不同年龄供体正常胃粘膜端粒状态分析
作者：杨仕明 房殿春 罗元辉 鲁荣 刘为纹
单位：第三军医大学附属西南医院消化内科 重庆，400038
关键词：胃粘膜；端粒限制性片段长度；衰老
第三军医大学学报990218 Analysis of telomere length in normal gastric mucosa from donors of different ages
提要 目的：探讨不同年龄供体正常胃粘膜端粒长度的变化规律。方法：采用Southern杂交及图像分析技术，检测26例76岁以下不同年龄供体正常胃粘膜端粒限制性片段长度(Telomeric restriction fragment,TRF)。结果：正常胃粘膜TRF长度呈年龄递减趋势，60岁以上组TRF长度明显短于0～39岁、40～49岁及50～59岁组(4.1±1.2 vs 6.4±1.8、6.0±1.0、5.5±1.1，P<0.05)，正常胃粘膜TRF长度与供体年龄呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，端粒重复序列平均每年丢失约(41±12)bp碱基对。结论：TRF长度可以作为衡量胃粘膜细胞衰老的一种生物学标志。
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中图法分类号 R322.44
端粒是真核生物的染色体末端一种由许多富含AC/TG重复序列及相关蛋白质组成的复合结构，具有保持染色体结构完整及解决末端复制难题(End replication problem)的作用，近年来有学者发现体细胞端粒长度随着年龄或者有丝分裂次数的增加而逐渐缩短[1～3]。本研究以不同年龄供体正常胃粘膜为研究对象，分析其端粒长度的变化，以探讨端粒长度在胃粘膜细胞衰老中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
聚蔗糖(Ficoll 400):Sigma公司；HinfI,T4多聚核苷酸激酶：Promega公司；Sephadex G-50：Pharmacia公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，牛血清白蛋白(BSA)，硝酸纤维素膜：华美公司；高强度琼脂糖9201：中山公司；(TTAGGG)4寡核苷酸探针：上海细胞所合成；γ-32P-ATP:亚辉公司。
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1.2 研究对象
3例胎胃粘膜取自本院水囊引产的死胎，23例正常胃粘膜分别取自1996年1月至1997年12月在本院因消化性溃疡或胃癌行胃大部切除患者的非病变区胃粘膜，标本取到后，去除坏死组织，放入经消毒处理的试管内，-80℃贮存备用。所有组织均经病理学证实。
1.3 DNA提取
按分子克隆有关章节进行。大致步骤如下：标本剪碎后，加入含0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)裂解缓冲液中，再加入蛋白酶K100 μg/ml，混匀后37℃恒温过夜，等体积酚氯仿抽提3次，乙醇沉淀2次，核酸絮状沉淀物经真空低温干燥后溶于TE缓冲液中，取少许用紫外分光光度计(Du-50,PE公司)定量并分析其纯度，其余在4℃保存备用。
1.4 寡核苷酸探针标记
严格按说明书进行，自制Sephadex G-50离心柱层析纯化，液闪计数仪进行放射性比活性及标记效率测定。
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1.5 Southern印迹杂交
按Counter[4]介绍的方法进行，简述如下：10 μg DNA经HinfI 37℃下酶切6 h，1%琼脂糖电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，与含γ-32P-ATP标记的(TTAGGG)4探针在5×SSC(750 mmol/L NaCl,75 mmol/L柠檬酸钠)，5×Denhardt液及0.1×焦磷酸钠缓冲液(0.5 mmol/L焦磷酸钠，10 mmol/L Na2 HPO4)中37℃下杂交24 h，0.1×SSC室浊下洗膜3次，每次7 min，凉干后AFGA医用X线片曝光24～48 h，附加增感屏。
1.6 端粒限制性片段分析
所获X线片，经本院光密度室真彩图像分析系统CAMIS型(空军总医院生物工程研究所研制)进行积分光密度扫描，端粒限制性片段(TRF)长度按以下公式进行计算，平均TRF=∑ODi/∑(ODi/Li)，ODi为i点的光密度值，Li为i点的Marker长度[1]。
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1.7 统计学分析
所获结果用计算机进行方差分析和相关分析。
2 结果
2.1 基因组DNA的鉴定
所抽提DNA经紫外分光光度仪分析，其D260/D280在1.8至2.0之间。将基因组DNA及经HinfI酶切DNA进行1%琼脂糖电泳，其结果见图1，基因组DNA在点样孔附近，说明DNA分子未降解，酶切DNA呈火箭样均匀分布，说明酶切完全。
图1 基因组DNA及酶切DNA经1%琼脂糖电泳结果
M：Marker；1～7：酶切DNA；8：基因组DNA
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2.2 TRF长度杂交结果，见图2
图2 胃粘膜TRF印迹杂交结果
图像分析显示，胃粘膜TRF长度呈年龄递减趋势，60岁以下组供体胃粘膜TRF长度明显短于0～39岁、40～49岁及50～59岁组(4.1±1.2 vs 6.4±1.8、6.0±1.0、5.5±1.1,P<0.05)，见图3。然后以年龄为横坐标，以TRF为纵坐标作相关分析，发现供体的年龄与胃粘膜TRF长度呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，其回归方程为Y=7.188-0.041X。胃粘膜平均每年丢失约41±12bp的端粒重复序列，结果见图4。
图3 不同年龄组胃粘膜TRF长度
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图4 不同年龄供体胃粘膜TRF长度与年龄的关系
3 讨论
胃粘膜是人体内更新最快的组织之一，本研究发现，正常胃粘膜TRF长度有呈年龄递减的趋势，供体年龄组越大，其胃粘膜平均TRF长度亦逐渐缩短。进一步研究发现，供体的年龄与正常胃粘膜TRF长度之间呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，端粒重复序列每年平均丢失约(41±12)bp，与文献报告基本一致。由于正常体细胞端粒酶大多处于失活状态，随着年龄的增加，体细胞有丝分裂次数亦增加，端粒重复序列将逐渐丢失，从而导致染色体端粒长度逐渐缩短，当端粒长度短至不足以维持端粒功能时，细胞停止有丝分裂而进入衰老期，因此有学者提出细胞衰老的端粒假说，认为端粒长度的变化可以作为细胞有丝分裂能力的生物钟(Mitotic clock)[1,5,6]。这种假说已为众多的实验所证实。Harley[1]分析了0～91岁不同供体成纤维细胞端粒长度，发现供体年龄与端粒长度呈明显负相关;Hastie[2]发现不同年龄供体血细胞和结肠粘膜端粒长度随年龄增加而逐渐缩短，平均每年丢失约33 bp重复序列；Allsopp观察了不同个体体外培养的成纤维细胞端粒初始长度与有丝分裂次数之间的关系，发现端粒初始长度越长，有丝分裂次数亦越多，分裂增殖能力也越强。相反，一些早老性疾病，如Hutchinson-Gilford综合征患者，其成纤维细胞端粒长度明显短于同龄正常人，体外培养这些细胞，其有丝分裂能力亦明显减弱[3]。
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最近，有研究报道，不同年龄供体角膜内皮细胞TRF长度基本保持不变，而且长期维持在一个较高的水平，但其端粒酶活性为阴性，这可能与人角膜内皮细胞有限的分裂增殖能力有关[7]。因此，研究具有不同分裂增殖能力的体细胞TRF长度，对进一步阐明细胞衰老的端粒假说可能有重要意义。
国家自然科学基金资助项目，NO.39670347
作者简介：杨仕明，男，29岁，博士研究生
参考文献
1 Harley C B, Futcher A B, Greider C W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature,1990,345(6274):458
2 Hastie N D, Dempster M, Dunlop M G, et al. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature,1990,346(6287):866
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3 Allsopp R C, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21):10114
4 Counter C M, Avilion A A, LeFeuvre C E, et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J,1992,11(5)：1921
5 Zakian V A. Telomeres: beginning to understand the end. Science,1995,270(5242)：1601
6 Harley C B. Telomere loss: mitotic clock or gentic time bomb. Mutat Res,1991,256(3)：271
7 Egan C A, Savre T I, Shay J W, et al. Analysis of telomere lengths in human corneal endothelial cells from donors of different ages. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39(3)：648
(收稿：1998-02-17；修回：1998-12-04), 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院消化内科 重庆，400038
关键词：胃粘膜；端粒限制性片段长度；衰老
第三军医大学学报990218 Analysis of telomere length in normal gastric mucosa from donors of different ages
提要 目的：探讨不同年龄供体正常胃粘膜端粒长度的变化规律。方法：采用Southern杂交及图像分析技术，检测26例76岁以下不同年龄供体正常胃粘膜端粒限制性片段长度(Telomeric restriction fragment,TRF)。结果：正常胃粘膜TRF长度呈年龄递减趋势，60岁以上组TRF长度明显短于0～39岁、40～49岁及50～59岁组(4.1±1.2 vs 6.4±1.8、6.0±1.0、5.5±1.1，P<0.05)，正常胃粘膜TRF长度与供体年龄呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，端粒重复序列平均每年丢失约(41±12)bp碱基对。结论：TRF长度可以作为衡量胃粘膜细胞衰老的一种生物学标志。
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中图法分类号 R322.44
端粒是真核生物的染色体末端一种由许多富含AC/TG重复序列及相关蛋白质组成的复合结构，具有保持染色体结构完整及解决末端复制难题(End replication problem)的作用，近年来有学者发现体细胞端粒长度随着年龄或者有丝分裂次数的增加而逐渐缩短[1～3]。本研究以不同年龄供体正常胃粘膜为研究对象，分析其端粒长度的变化，以探讨端粒长度在胃粘膜细胞衰老中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
聚蔗糖(Ficoll 400):Sigma公司；HinfI,T4多聚核苷酸激酶：Promega公司；Sephadex G-50：Pharmacia公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，牛血清白蛋白(BSA)，硝酸纤维素膜：华美公司；高强度琼脂糖9201：中山公司；(TTAGGG)4寡核苷酸探针：上海细胞所合成；γ-32P-ATP:亚辉公司。
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1.2 研究对象
3例胎胃粘膜取自本院水囊引产的死胎，23例正常胃粘膜分别取自1996年1月至1997年12月在本院因消化性溃疡或胃癌行胃大部切除患者的非病变区胃粘膜，标本取到后，去除坏死组织，放入经消毒处理的试管内，-80℃贮存备用。所有组织均经病理学证实。
1.3 DNA提取
按分子克隆有关章节进行。大致步骤如下：标本剪碎后，加入含0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)裂解缓冲液中，再加入蛋白酶K100 μg/ml，混匀后37℃恒温过夜，等体积酚氯仿抽提3次，乙醇沉淀2次，核酸絮状沉淀物经真空低温干燥后溶于TE缓冲液中，取少许用紫外分光光度计(Du-50,PE公司)定量并分析其纯度，其余在4℃保存备用。
1.4 寡核苷酸探针标记
严格按说明书进行，自制Sephadex G-50离心柱层析纯化，液闪计数仪进行放射性比活性及标记效率测定。
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1.5 Southern印迹杂交
按Counter[4]介绍的方法进行，简述如下：10 μg DNA经HinfI 37℃下酶切6 h，1%琼脂糖电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，与含γ-32P-ATP标记的(TTAGGG)4探针在5×SSC(750 mmol/L NaCl,75 mmol/L柠檬酸钠)，5×Denhardt液及0.1×焦磷酸钠缓冲液(0.5 mmol/L焦磷酸钠，10 mmol/L Na2 HPO4)中37℃下杂交24 h，0.1×SSC室浊下洗膜3次，每次7 min，凉干后AFGA医用X线片曝光24～48 h，附加增感屏。
1.6 端粒限制性片段分析
所获X线片，经本院光密度室真彩图像分析系统CAMIS型(空军总医院生物工程研究所研制)进行积分光密度扫描，端粒限制性片段(TRF)长度按以下公式进行计算，平均TRF=∑ODi/∑(ODi/Li)，ODi为i点的光密度值，Li为i点的Marker长度[1]。
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1.7 统计学分析
所获结果用计算机进行方差分析和相关分析。
2 结果
2.1 基因组DNA的鉴定
所抽提DNA经紫外分光光度仪分析，其D260/D280在1.8至2.0之间。将基因组DNA及经HinfI酶切DNA进行1%琼脂糖电泳，其结果见图1，基因组DNA在点样孔附近，说明DNA分子未降解，酶切DNA呈火箭样均匀分布，说明酶切完全。
图1 基因组DNA及酶切DNA经1%琼脂糖电泳结果
M：Marker；1～7：酶切DNA；8：基因组DNA
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2.2 TRF长度杂交结果，见图2
图2 胃粘膜TRF印迹杂交结果
图像分析显示，胃粘膜TRF长度呈年龄递减趋势，60岁以下组供体胃粘膜TRF长度明显短于0～39岁、40～49岁及50～59岁组(4.1±1.2 vs 6.4±1.8、6.0±1.0、5.5±1.1,P<0.05)，见图3。然后以年龄为横坐标，以TRF为纵坐标作相关分析，发现供体的年龄与胃粘膜TRF长度呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，其回归方程为Y=7.188-0.041X。胃粘膜平均每年丢失约41±12bp的端粒重复序列，结果见图4。
图3 不同年龄组胃粘膜TRF长度
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图4 不同年龄供体胃粘膜TRF长度与年龄的关系
3 讨论
胃粘膜是人体内更新最快的组织之一，本研究发现，正常胃粘膜TRF长度有呈年龄递减的趋势，供体年龄组越大，其胃粘膜平均TRF长度亦逐渐缩短。进一步研究发现，供体的年龄与正常胃粘膜TRF长度之间呈明显负相关(r=-0.56,P=0.0028)，端粒重复序列每年平均丢失约(41±12)bp，与文献报告基本一致。由于正常体细胞端粒酶大多处于失活状态，随着年龄的增加，体细胞有丝分裂次数亦增加，端粒重复序列将逐渐丢失，从而导致染色体端粒长度逐渐缩短，当端粒长度短至不足以维持端粒功能时，细胞停止有丝分裂而进入衰老期，因此有学者提出细胞衰老的端粒假说，认为端粒长度的变化可以作为细胞有丝分裂能力的生物钟(Mitotic clock)[1,5,6]。这种假说已为众多的实验所证实。Harley[1]分析了0～91岁不同供体成纤维细胞端粒长度，发现供体年龄与端粒长度呈明显负相关;Hastie[2]发现不同年龄供体血细胞和结肠粘膜端粒长度随年龄增加而逐渐缩短，平均每年丢失约33 bp重复序列；Allsopp观察了不同个体体外培养的成纤维细胞端粒初始长度与有丝分裂次数之间的关系，发现端粒初始长度越长，有丝分裂次数亦越多，分裂增殖能力也越强。相反，一些早老性疾病，如Hutchinson-Gilford综合征患者，其成纤维细胞端粒长度明显短于同龄正常人，体外培养这些细胞，其有丝分裂能力亦明显减弱[3]。
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最近，有研究报道，不同年龄供体角膜内皮细胞TRF长度基本保持不变，而且长期维持在一个较高的水平，但其端粒酶活性为阴性，这可能与人角膜内皮细胞有限的分裂增殖能力有关[7]。因此，研究具有不同分裂增殖能力的体细胞TRF长度，对进一步阐明细胞衰老的端粒假说可能有重要意义。
国家自然科学基金资助项目，NO.39670347
作者简介：杨仕明，男，29岁，博士研究生
参考文献
1 Harley C B, Futcher A B, Greider C W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature,1990,345(6274):458
2 Hastie N D, Dempster M, Dunlop M G, et al. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature,1990,346(6287):866
, http://www.100md.com
3 Allsopp R C, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21):10114
4 Counter C M, Avilion A A, LeFeuvre C E, et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J,1992,11(5)：1921
5 Zakian V A. Telomeres: beginning to understand the end. Science,1995,270(5242)：1601
6 Harley C B. Telomere loss: mitotic clock or gentic time bomb. Mutat Res,1991,256(3)：271
7 Egan C A, Savre T I, Shay J W, et al. Analysis of telomere lengths in human corneal endothelial cells from donors of different ages. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39(3)：648
(收稿：1998-02-17；修回：1998-12-04), 百拇医药