丙交酯乙交酯共聚物的毒性试验及其含左旋18-甲基炔诺酮微球对鼠的抗生育作用研究
作者：金爱华 张寅恭 焦捷军 朱家惠 周芝芳 陶沁
单位：(浙江省医学科学院 计划生育研究所，杭州 310013)
关键词：丙交酯乙交酯共聚物；毒性；18-甲基炔诺酮；微球；抗生育作用
生物医学工程学杂志000203 摘要 对可生物降解聚合物丙交酯乙交酯共聚物(PLGA 9∶1)进行了急性全身毒性、眼结膜刺激、肌肉刺激、热源、溶血、过敏等试验和含LNG的PLAG微球注射剂对小鼠和大鼠的抗生育作用试验。结果表明：PLGA无毒、对眼结膜和肌肉无刺激性、无热源作用、无溶血作用、无致敏作用，具有良好的生物相容性。小鼠皮下注射PLGA-LNG微球5、10、20 mg/kg，避孕天数分别为11.5、34.6、81.2 d，大鼠肌肉注射PLGA-LNG微球13.6、19.8、30 mg/kg，对大鼠动情周期抑制为76.3、104.1、131.8 d，两者均较注射同等剂量的LNG微晶组动物作用明量增强。提示PLGA-LNG微球有长效抗生育作用。
, 百拇医药
Studies on the Toxicity of Polymer of Glycolide and Lactide(PLGA) and the Anti-fertility Effect of Levonorgestrel(LNG)
Jin Aihua Zhang Yingong Jiao Jiejun Zhu Jiahui Zhou Zhifang Tao Qin
(Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013)
Abstract PLGA(9∶1)，a chemical degraded from biomaterials,has been subjected to the tests of acute toxicity,irritations on conjunctiva and muscle,haemolysis in vitro and allergic reaction of mice and rats.The anti-fertility effect of PLGA-LNG microphere composite on the same animals also has been tested.The studies demonstrated that PLGA had fine biological compatibility without side effects such as toxicity,irritations on conjunctiva and muscle,pyrogenicity,haemolysis in vitro and allergic reaction.The contraception period of mice lasted 11.5,34.6 and 81.2 days respectively after the subcutaneous (s.c.) injection of PLGA-LNG microphere which contains LNG 5,10 and 20 mg/kg separately.The intramuscular(i.m.) injection of PLGA-LNG microphere containing LNG 13.6,19.8 and 30 mg/kg respectively could keep the estrus of rats supressed for 76.3,104.1 and 131.8 days.The injections of PLGA-LNG microphere through s.c.or i.m.showed more significant effects than the same dosages of PLGA-LNG micro-crystal.These results suggest that PLGA-LNG microphere injection has long-term anti-fertility effect.
, 百拇医药
Key words Polymer of glycolide and lactide Toxicity Levonorgestrel Microphere Anti-fertility effect
1 引 言
用可生物降解的聚合物为载体制成的长效控释制剂能以恒定的速率释放药物，防止了由口服或注射剂所发生的血药浓度的波动所致的不良反应。而且又具有给药后载体自行降解，无需手术取出的优点。这种新型的生物降解医用生物材料已越来越广泛地受到重视。生物降解的聚乳酸(PLA)及其与不同组分的乙醇酸的共聚物(PLGA)已用作研制甾体激素长效避孕药的载体，用PLA或PLGA制成的含炔诺酮微球注射剂，经临床初步试验证明能维持抗生育药效6个月[1]。我所药化室与浙江大学化学系协作合成了丙交酯乙交酯共聚物(PLGA9∶1)，药剂室制成PLGA-LNG微球长效避孕注射剂。我们对其进行了毒性试验和小鼠、大鼠的抗生育作用研究，结果如下。
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2 材料与方法
2.1 材料
丙交酯乙交酯共聚物由本所药化室合成。丙交酯：乙交酯=9∶1(PLGA 9∶1)。
2.1.1 PLGA浸提液 按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法[2]，取PLGA材料4 g，切成约2 mm×2 mm小块，经自来水冲洗，蒸馏水和生理盐水摇洗后，加入20 ml生理盐水，于121±2 ℃条件下，浸提1 h，过滤后作用。
PLGA空白微球和含左旋18-甲基炔诺酮PLGA微球(LNG含量为19.43%)，LNG微晶由本所药剂室提供，用时以0.5%CMC-Na配成混悬液。
2.1.2 动物 NIH小鼠、SD大鼠、豚鼠和新西兰家兔均由浙江省实验动物中心提供。
, 百拇医药
2.2 实验方法
2.2.1 急性全身毒性试验 PLGA浸提液：NIH小鼠20只，体重19～20 g，雌雄各半，随机分成实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠从尾静脉注入PLGA浸提液，对照组小鼠从尾静脉注入与浸提液同批的生理盐水，两组剂量均为50 ml/kg。注射后当即及4、8、24、48、72 h及7 d后，比较观察实验组与对照组动物的状况。
PLGA微球：NIH小鼠20只，体重19～20 g，雌雄各半，随机分为2组，每组10只。实验组皮下注射PLGA微球混悬液10 g/kg，对照组皮下注射溶媒25 ml/kg。注射后当即及4、8、24 h，以后每天1次，连续观察28 d，比较观察实验组与对照组动物的状况。
2.2.2 刺激试验 (1)眼结膜刺激试验：健康雌白兔3只，体重2.4～2.8 kg,按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法操作[2]。将PLGA 0.6%眼生理盐水浸提液滴入兔右眼，左眼滴入空白0.6%生理盐水作对照，每次2～3滴，每天上下午各1次，连续14 d。每次滴后15 min观察有无流泪、充血、分泌物增加等刺激症状。14 d后刮取上下眼睑结膜表皮细胞，涂片、伊红染色，光镜检查，每只眼(包括对照)各涂片2张。(2)肌肉刺激试验：SD大鼠35只，雌性，体重220～240 g，随机分为7组，每组5只，于左腿1次肌注PLGA微球混悬液400 mg/kg，分别于注射后48、72 h，7、14 d，1、3、6Mon各处死1组大鼠，检查注射局部有无充血、红肿、坏死等现象。并取含PLGA微球的肌肉一小块，另取右腿相同部位肌肉一块作对照，以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，H.E染色，作病理检查。
, 百拇医药
2.2.3 热源试验 按中国药典法[3]，将饲养在同一环境，喂相同饲料的健康家兔8只，体重2.2～2.8 kg，在试验前7 d预测体温。家兔每1 h以肛温计测量肛门体温1次，共测4次，挑选4次体温均在38.3 ℃～39.6 ℃范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4 ℃的家兔供用。使用的器具置烘箱中250 ℃加热30 min除去热源。测温合格的家兔在试验前禁食2 h，间隔30 min测量3次体温，末两次体温的差数不得超过0.2 ℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。取适用的雌兔3只，在测定正常体温后15 min内，经耳缘静脉缓缓注入温热约37 ℃的PLGA浸提液10 ml/kg。然后每隔1 h，按前法测温1次，共3次。将3次测得的体温减去正常体温，计算各兔体温的各兔体温的升高度数和体温升高总数。
2.2.4 溶血试验 按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法进行[2]。取新采的兔血20 ml，加2%草酸钾1 ml制备成抗凝兔血。将抗凝兔血8 ml加生理盐水10 ml稀释。取PLGA材料5 g,3份，切成2 mm×2 mm小块，放入试管内，加入生理盐水10 ml。阳性对照用蒸馏水10 ml，阴性用生理盐水10 ml，各3管。将各管置37 ℃水温箱中30 min，每管加稀释兔血0.2 ml,轻轻混匀，置37 ℃水温箱内继续保温1 h。然后取出，各组样品离心5 min(750 g)，取上清液置比色皿内，721分光光度计540 nm测定各管吸光度。阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3。如果阴性对照管的吸光度大于0.03，应重做试验。
, 百拇医药
2.2.5 过敏试验 取体重280～320 g豚鼠8只，雌性，随机分成2组，每组4只。1、2两组豚鼠隔日腹腔注射PLGA浸提液1 ml,共3次，1组于首次给药后第14 d，由静脉注射PLGA浸提液1 ml，立即观察动物有无抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛等过敏反应。第2组于首次给药后21 d，静脉注射PLGA浸提液1 ml，观察有无过敏反应。
2.2.6 PLGA-LNG微球对小鼠的避孕作用 NIH雌小鼠70只，体重27～30 g,随着分为7组，每组10只。1组为对照，给溶媒10 ml/kg,2～4组给PLGA-LNG微球混悬液5、10、20 mg/kg(按LNG量计算)，5～7组给LNG微晶混悬液5、10、20 mg/kg。各组均皮下注射，给药后3 d与有生育力的雄鼠合笼，记录合笼至仔鼠出生时间，与对照组比较，计算出避孕天数。
2.2.7 PLGA-LNG微球对大鼠动情周期的抑制作用 按我们以前报道方法进行[4]，用SD大鼠，雌性，体重180～200 g，每天定时采取阴道分泌物涂片镜检，经2个动情周期(9～10)的阴道涂片观察，从中挑选出70只动情周期较规则的大鼠，随机分成7组，每组10只。第1组给溶媒2 ml/kg，第2～4组给PLGA-LNG微球13.1、19.8、30 mg/kg(按LNG量计算)，第5～7组合LNG微晶13.1、19.8、30 mg/kg。各组均肌肉注射，次日起每日定时作阴道涂片检查，以涂片中角化细胞出现作为动情周期恢复日，计算出抑制动情周期天数。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 急性全身毒性试验
小鼠静脉注射PLGA浸提液50 ml/kg和皮下注射PLGA微球混悬液10 g/kg，在试验过程中各组动物状态良好，体重增加，无死亡，试验组和对照组小鼠情况相似。表明PLGA浸提液和微球无明显毒性。
3.2 刺激试验
3.2.1 眼结膜刺激试验 试验侧和对照侧眼睛情况相似，未见流泪、结膜充血和分泌物增加等现象。两侧眼结膜涂片，光镜检查未见炎性细胞。表明PLGA浸提液对家兔眼结膜无刺激性。
3.2.2 肌肉刺激试验 各组大鼠注射局部未见充血、红肿、坏死等现象。7 d后PLGA微球形成凝块，有膜包绕，与周围组织相隔良好。随着时间的延长，微球在大鼠体内逐渐降解，3个月时解剖大鼠肌肉中尚有较大微球凝块，6个月时大鼠肌肉中微球凝块已很小，大部分降解。病理检查结果表明，大鼠肌注PLGA微球48、72 h，在微球间隙及微球与肌纤维之间可见嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润的炎症反应。7 d后炎症明量减轻，成纤维细胞组成膜已基本包围了微球，但微球与肌纤维间仍有少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞。14 d后在微球与肌纤维间还可见到极少量淋巴细胞。1、3、6 Mon微球由结缔组织包围，周围肌纤维完好，未见炎症反应。
, 百拇医药
3.3 热源试验
家兔注射PLGA浸提液后，最大体温升高分别为0.12、0.20、0.21 ℃，均在0.6 ℃以下。3只家兔体温升高总数为1.24 ℃，在1.4 ℃以下。可以认为PLGA材料符合热源检查的规定。
3.4 溶血试验
各个样品在540 nm处测得的吸光度，阳性对照组为0.79、0.82、0.82，平均0.81，阴性对照组为0.01、0.012、0.08，平均0.01，PLGA材料组为0.016、0.01、0.01，平均为0.012。按溶血程度公式计算，PLGA材料的溶血度为0.25%，小于5%，符合医用材料的溶血试验要求。
3.5 过敏试验
两组豚鼠均未见过敏反应症状，表明PLGA无过敏作用。
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3.6 对小鼠的避孕作用
结果见表1。
表1 PLGA-LNG微球和LNG微晶对小鼠的避孕作用
Table 1 Antifertility effect of PLGA-LNG microsphere and LNG microcrystal Groups
Dosage
(LNG mg/kg)
No.of
animals
Time of fertility
(days，
±s)
, http://www.100md.com
Days of
contraception(d)
control
10(ml/kg)
10
24.3±2.8
PLGA-LNG
5
10
35.8±10.7* * ▲
11.5
microsphere
, 百拇医药
10
10
58.9±13.1* * * ▲ ▲
34.6
20
10
105.5±16.9* * * ▲ ▲
81.2
LNG
5
10
24.6±3.1
, http://www.100md.com
0.3
microcrystal
10
10
31.8±8.4*
7.5
20
10
40.7±9.0* *
16.4
Compared with control * P<0.05；* * P<0.01；* * *P<0.001；Compared with LNG microcrystal ▲ P<0.01；▲ ▲ P<0.001
, 百拇医药
由表1可见，皮下注射PLGA-LNG微球和LNG微晶组的小鼠平均生育时间均较对照组长，说明两者都有避孕作用。但两者相比，PLGA-LNG微球的避孕效果明显优于LNG微晶。
3.7 对大鼠动情周期的抑制作用
结果见表2。表2 PLGA-LNG微球和LNG微晶对大鼠动情期的抑制作用
Table 2 Suppression of estrus cycle of rat by PLGA-LNG microphere and LNG microcrystal Groups
Dosage
(LNG mg/kg)
No.of
, 百拇医药 animals
Duration of estrus suppression
(days，±s)
control
2(ml/kg)
10
0
PLGA-LNG
13.1
10
76.3±9.5*
, http://www.100md.com
microsphere
19.8
10
104.1±48.6*
30.0
10
131.8±50.0*
LNG
13.1
10
25.5±4.8
microcrystal
, 百拇医药
19.8
10
33.2±3.8
30.0
10
38.4±6.0
Compared with LNG microcrystal * P<0.01
由表2说明PLGA-LNG微球和LNG微晶对大鼠动，情周期均有抑制作用，两者比较，PLGA-LNG微球作用明显强于LNG微晶。
4 讨 论
上述实验结果表明，PLGA材料无明显毒性，对组织无刺激性、无热源作用、无溶血作用、无致敏作用，有良好的生物相容性。伏晓敏等[5]报道，PLGA无细胞毒性，微核和Ames试验阴性。PLGA-LNG微球和LNG微晶制剂对大、小鼠抗生育试验结果显示，PLGA-LNG微球的抗生育作用较LNG微晶显著增强，有长效抗生育作用。PLGA作为一种新型的缓释避孕药载体，值得进一步研究。
, http://www.100md.com
药代动力学研究结果表明[6]，PLGA-LNG微球im后可形成一维时长达100 d的相对平稳血药水平，其抗生育有效浓度达168 d，较LNG微晶长4倍，具有明显的缓释长效作用。而且PLGA-LNG注射后，初始血药峰值可有明显下降，有利于消除药物浓度过高所致的不良反应。国外用PLA和PLGA为载体研制的含炔诺酮的微球注射剂，1次给药避孕时间为6个月，而我们研制的PLGA-LNG微球注射剂，从动物抗生育试验和药代动力学结果看，可望达到6个月的避孕效果。你们合成的PLGA(9∶1)初步试验结果，体内降解期为7～9个月，与Beck等[7]报道相一致。如以6个月注射一次，当PLGA中LNG释放完后，PLGA也随之降解完了，无蓄积之色，可以连续使用。
新型的可生物降解的PLGA-LNG微球注射剂是一种长效、方便、安全的避孕制剂，具有广阔的应用前景。但该注射剂是计划生育用药，使用者均为正常妇女，所以在进行临床试用前，还需进行长期毒性和生殖毒性等试验，以确保使用者的安全。
, 百拇医药
国家计生委资助项目(93-0-30)和浙江省卫生厅基金资助项目(95028)
参考文献
1，Beck LR,Ramos RA,Flowers CE et al.Clinical evaluation of injectable biodegradable contraceptive system.Am J Obstet Gynecol,1981;140∶799
2，上海生物材料研究测试中心.计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法(暂行标准草案).1990
3，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典，二部，附录.北京：化学工业出版社，人民卫生出版社，1985；86
4，沈文照、韩锦文，林毓颖等.醋炔诺酮肟顺、反式异构体的分离、鉴别与其抗生育活性的比较.生殖与避孕，1989；9(1)∶46
, 百拇医药
5，伏晓敏、乐俊仪，左旋18甲及炔诺酮微球及其生物材料致突变性及细胞毒性.浙江省医学科学院学报，1991；2(1)∶20
6，章利春、桑国卫、邵庆翔.生物降解型左旋18-甲基炔诺酮微球在大鼠的药代动力学.药学学报，1994；29(8)∶561
7，Beck LR,Pope VZ,Cowsar DR et al.Poly(DL-Lactide-co-glycolide)/Norethisterone Microcapsules:An injectable biodegradable contraceptive.Biol Reprod,1983;28∶186
(收稿：1998-11-10), 百拇医药
单位：(浙江省医学科学院 计划生育研究所，杭州 310013)
关键词：丙交酯乙交酯共聚物；毒性；18-甲基炔诺酮；微球；抗生育作用
生物医学工程学杂志000203 摘要 对可生物降解聚合物丙交酯乙交酯共聚物(PLGA 9∶1)进行了急性全身毒性、眼结膜刺激、肌肉刺激、热源、溶血、过敏等试验和含LNG的PLAG微球注射剂对小鼠和大鼠的抗生育作用试验。结果表明：PLGA无毒、对眼结膜和肌肉无刺激性、无热源作用、无溶血作用、无致敏作用，具有良好的生物相容性。小鼠皮下注射PLGA-LNG微球5、10、20 mg/kg，避孕天数分别为11.5、34.6、81.2 d，大鼠肌肉注射PLGA-LNG微球13.6、19.8、30 mg/kg，对大鼠动情周期抑制为76.3、104.1、131.8 d，两者均较注射同等剂量的LNG微晶组动物作用明量增强。提示PLGA-LNG微球有长效抗生育作用。
, 百拇医药
Studies on the Toxicity of Polymer of Glycolide and Lactide(PLGA) and the Anti-fertility Effect of Levonorgestrel(LNG)
Jin Aihua Zhang Yingong Jiao Jiejun Zhu Jiahui Zhou Zhifang Tao Qin
(Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013)
Abstract PLGA(9∶1)，a chemical degraded from biomaterials,has been subjected to the tests of acute toxicity,irritations on conjunctiva and muscle,haemolysis in vitro and allergic reaction of mice and rats.The anti-fertility effect of PLGA-LNG microphere composite on the same animals also has been tested.The studies demonstrated that PLGA had fine biological compatibility without side effects such as toxicity,irritations on conjunctiva and muscle,pyrogenicity,haemolysis in vitro and allergic reaction.The contraception period of mice lasted 11.5,34.6 and 81.2 days respectively after the subcutaneous (s.c.) injection of PLGA-LNG microphere which contains LNG 5,10 and 20 mg/kg separately.The intramuscular(i.m.) injection of PLGA-LNG microphere containing LNG 13.6,19.8 and 30 mg/kg respectively could keep the estrus of rats supressed for 76.3,104.1 and 131.8 days.The injections of PLGA-LNG microphere through s.c.or i.m.showed more significant effects than the same dosages of PLGA-LNG micro-crystal.These results suggest that PLGA-LNG microphere injection has long-term anti-fertility effect.
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Key words Polymer of glycolide and lactide Toxicity Levonorgestrel Microphere Anti-fertility effect
1 引 言
用可生物降解的聚合物为载体制成的长效控释制剂能以恒定的速率释放药物，防止了由口服或注射剂所发生的血药浓度的波动所致的不良反应。而且又具有给药后载体自行降解，无需手术取出的优点。这种新型的生物降解医用生物材料已越来越广泛地受到重视。生物降解的聚乳酸(PLA)及其与不同组分的乙醇酸的共聚物(PLGA)已用作研制甾体激素长效避孕药的载体，用PLA或PLGA制成的含炔诺酮微球注射剂，经临床初步试验证明能维持抗生育药效6个月[1]。我所药化室与浙江大学化学系协作合成了丙交酯乙交酯共聚物(PLGA9∶1)，药剂室制成PLGA-LNG微球长效避孕注射剂。我们对其进行了毒性试验和小鼠、大鼠的抗生育作用研究，结果如下。
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2 材料与方法
2.1 材料
丙交酯乙交酯共聚物由本所药化室合成。丙交酯：乙交酯=9∶1(PLGA 9∶1)。
2.1.1 PLGA浸提液 按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法[2]，取PLGA材料4 g，切成约2 mm×2 mm小块，经自来水冲洗，蒸馏水和生理盐水摇洗后，加入20 ml生理盐水，于121±2 ℃条件下，浸提1 h，过滤后作用。
PLGA空白微球和含左旋18-甲基炔诺酮PLGA微球(LNG含量为19.43%)，LNG微晶由本所药剂室提供，用时以0.5%CMC-Na配成混悬液。
2.1.2 动物 NIH小鼠、SD大鼠、豚鼠和新西兰家兔均由浙江省实验动物中心提供。
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2.2 实验方法
2.2.1 急性全身毒性试验 PLGA浸提液：NIH小鼠20只，体重19～20 g，雌雄各半，随机分成实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠从尾静脉注入PLGA浸提液，对照组小鼠从尾静脉注入与浸提液同批的生理盐水，两组剂量均为50 ml/kg。注射后当即及4、8、24、48、72 h及7 d后，比较观察实验组与对照组动物的状况。
PLGA微球：NIH小鼠20只，体重19～20 g，雌雄各半，随机分为2组，每组10只。实验组皮下注射PLGA微球混悬液10 g/kg，对照组皮下注射溶媒25 ml/kg。注射后当即及4、8、24 h，以后每天1次，连续观察28 d，比较观察实验组与对照组动物的状况。
2.2.2 刺激试验 (1)眼结膜刺激试验：健康雌白兔3只，体重2.4～2.8 kg,按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法操作[2]。将PLGA 0.6%眼生理盐水浸提液滴入兔右眼，左眼滴入空白0.6%生理盐水作对照，每次2～3滴，每天上下午各1次，连续14 d。每次滴后15 min观察有无流泪、充血、分泌物增加等刺激症状。14 d后刮取上下眼睑结膜表皮细胞，涂片、伊红染色，光镜检查，每只眼(包括对照)各涂片2张。(2)肌肉刺激试验：SD大鼠35只，雌性，体重220～240 g，随机分为7组，每组5只，于左腿1次肌注PLGA微球混悬液400 mg/kg，分别于注射后48、72 h，7、14 d，1、3、6Mon各处死1组大鼠，检查注射局部有无充血、红肿、坏死等现象。并取含PLGA微球的肌肉一小块，另取右腿相同部位肌肉一块作对照，以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，H.E染色，作病理检查。
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2.2.3 热源试验 按中国药典法[3]，将饲养在同一环境，喂相同饲料的健康家兔8只，体重2.2～2.8 kg，在试验前7 d预测体温。家兔每1 h以肛温计测量肛门体温1次，共测4次，挑选4次体温均在38.3 ℃～39.6 ℃范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4 ℃的家兔供用。使用的器具置烘箱中250 ℃加热30 min除去热源。测温合格的家兔在试验前禁食2 h，间隔30 min测量3次体温，末两次体温的差数不得超过0.2 ℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。取适用的雌兔3只，在测定正常体温后15 min内，经耳缘静脉缓缓注入温热约37 ℃的PLGA浸提液10 ml/kg。然后每隔1 h，按前法测温1次，共3次。将3次测得的体温减去正常体温，计算各兔体温的各兔体温的升高度数和体温升高总数。
2.2.4 溶血试验 按计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法进行[2]。取新采的兔血20 ml，加2%草酸钾1 ml制备成抗凝兔血。将抗凝兔血8 ml加生理盐水10 ml稀释。取PLGA材料5 g,3份，切成2 mm×2 mm小块，放入试管内，加入生理盐水10 ml。阳性对照用蒸馏水10 ml，阴性用生理盐水10 ml，各3管。将各管置37 ℃水温箱中30 min，每管加稀释兔血0.2 ml,轻轻混匀，置37 ℃水温箱内继续保温1 h。然后取出，各组样品离心5 min(750 g)，取上清液置比色皿内，721分光光度计540 nm测定各管吸光度。阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3。如果阴性对照管的吸光度大于0.03，应重做试验。
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2.2.5 过敏试验 取体重280～320 g豚鼠8只，雌性，随机分成2组，每组4只。1、2两组豚鼠隔日腹腔注射PLGA浸提液1 ml,共3次，1组于首次给药后第14 d，由静脉注射PLGA浸提液1 ml，立即观察动物有无抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛等过敏反应。第2组于首次给药后21 d，静脉注射PLGA浸提液1 ml，观察有无过敏反应。
2.2.6 PLGA-LNG微球对小鼠的避孕作用 NIH雌小鼠70只，体重27～30 g,随着分为7组，每组10只。1组为对照，给溶媒10 ml/kg,2～4组给PLGA-LNG微球混悬液5、10、20 mg/kg(按LNG量计算)，5～7组给LNG微晶混悬液5、10、20 mg/kg。各组均皮下注射，给药后3 d与有生育力的雄鼠合笼，记录合笼至仔鼠出生时间，与对照组比较，计算出避孕天数。
2.2.7 PLGA-LNG微球对大鼠动情周期的抑制作用 按我们以前报道方法进行[4]，用SD大鼠，雌性，体重180～200 g，每天定时采取阴道分泌物涂片镜检，经2个动情周期(9～10)的阴道涂片观察，从中挑选出70只动情周期较规则的大鼠，随机分成7组，每组10只。第1组给溶媒2 ml/kg，第2～4组给PLGA-LNG微球13.1、19.8、30 mg/kg(按LNG量计算)，第5～7组合LNG微晶13.1、19.8、30 mg/kg。各组均肌肉注射，次日起每日定时作阴道涂片检查，以涂片中角化细胞出现作为动情周期恢复日，计算出抑制动情周期天数。
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3 结 果
3.1 急性全身毒性试验
小鼠静脉注射PLGA浸提液50 ml/kg和皮下注射PLGA微球混悬液10 g/kg，在试验过程中各组动物状态良好，体重增加，无死亡，试验组和对照组小鼠情况相似。表明PLGA浸提液和微球无明显毒性。
3.2 刺激试验
3.2.1 眼结膜刺激试验 试验侧和对照侧眼睛情况相似，未见流泪、结膜充血和分泌物增加等现象。两侧眼结膜涂片，光镜检查未见炎性细胞。表明PLGA浸提液对家兔眼结膜无刺激性。
3.2.2 肌肉刺激试验 各组大鼠注射局部未见充血、红肿、坏死等现象。7 d后PLGA微球形成凝块，有膜包绕，与周围组织相隔良好。随着时间的延长，微球在大鼠体内逐渐降解，3个月时解剖大鼠肌肉中尚有较大微球凝块，6个月时大鼠肌肉中微球凝块已很小，大部分降解。病理检查结果表明，大鼠肌注PLGA微球48、72 h，在微球间隙及微球与肌纤维之间可见嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润的炎症反应。7 d后炎症明量减轻，成纤维细胞组成膜已基本包围了微球，但微球与肌纤维间仍有少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞。14 d后在微球与肌纤维间还可见到极少量淋巴细胞。1、3、6 Mon微球由结缔组织包围，周围肌纤维完好，未见炎症反应。
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3.3 热源试验
家兔注射PLGA浸提液后，最大体温升高分别为0.12、0.20、0.21 ℃，均在0.6 ℃以下。3只家兔体温升高总数为1.24 ℃，在1.4 ℃以下。可以认为PLGA材料符合热源检查的规定。
3.4 溶血试验
各个样品在540 nm处测得的吸光度，阳性对照组为0.79、0.82、0.82，平均0.81，阴性对照组为0.01、0.012、0.08，平均0.01，PLGA材料组为0.016、0.01、0.01，平均为0.012。按溶血程度公式计算，PLGA材料的溶血度为0.25%，小于5%，符合医用材料的溶血试验要求。
3.5 过敏试验
两组豚鼠均未见过敏反应症状，表明PLGA无过敏作用。
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3.6 对小鼠的避孕作用
结果见表1。
表1 PLGA-LNG微球和LNG微晶对小鼠的避孕作用
Table 1 Antifertility effect of PLGA-LNG microsphere and LNG microcrystal Groups
Dosage
(LNG mg/kg)
No.of
animals
Time of fertility
(days，
±s), http://www.100md.com
Days of
contraception(d)
control
10(ml/kg)
10
24.3±2.8
PLGA-LNG
5
10
35.8±10.7* * ▲
11.5
microsphere
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10
10
58.9±13.1* * * ▲ ▲
34.6
20
10
105.5±16.9* * * ▲ ▲
81.2
LNG
5
10
24.6±3.1
, http://www.100md.com
0.3
microcrystal
10
10
31.8±8.4*
7.5
20
10
40.7±9.0* *
16.4
Compared with control * P<0.05；* * P<0.01；* * *P<0.001；Compared with LNG microcrystal ▲ P<0.01；▲ ▲ P<0.001
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由表1可见，皮下注射PLGA-LNG微球和LNG微晶组的小鼠平均生育时间均较对照组长，说明两者都有避孕作用。但两者相比，PLGA-LNG微球的避孕效果明显优于LNG微晶。
3.7 对大鼠动情周期的抑制作用
结果见表2。表2 PLGA-LNG微球和LNG微晶对大鼠动情期的抑制作用
Table 2 Suppression of estrus cycle of rat by PLGA-LNG microphere and LNG microcrystal Groups
Dosage
(LNG mg/kg)
No.of
, 百拇医药 animals
Duration of estrus suppression
(days，
±s)control
2(ml/kg)
10
0
PLGA-LNG
13.1
10
76.3±9.5*
, http://www.100md.com
microsphere
19.8
10
104.1±48.6*
30.0
10
131.8±50.0*
LNG
13.1
10
25.5±4.8
microcrystal
, 百拇医药
19.8
10
33.2±3.8
30.0
10
38.4±6.0
Compared with LNG microcrystal * P<0.01
由表2说明PLGA-LNG微球和LNG微晶对大鼠动，情周期均有抑制作用，两者比较，PLGA-LNG微球作用明显强于LNG微晶。
4 讨 论
上述实验结果表明，PLGA材料无明显毒性，对组织无刺激性、无热源作用、无溶血作用、无致敏作用，有良好的生物相容性。伏晓敏等[5]报道，PLGA无细胞毒性，微核和Ames试验阴性。PLGA-LNG微球和LNG微晶制剂对大、小鼠抗生育试验结果显示，PLGA-LNG微球的抗生育作用较LNG微晶显著增强，有长效抗生育作用。PLGA作为一种新型的缓释避孕药载体，值得进一步研究。
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药代动力学研究结果表明[6]，PLGA-LNG微球im后可形成一维时长达100 d的相对平稳血药水平，其抗生育有效浓度达168 d，较LNG微晶长4倍，具有明显的缓释长效作用。而且PLGA-LNG注射后，初始血药峰值可有明显下降，有利于消除药物浓度过高所致的不良反应。国外用PLA和PLGA为载体研制的含炔诺酮的微球注射剂，1次给药避孕时间为6个月，而我们研制的PLGA-LNG微球注射剂，从动物抗生育试验和药代动力学结果看，可望达到6个月的避孕效果。你们合成的PLGA(9∶1)初步试验结果，体内降解期为7～9个月，与Beck等[7]报道相一致。如以6个月注射一次，当PLGA中LNG释放完后，PLGA也随之降解完了，无蓄积之色，可以连续使用。
新型的可生物降解的PLGA-LNG微球注射剂是一种长效、方便、安全的避孕制剂，具有广阔的应用前景。但该注射剂是计划生育用药，使用者均为正常妇女，所以在进行临床试用前，还需进行长期毒性和生殖毒性等试验，以确保使用者的安全。
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国家计生委资助项目(93-0-30)和浙江省卫生厅基金资助项目(95028)
参考文献
1，Beck LR,Ramos RA,Flowers CE et al.Clinical evaluation of injectable biodegradable contraceptive system.Am J Obstet Gynecol,1981;140∶799
2，上海生物材料研究测试中心.计划生育用高分子材料的生物学性能评价方法(暂行标准草案).1990
3，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典，二部，附录.北京：化学工业出版社，人民卫生出版社，1985；86
4，沈文照、韩锦文，林毓颖等.醋炔诺酮肟顺、反式异构体的分离、鉴别与其抗生育活性的比较.生殖与避孕，1989；9(1)∶46
, 百拇医药
5，伏晓敏、乐俊仪，左旋18甲及炔诺酮微球及其生物材料致突变性及细胞毒性.浙江省医学科学院学报，1991；2(1)∶20
6，章利春、桑国卫、邵庆翔.生物降解型左旋18-甲基炔诺酮微球在大鼠的药代动力学.药学学报，1994；29(8)∶561
7，Beck LR,Pope VZ,Cowsar DR et al.Poly(DL-Lactide-co-glycolide)/Norethisterone Microcapsules:An injectable biodegradable contraceptive.Biol Reprod,1983;28∶186
(收稿：1998-11-10), 百拇医药