GDNFR-α在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中分布的免疫组织化学研究
作者：苏剑斌 周长满 鄂玲玲 徐忠涛 刘雁 李继硕
单位：苏剑斌(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；周长满(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；鄂玲玲(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；徐忠涛(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；刘雁(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；李继硕(第四军医大学解剖学教研室，梁銶琚脑研究中心，西安 710032)
关键词：胶质细胞源性神经营养因子受体-α；脊髓；背根节；大鼠
解剖学报000306 【摘要】 目的 观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α(GDNFR-α)在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布，探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的作用。 方法 原代培养脊髓和背根节神经元，5d后行抗GDNFR-α多克隆抗体免疫组织化学SP法染色。 结果 GDNF免疫反应存在于体外培养的脊髓神经元、背根节神经元以及胶质细胞中。 结论 GDNF可能对脊髓神经元、背根节神经元和胶质细胞的生理功能具有一定的调节作用。观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α(GDNFR-α)在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布，探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的作用。 方法 原代培养脊髓和背根节神经元，5d后行抗GDNFR-α多克隆抗体免疫组织化学SP法染色。 结果 GDNF免疫反应存在于体外培养的脊髓神经元、背根节神经元以及胶质细胞中。 结论 GDNF可能对脊髓神经元、背根节神经元和胶质细胞的生理功能具有一定的调节作用。
, 百拇医药
【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-215
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF GDNFR-α ON THE NEURONS
OF SPINAL CORD AND DRG OF RAT in vitro
SU Jian-bin ZHOU Chang-man E Ling-ling XU Zhong-tao LIU Yan LI Ji-shuo
Department of Anatomy,Beijing Medical College of PLA,Beijing 100071,China
Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Center,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective In order to investigate the effect of glial cell line-derived nerurothophic factor(GDNF)on the neurons of spinal cord and dorsal root ganlia(DRG),we observed the localization of GDNFR-α on neurons of spinal cord and DRG of rat in vitro. Methods The neurons of spinal cord and DRG of rats were cultured.Five days later,these cells were stained with GDNFR-α polyclone immunohistochemical staining technique. Results The positive GDNFR-α immunoreactivity was present in the neurons of spinal cord and DRG and glial cells. Conclusion The present results suggested that GDNF might have some important effects on the neurons of spinal cord and DRG and glial cells in vitro.
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【Key words】 Glial cell line-derived neurothophic factor receptor-α(GDNFR-α); Spinal cord; Dorsal root ganglia(DRG);Rat
胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是在1993年由小鼠胶质细胞系B49中分离出的糖基化的二硫键结合的同源二聚体蛋白质，属于转化生长因子β(transforming growth factor-β)超家族的成员[1]。研究发现GDNF是一种多效能的神经营养因子。不仅对中脑多巴胺能神经元有特异性作用，促进多巴胺能神经元的存活、生长、多巴胺的摄取、再生和分化，而且对神经系统运动神经元和感觉神经元的发育、存活和再生有着巨大的潜能[2～4]。GDNF的受体为多成分的复合物，是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFR-α和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白组成。GDNFR-α含有468个氨基酸，在氨基末端有具分泌作用的信号肽，在羧基末端有23个疏水氨基酸，3个糖基化位点和30个半胱氨酸残基，基局部配布与细胞激动素(cytokine)相似。GDNFR-α通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层，与GDNF有高亲合力[5]。为了进一步探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的生理功能，我们采用免疫组织化学的方法，研究了GDNFR-α在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布。
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材料和方法
1. 材料
1.1 细胞：大鼠脊髓原代细胞和背根节原代细胞，分别取自E14～16d Wistar大鼠脊髓与背根节。
1.2 抗体：纯化的具有高亲合力的羊抗GDNFR-α多克隆抗体，针对大鼠GDNFR-α前体多肽氨基端一段氨基酸残基，购自美国Santa Cruz生物技术公司。SP为ZYMED公司产品，SP工作液试剂盒购自北京中山生物技术公司。
2. 方法
2.1 细胞培养：取40只E14～16d的Wistar大鼠的脊髓和背根节，分别剪切成1mm3后用0.125%的胰蛋白酶(1∶250，Sigma)消化，制成细胞悬液并经20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，以1×106细胞密度接种在6孔板前2孔内，于37℃、5%CO2孵箱中进行原代培养。培养基为DMEM(Gibco/BRL)，含15%的胎牛血清(天津川页生化制品有限公司)。2d后更换培养液。
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2.2 GDNFR-α免疫组织化学染色：细胞培养5d后，第1孔细胞经4%多聚甲醛固定30min；3%H2O2室温孵育20min；5%正常羊血清室温孵育20min；1∶500 GDNFR-α的一抗室温过夜；生物素标记的二抗工作液37℃,30min；辣根过氧化物酶标记的链卵白素工作液37℃，30min；DAB呈色，以上各步之间均用0.01mol/L的PBS冲洗5min×3次。第2孔细胞做正常羊血清阴性对照。
结果
细胞培养5d后，脊髓神经元和背根节神经元均生长良好。脊髓神经元中运动神经元胞体多呈三角形或多角形，从胞体发出数条突起向四周延伸；另一部分神经元个体稍小，多呈椭圆形，突起较小，可能为中间神经元或背角神经元。背根节神经元个体较脊髓神经元稍小，胞体则多呈椭圆形或圆形，从胞体发出1条或2条细长的突起。原代培养的脊髓和背根节细胞中均可见个体较大的胶质细胞，多呈梭形，胞核较大，位于细胞中央。
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培养细胞行GDNFR-α抗体免疫组织化学染色后，可见部分脊髓运动神经元(图1)和背根节神经元(图2)呈免疫反应性，免疫反应性的神经元分别占脊髓神经元的30%和背根节神经元的20%。GDNFR-α样免疫反应物质呈棕褐色，分布于脊髓和背根节神经元的胞体和突起上。高倍镜下，可见免疫反应性神经元的胞膜染色较深，未见胞核呈现免疫反应(图1b，2b)。在培养的脊髓和背根节细胞中，偶见胶质细胞呈免疫反应性(图3，4)，胞膜深染，未见胞核染色。
正常羊血清对照组GDNFR-α免疫组织化学染色结果均为阴性。
讨论
神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)是一类对中枢和外周神经系统均有营养活性的蛋白质，具有促进神经系统发育、保护并修复受损神经元、以及促进生长和增进认知记忆过程中神经元之间的连结等功能。GDNF作为神经营养因子家族的新成员，发挥着多效能的神经营养作用，不仅特异地作用于多巴胺能神经元，而且对运动神经元和感觉神经元的发育、存活和再生发挥着重大作用[1～4]。GDNF的受体为多成分的复合物，是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFR-α和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白质组成。GDNFR-α为其配体结合亚单位，而Ret则是GDNF的功能性受体亚单位，即GDNF特异地结合于其受体的GDNFR-α上，再激活Ret的酪氨酸磷酸化传导信号，发挥其生物学效应。GDNFR-α是与GDNF具有高亲合力的细胞表面蛋白质，通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层。用125I-GDNF和仓鼠卵巢细胞表达GDNFR-α的实验证明两者的交联和结合是特异的和可逆的。在培养的卵巢细胞或神经细胞用磷脂酶C(PI-PLC)裂解GPI之后，卵巢细胞或神经细胞均失去了对GDNF应答的能力，表明GDNFR-α与GDNF结合之后能够协同GDNF的真正信号受体传送GDNF的信号，而GDNF也促进了GDNFR-α和孤儿酪氨酸激酶受体Ret之间的结合，并诱导后者酪氨酸的磷酸化[5]。
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Glazner等[6，7]利用原位杂交方法证实，GDNFR-α mRNA和Ret mRNA在脊髓前角α-运动神经元中均有表达。本研究发现，GDNFR-α样免疫反应性物质分布于脊髓运动神经元的胞体和突起上，结果与上述相符，提示GDNF可以与脊髓运动神经元胞膜表面的GDNFR-α特异性结合，进而激活胞内酪氨酸磷酸化转导信号，调节神经元的生理功能。脊髓作为脊椎动物的低级神经中枢，包含着脊髓反射的“最后通路”——α运动神经元，直接支配四肢骨骼肌的运动。GDNF作为一种多效能的神经营养因子，对神经系统运动神经元也具有较强的营养促进作用，但其是否在脊髓损伤后，对脊髓运动神经元的修复与再生发挥重要作用还有待进一步研究证实。
背根节神经元接受外周初级感觉信号的传入，进而将之传送到脊髓等高级中枢。GDNFR-α在背根节神经元上的阳性分布，提示GDNF不仅可能促进维持背根节细胞结构与形态的完整，而且可能对初级感觉信息的传入具有一定的调控作用。有研究认为，在背根节中，GDNF的受体成分主要表达于既可被IB4标记，又同时表达TMP酶的小神经元，这些神经元的数目占背根节神经元的1/3，并且它们不表达神经营养素受体成分[8]。本研究结果显示GDNFR-α仅表达于体外培养的部分背根节神经元中，提示GDNF对背根节神经元的影响和调控作用也存在一定的局限性，究竟这些神经元的分类与功能如何、GDNF对不同背根节神经元亚群的作用机制又如何还尚须进一步考证。
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本研究还发现，GDNFR-α存在于少许胶质细胞中，提示GDNF可能对部分胶质细胞也具有一定的生理作用。而胶质细胞又可以进一步对脊髓和背根节神经元发挥营养、保护和支持等作用。
图1 体外培养5d的大鼠脊髓神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
图2 体外培养5d的大鼠背根节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
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图3 体外培养5d的大鼠脊髓节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
图4 体外培养5d的大鼠背根节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
Fig.1Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v la,×200；1b,×1000
Fig.2Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat DRG 5 d .i.v la,×200；1b,×1000
Fig.3 Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v la,×200；
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Fig.4Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v(arrow) la,×200；
【作者简介】 苏剑斌(1971—)，男(汉族)，河北省石家庄市人，医学硕士
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
[1]Lin L-FH,Dohertry DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell-line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130-1132.
, 百拇医药
[2]Henderson CE,Phillips HS,Pollock RA,et al.GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle[J].Science,1994,266(5187):1062-1064.
[3]Choi-lundberg DL,Bohn MC.Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)mRNA in rat[J].Brain Res Dev Brain Res,1995,85(1):80-88.
[4]Yan Q,Matheson C,Lopez O.In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons[J].Nature,1995,373(6512):341-344.
, http://www.100md.com
[5]周明华，陈思颖，吴玺印.胶质细胞株源性神经营养因子研究的新进展[J].神经解剖学杂志，1998，14(1)：85～87.
[6]Glazner GW,Mu X,Springer JE.Localization of glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha and c-ret mRNA in rat central nervous system[J].J Comp Neurol,1998,391(1):42-49.
[7]Nosrat CA,Tomac A,Hoffer BJ,et al.Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs[J].Exp Brain Res,1997,115(3):410-422.
[8]Bennett DL,Michael GJ,Ramachandran N,et al.A distinct subgroup of small DRG cells express GDNF receptor components and GDNF is protective for these neurons after nerve injury[J].J Neurosci,1998,18(8):3059-3072.
【收稿日期】1999-06-15 【修稿日期】1999-11-23, http://www.100md.com
单位：苏剑斌(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；周长满(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；鄂玲玲(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；徐忠涛(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；刘雁(解放军北京军医学院解剖学教研室，北京 100071)；李继硕(第四军医大学解剖学教研室，梁銶琚脑研究中心，西安 710032)
关键词：胶质细胞源性神经营养因子受体-α；脊髓；背根节；大鼠
解剖学报000306 【摘要】 目的 观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α(GDNFR-α)在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布，探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的作用。 方法 原代培养脊髓和背根节神经元，5d后行抗GDNFR-α多克隆抗体免疫组织化学SP法染色。 结果 GDNF免疫反应存在于体外培养的脊髓神经元、背根节神经元以及胶质细胞中。 结论 GDNF可能对脊髓神经元、背根节神经元和胶质细胞的生理功能具有一定的调节作用。观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α(GDNFR-α)在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布，探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的作用。 方法 原代培养脊髓和背根节神经元，5d后行抗GDNFR-α多克隆抗体免疫组织化学SP法染色。 结果 GDNF免疫反应存在于体外培养的脊髓神经元、背根节神经元以及胶质细胞中。 结论 GDNF可能对脊髓神经元、背根节神经元和胶质细胞的生理功能具有一定的调节作用。
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【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-215
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF GDNFR-α ON THE NEURONS
OF SPINAL CORD AND DRG OF RAT in vitro
SU Jian-bin ZHOU Chang-man E Ling-ling XU Zhong-tao LIU Yan LI Ji-shuo
Department of Anatomy,Beijing Medical College of PLA,Beijing 100071,China
Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Center,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
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【Abstract】 Objective In order to investigate the effect of glial cell line-derived nerurothophic factor(GDNF)on the neurons of spinal cord and dorsal root ganlia(DRG),we observed the localization of GDNFR-α on neurons of spinal cord and DRG of rat in vitro. Methods The neurons of spinal cord and DRG of rats were cultured.Five days later,these cells were stained with GDNFR-α polyclone immunohistochemical staining technique. Results The positive GDNFR-α immunoreactivity was present in the neurons of spinal cord and DRG and glial cells. Conclusion The present results suggested that GDNF might have some important effects on the neurons of spinal cord and DRG and glial cells in vitro.
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【Key words】 Glial cell line-derived neurothophic factor receptor-α(GDNFR-α); Spinal cord; Dorsal root ganglia(DRG);Rat
胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是在1993年由小鼠胶质细胞系B49中分离出的糖基化的二硫键结合的同源二聚体蛋白质，属于转化生长因子β(transforming growth factor-β)超家族的成员[1]。研究发现GDNF是一种多效能的神经营养因子。不仅对中脑多巴胺能神经元有特异性作用，促进多巴胺能神经元的存活、生长、多巴胺的摄取、再生和分化，而且对神经系统运动神经元和感觉神经元的发育、存活和再生有着巨大的潜能[2～4]。GDNF的受体为多成分的复合物，是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFR-α和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白组成。GDNFR-α含有468个氨基酸，在氨基末端有具分泌作用的信号肽，在羧基末端有23个疏水氨基酸，3个糖基化位点和30个半胱氨酸残基，基局部配布与细胞激动素(cytokine)相似。GDNFR-α通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层，与GDNF有高亲合力[5]。为了进一步探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的生理功能，我们采用免疫组织化学的方法，研究了GDNFR-α在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布。
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材料和方法
1. 材料
1.1 细胞：大鼠脊髓原代细胞和背根节原代细胞，分别取自E14～16d Wistar大鼠脊髓与背根节。
1.2 抗体：纯化的具有高亲合力的羊抗GDNFR-α多克隆抗体，针对大鼠GDNFR-α前体多肽氨基端一段氨基酸残基，购自美国Santa Cruz生物技术公司。SP为ZYMED公司产品，SP工作液试剂盒购自北京中山生物技术公司。
2. 方法
2.1 细胞培养：取40只E14～16d的Wistar大鼠的脊髓和背根节，分别剪切成1mm3后用0.125%的胰蛋白酶(1∶250，Sigma)消化，制成细胞悬液并经20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，以1×106细胞密度接种在6孔板前2孔内，于37℃、5%CO2孵箱中进行原代培养。培养基为DMEM(Gibco/BRL)，含15%的胎牛血清(天津川页生化制品有限公司)。2d后更换培养液。
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2.2 GDNFR-α免疫组织化学染色：细胞培养5d后，第1孔细胞经4%多聚甲醛固定30min；3%H2O2室温孵育20min；5%正常羊血清室温孵育20min；1∶500 GDNFR-α的一抗室温过夜；生物素标记的二抗工作液37℃,30min；辣根过氧化物酶标记的链卵白素工作液37℃，30min；DAB呈色，以上各步之间均用0.01mol/L的PBS冲洗5min×3次。第2孔细胞做正常羊血清阴性对照。
结果
细胞培养5d后，脊髓神经元和背根节神经元均生长良好。脊髓神经元中运动神经元胞体多呈三角形或多角形，从胞体发出数条突起向四周延伸；另一部分神经元个体稍小，多呈椭圆形，突起较小，可能为中间神经元或背角神经元。背根节神经元个体较脊髓神经元稍小，胞体则多呈椭圆形或圆形，从胞体发出1条或2条细长的突起。原代培养的脊髓和背根节细胞中均可见个体较大的胶质细胞，多呈梭形，胞核较大，位于细胞中央。
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培养细胞行GDNFR-α抗体免疫组织化学染色后，可见部分脊髓运动神经元(图1)和背根节神经元(图2)呈免疫反应性，免疫反应性的神经元分别占脊髓神经元的30%和背根节神经元的20%。GDNFR-α样免疫反应物质呈棕褐色，分布于脊髓和背根节神经元的胞体和突起上。高倍镜下，可见免疫反应性神经元的胞膜染色较深，未见胞核呈现免疫反应(图1b，2b)。在培养的脊髓和背根节细胞中，偶见胶质细胞呈免疫反应性(图3，4)，胞膜深染，未见胞核染色。
正常羊血清对照组GDNFR-α免疫组织化学染色结果均为阴性。
讨论
神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)是一类对中枢和外周神经系统均有营养活性的蛋白质，具有促进神经系统发育、保护并修复受损神经元、以及促进生长和增进认知记忆过程中神经元之间的连结等功能。GDNF作为神经营养因子家族的新成员，发挥着多效能的神经营养作用，不仅特异地作用于多巴胺能神经元，而且对运动神经元和感觉神经元的发育、存活和再生发挥着重大作用[1～4]。GDNF的受体为多成分的复合物，是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFR-α和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白质组成。GDNFR-α为其配体结合亚单位，而Ret则是GDNF的功能性受体亚单位，即GDNF特异地结合于其受体的GDNFR-α上，再激活Ret的酪氨酸磷酸化传导信号，发挥其生物学效应。GDNFR-α是与GDNF具有高亲合力的细胞表面蛋白质，通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层。用125I-GDNF和仓鼠卵巢细胞表达GDNFR-α的实验证明两者的交联和结合是特异的和可逆的。在培养的卵巢细胞或神经细胞用磷脂酶C(PI-PLC)裂解GPI之后，卵巢细胞或神经细胞均失去了对GDNF应答的能力，表明GDNFR-α与GDNF结合之后能够协同GDNF的真正信号受体传送GDNF的信号，而GDNF也促进了GDNFR-α和孤儿酪氨酸激酶受体Ret之间的结合，并诱导后者酪氨酸的磷酸化[5]。
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Glazner等[6，7]利用原位杂交方法证实，GDNFR-α mRNA和Ret mRNA在脊髓前角α-运动神经元中均有表达。本研究发现，GDNFR-α样免疫反应性物质分布于脊髓运动神经元的胞体和突起上，结果与上述相符，提示GDNF可以与脊髓运动神经元胞膜表面的GDNFR-α特异性结合，进而激活胞内酪氨酸磷酸化转导信号，调节神经元的生理功能。脊髓作为脊椎动物的低级神经中枢，包含着脊髓反射的“最后通路”——α运动神经元，直接支配四肢骨骼肌的运动。GDNF作为一种多效能的神经营养因子，对神经系统运动神经元也具有较强的营养促进作用，但其是否在脊髓损伤后，对脊髓运动神经元的修复与再生发挥重要作用还有待进一步研究证实。
背根节神经元接受外周初级感觉信号的传入，进而将之传送到脊髓等高级中枢。GDNFR-α在背根节神经元上的阳性分布，提示GDNF不仅可能促进维持背根节细胞结构与形态的完整，而且可能对初级感觉信息的传入具有一定的调控作用。有研究认为，在背根节中，GDNF的受体成分主要表达于既可被IB4标记，又同时表达TMP酶的小神经元，这些神经元的数目占背根节神经元的1/3，并且它们不表达神经营养素受体成分[8]。本研究结果显示GDNFR-α仅表达于体外培养的部分背根节神经元中，提示GDNF对背根节神经元的影响和调控作用也存在一定的局限性，究竟这些神经元的分类与功能如何、GDNF对不同背根节神经元亚群的作用机制又如何还尚须进一步考证。
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本研究还发现，GDNFR-α存在于少许胶质细胞中，提示GDNF可能对部分胶质细胞也具有一定的生理作用。而胶质细胞又可以进一步对脊髓和背根节神经元发挥营养、保护和支持等作用。
图1 体外培养5d的大鼠脊髓神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
图2 体外培养5d的大鼠背根节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
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图3 体外培养5d的大鼠脊髓节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
图4 体外培养5d的大鼠背根节神经元中GDNFR-a样免疫反应性神经元1a:×200，1b:×1000
Fig.1Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v la,×200；1b,×1000
Fig.2Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat DRG 5 d .i.v la,×200；1b,×1000
Fig.3 Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v la,×200；
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Fig.4Immunocytochemical stainof GDNFR-a positive neurons of rat spinal cord 5 d .i.v(arrow) la,×200；
【作者简介】 苏剑斌(1971—)，男(汉族)，河北省石家庄市人，医学硕士
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
[1]Lin L-FH,Dohertry DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell-line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130-1132.
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[2]Henderson CE,Phillips HS,Pollock RA,et al.GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle[J].Science,1994,266(5187):1062-1064.
[3]Choi-lundberg DL,Bohn MC.Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)mRNA in rat[J].Brain Res Dev Brain Res,1995,85(1):80-88.
[4]Yan Q,Matheson C,Lopez O.In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons[J].Nature,1995,373(6512):341-344.
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[5]周明华，陈思颖，吴玺印.胶质细胞株源性神经营养因子研究的新进展[J].神经解剖学杂志，1998，14(1)：85～87.
[6]Glazner GW,Mu X,Springer JE.Localization of glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha and c-ret mRNA in rat central nervous system[J].J Comp Neurol,1998,391(1):42-49.
[7]Nosrat CA,Tomac A,Hoffer BJ,et al.Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs[J].Exp Brain Res,1997,115(3):410-422.
[8]Bennett DL,Michael GJ,Ramachandran N,et al.A distinct subgroup of small DRG cells express GDNF receptor components and GDNF is protective for these neurons after nerve injury[J].J Neurosci,1998,18(8):3059-3072.
【收稿日期】1999-06-15 【修稿日期】1999-11-23, http://www.100md.com