可看出3种化合物均显示有抑 制黑素生成的作用，其中以50μmol/L熊果苷对酪氨酸酶活性和 黑素含量抑制作用最为明显，其次是100μmol/L18α-甘草酸双 胺盐，但二者并无统计学上的差异(P>0.05)。氢醌对B16F10细胞的 黑素生成呈双向调节，低浓度能下调酪氨酸酶活性和黑素含 量，高浓度则能轻度上调酪氨酸酶活性并呈现明显细胞毒性。
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尽管氢醌作为一种皮肤脱色剂在临床使用已久[5]，但其确 切的脱色机制至今仍不清楚。一种观点认为氢醌作为酪氨酸酶 的底物较酪氨酸本身更为合适，其脱色机制可能与竞争抑制 酪氨酸酶活性有关；另一观点认为氢醌脱色实质上是一酪氨酸 酶介导的细胞毒作用(tyrosinase-mediatedcytotoxity)。氢醌分子易 扩散进入黑素细胞的黑素小体，阻断黑素生成途径的一个或多 个步骤，同时氢醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半 醌基(semiquinoneradicals)物质，后者使细胞膜脂质发生过氧化， 破坏细胞膜性结构，最终导致细胞死亡[4,5]。我们的研究结果 显示不同浓度的氢醌其脱色作用的机制可能不同，低浓度时以 抑制酪氨酸酶活性为主，高浓度时主要是细胞毒，且早期细 胞损伤部位可能发生在树状突。
近来日本学者也注意到中药甘草的皮肤脱色作用。YokotaT 等报道甘草的水溶成分Glabridin有抑制B16F10细胞黑素生成和抗炎 作用[9]。18α-甘草酸双胺盐能否成为一种无细胞毒酪氨酸酶 抑制型皮肤脱色剂有待进一步临床加以验证。
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国家自然科学基金资助项目(基金编号39570658、39870701)
参考文献
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(收稿：1999-06-18), http://www.100md.com