O139、O1群霍乱弧菌分子遗传特征研究
作者：王军 于玺华 徐桂永 李伯安 王全立 李永刚 姜天俊 李元治
单位：100039 北京，解放军第302医院(王军、于玺华、李伯安、李永刚、姜天俊、李元治)；解放军医学高等专科学校(徐桂永)；军事医学科学院二所(王全立)
关键词：弧菌，霍乱；聚合酶链反应；序列分析，DNA；随机扩增多态性DNA
中华传染病杂志/990203 摘要 目的 探讨O139群、O1群霍乱弧菌分子遗传特征及其相互关系。方法 用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析及随机扩增多态性DNA(RAPD)，检测了3株O139群、3株O1群El Tor生物型和2株古典生物型霍乱弧菌。结果 3株O139群和5株O1群霍乱弧菌均扩增出566bp的DNA片段，DNA序列源于霍乱肠毒素(ctx)A2-B基因。RAPD产生的两种DNA指纹图谱一致显示O139群与O1群El Tor生物型遗传特征极其相似，与古典生物型略有区别。结论 O139群与O1群El Tor型存在密切的种系进化关系，前者可能由O1群El Tor生物型进化而来。
, http://www.100md.com
Study on the inherent molecular characteristics of
serogroup O139 and O1 of Vibrio cholera
WANG Jun, YU Xihua, XU Guiyong, et al. The 302th Hospital of PLA, Beijing 100039
Abstract Objective To study the inherent characteristics of Vibrio cholera O139 and O1 serogroup and the relationship between them.Methods Polymerase chain reaction (PCR), DNA sequences analysis and randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) were used to test 3 strains of O139 serogroup, 3 strains of O1 El Tor biotype and 2 strains of classical biotype.Results The specific 566bp DNA segments were amplified of 3 strains of O139 serogroup and 5 strains of O1 serogroup, which were consistent with the genomic sequence of ctx A2-B. The two kinds of DNA fingerprints of RAPD amplified respectively by two primers showed that the inherent characteristics of O139 were almost same with the O1 El Tor biotype, while slight different with O1 classical biotype. Conclusion O139 serogroup and O1 El Tor biotype kept close inherent identity in evolution, and it is possible for O139 to evolute from O1 El Tor.
, 百拇医药
Key words Vibrio cholerae PCR Sequence analysis,DNA Randomly amplified polymorphic DNA
O1群霍乱弧菌能产生霍乱肠毒素(ctx)，引起人类剧烈腹泻。曾在世界较大范围引起霍乱病多次流行。1992年出现新型霍乱弧菌O139群，由其引起的霍乱病迅速在印度等国流行[1,2]。O139群和O1群霍乱弧菌的生物遗传特征及相互关系的研究引起了人们高度重视。本实验用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析和随机扩增多态性DNA(RAPD)对国内外O139和O1群霍乱弧菌分子遗传特征及其相互关系进行探讨，现报道如下。
材料和方法
一、菌株
见表1。
表1 菌株来源及序号 菌号
, http://www.100md.com
菌株
贮菌号
生物型
血清型
来源
1
O139群
1994年分离自我国北方某地
2
O139群
同上
3
O139群
, 百拇医药
M045(印度)
中国预防医学科学院流行病研究所
4
O1群
El Tor
小川
1994年分离自我国北方某地
5
O1群
86006-10
古典
小川
军事医学科学院微生物研究所
, http://www.100md.com
6
O1群
860071
古典
稻叶
同上
7
O1群
173-10544
El Tor
小川
同上
8
, http://www.100md.com
O1群
650-374
El Tor
小川
同上
9
大肠杆菌
(腹水标本分离)
本院微生物室提供
10
大肠杆菌
(腹水标本分离)
同上
, 百拇医药
二、PCR扩增
PCR引物按ctx A2-B亚单位基因设计[3]， 上游引物P1 5′-TAGAGCTTGGAGGGAAGAGC CGT(1082-1104)，下游引物P2 5′-ATTGCGGCAATCGCATGAGGCGT(1647-1625)，DNA提取方法、PCR扩增仪及条件同文献[4]。各种试剂购于北京天象人生物公司。
三、DNA序列分析
PCR扩增DNA片段用美国Clontech公司Advantage PCR-Pure Kit纯化，用美国PE公司Genetic Analyzer进行DNA序列分析。
四、随机扩增多态性DNA
分别采用PCR扩增的ctx A2-B基因的下游引物P2和随机引物P3 GGGGTGACGA作为RAPD的随机引物。引物浓度2pmol,94°C,60秒，72°C，120秒，36°C，60秒，40个循环，其它同文献[4]。
, 百拇医药
结果
一、PCR
3株O139群、3株O1群El Tor生物型和2株古典生物型，均扩增出566bp的DNA片段，见图1。2株大肠杆菌扩增阴性。
图1 PCR：1.El Tor(8号)；2. El Tor(7号)；3.古典型(6号)；4.古典型(5号)；5. El Tor(4号)；6. O139(3号，印度)；7. O139(2号)；8. O139(1号)；9.核酸分子量标准
二、DNA序列分析
O139群、O1群El Tor生物型和古典生物型扩增的566bp DNA片段DNA序列与文献[3]ctx A2-B基因序列基本一致，各生物型之间DNA序列无大的变异。
, 百拇医药
三、RAPD
两种引物产生的DNA指纹图谱一致显示O139群与O1群El Tor生物型分子构象几乎完全相同。O1群古典生物型有两条完全不同的片段，其中图2最清晰。国外株O139群DNA指纹图谱与国内株O139在图3无明显差异。大肠杆菌的DNA指纹图谱与霍乱弧菌有明显的区别。见图2、3。
图2 RAPD(P2)；1. 大肠杆菌(10号)；2.大肠杆菌(9号)；3. El Tor(8号)；4. El Tor(7号)；5. 古典型(6号)；6. 古典型(5号)；7. El Tor(4号)；8. O139(2号)；9. O139(1号)；10. λDNA Est Ⅱ
图3 RAPD(P3)：1.大肠杆菌(10号)；2.大肠杆菌(9号)；3.El Tor(8号)；4.El Tor(7号)；5. 古典型(6号)；6. 古典型(5号)；7. El Tor(4号)；8. O139(3号，印度)；9.O139(2号)；10.O139(1号)
, 百拇医药
讨论
霍乱是一种烈性传染病，曾在世界范围发生七次大流行[1]。O1群霍乱弧菌是引起霍乱病的致病原。然而，1992年出现了非O1群霍乱弧菌O139群，由其引起的霍乱病迅速在东南亚地区流行[1，2]。O139群具有不同的O抗原，它能产生霍乱肠毒素等毒力因子[5]。任少堂等[6]用PCR检测ctxA1亚单位基因证实O139群的ctx基因结构与O1群完全相同。本实验采用了ctx A2-B亚单位基因作为靶序列，3株O139群和5株O1群均扩增出特异的566bp DNA片段，DNA序列分析证实该片段源于ctx A2-B亚单位基因[3]，结果进一步证实O139群的ctx基因结构与O1群完全相同。
RAPD是一种较新的分子生物学方法[7，8]，它是在PCR的基础上，选择随机引物扩增产生DNA指纹图谱。该图谱遵循着孟德尔的遗传定律，具有属、种、群及亚群的遗传特征，适用于DNA结构不清楚的生物体检测。因此，RAPD在生物分类中得到广泛应用。本实验采用RAPD，以两种引物分别产生的DNA指纹图谱，显示O139群与O1群El Tor生物型遗传特征几乎完全相同，而与古典型略有区别。后者有两条完全不同的DNA片段，其中以图2最清晰。结果表明O139群与O1群El Tor生物型存在密切的种系进化关系，而与古典生物的遗传距离较远。国外O139株与国内O139株分子构象无明显差异。
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1961年以后霍乱流行株从古典生物型转变成El Tor生物型，1992年又出现O139群霍乱弧菌，并引发霍乱病流行[1，2]。在生存能力上，古典生物型[9]。结合本实验结果，推测O139群可能由O1群El Tor生物型进化而来。其O抗原不同是否可用抗原漂流来解释，有待于探讨。在流行区域上，O139群主要在东南亚地区流行，与El Tor生物型并存。而拉美国家从未有O139群流行[2]。这种地区流行趋势提示环境因素在细菌种系进化中起了重要作用，造成了生物进化的多态性。近年来O139群的流行趋势减弱，但是该病原及其它变异株引起霍乱病流行的危险性仍然存在。在遗传学上对霍乱弧菌变异株进行监测有利于该病的预防。
本实验采用扩增ctx A2-B特异片段的下游引物，作为RAPD的随机引物，由其产生的DNA指纹图谱与随机引物(P3)同样能显示生物体的遗传特征。采用这种引物既可以用于PCR扩增特异DNA片段，又可以用于RAPD，节省费用，减少了引物筛选的工作量。该方法重复性好、简便、快捷、敏感，产生的DNA指纹图谱清晰可辨，适用于大量样本的检测，在流行病学调查及细菌鉴定分型中有较强的实用性。
, 百拇医药
参考文献
1 WHO Cholera in 1992. Wkly Epidemi Rec, 1993, 68:141-142.
2 WHO Cholera in 1994. Wkly Epidemi Rec, 1995, 70:201-208.
3 Yamamoto T, Gojobori T, Yokota T, et al. Evolutionary origin of pathogenic determinants in enterotoxi genic escherichia coli and vibrio cholera O1. J Bacteriology, 1987, 169:1352-1357.
4 王军，刘耀清，虞爱华，等.聚合酶链反应直接检测粪便中志贺氏菌和侵袭性大肠肝菌.中华传染病杂志，1995，13：208-210.
, 百拇医药
5 Waldor MK, Mokalanos JJ. ToxR regulates virulence gene expression in non-O1 strains of vibro cholerae that cause epidemic cholerae. Infect Immun, 1994, 62:72-78.
6 任少堂，秦一中，张晓琴，等.聚合酶链反应检测O1霍乱弧菌A亚单位基因.中华传染病杂志，1996，14：77-80.
7 Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 1990, 18:6531-6535.
8 Welsh J, Mc Clelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 1990, 18:7213-7218.
9 江丽君，乔榕，王燕，等.O1群与非O1群O139型霍乱弧菌毒力的对比研究.微生物免疫学进展，1995，23：1-11.
收稿：1998-04-22 修回：1998-09-28, 百拇医药
单位：100039 北京，解放军第302医院(王军、于玺华、李伯安、李永刚、姜天俊、李元治)；解放军医学高等专科学校(徐桂永)；军事医学科学院二所(王全立)
关键词：弧菌，霍乱；聚合酶链反应；序列分析，DNA；随机扩增多态性DNA
中华传染病杂志/990203 摘要 目的 探讨O139群、O1群霍乱弧菌分子遗传特征及其相互关系。方法 用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析及随机扩增多态性DNA(RAPD)，检测了3株O139群、3株O1群El Tor生物型和2株古典生物型霍乱弧菌。结果 3株O139群和5株O1群霍乱弧菌均扩增出566bp的DNA片段，DNA序列源于霍乱肠毒素(ctx)A2-B基因。RAPD产生的两种DNA指纹图谱一致显示O139群与O1群El Tor生物型遗传特征极其相似，与古典生物型略有区别。结论 O139群与O1群El Tor型存在密切的种系进化关系，前者可能由O1群El Tor生物型进化而来。
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Study on the inherent molecular characteristics of
serogroup O139 and O1 of Vibrio cholera
WANG Jun, YU Xihua, XU Guiyong, et al. The 302th Hospital of PLA, Beijing 100039
Abstract Objective To study the inherent characteristics of Vibrio cholera O139 and O1 serogroup and the relationship between them.Methods Polymerase chain reaction (PCR), DNA sequences analysis and randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) were used to test 3 strains of O139 serogroup, 3 strains of O1 El Tor biotype and 2 strains of classical biotype.Results The specific 566bp DNA segments were amplified of 3 strains of O139 serogroup and 5 strains of O1 serogroup, which were consistent with the genomic sequence of ctx A2-B. The two kinds of DNA fingerprints of RAPD amplified respectively by two primers showed that the inherent characteristics of O139 were almost same with the O1 El Tor biotype, while slight different with O1 classical biotype. Conclusion O139 serogroup and O1 El Tor biotype kept close inherent identity in evolution, and it is possible for O139 to evolute from O1 El Tor.
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Key words Vibrio cholerae PCR Sequence analysis,DNA Randomly amplified polymorphic DNA
O1群霍乱弧菌能产生霍乱肠毒素(ctx)，引起人类剧烈腹泻。曾在世界较大范围引起霍乱病多次流行。1992年出现新型霍乱弧菌O139群，由其引起的霍乱病迅速在印度等国流行[1,2]。O139群和O1群霍乱弧菌的生物遗传特征及相互关系的研究引起了人们高度重视。本实验用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析和随机扩增多态性DNA(RAPD)对国内外O139和O1群霍乱弧菌分子遗传特征及其相互关系进行探讨，现报道如下。
材料和方法
一、菌株
见表1。
表1 菌株来源及序号 菌号
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菌株
贮菌号
生物型
血清型
来源
1
O139群
1994年分离自我国北方某地
2
O139群
同上
3
O139群
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M045(印度)
中国预防医学科学院流行病研究所
4
O1群
El Tor
小川
1994年分离自我国北方某地
5
O1群
86006-10
古典
小川
军事医学科学院微生物研究所
, http://www.100md.com
6
O1群
860071
古典
稻叶
同上
7
O1群
173-10544
El Tor
小川
同上
8
, http://www.100md.com
O1群
650-374
El Tor
小川
同上
9
大肠杆菌
(腹水标本分离)
本院微生物室提供
10
大肠杆菌
(腹水标本分离)
同上
, 百拇医药
二、PCR扩增
PCR引物按ctx A2-B亚单位基因设计[3]， 上游引物P1 5′-TAGAGCTTGGAGGGAAGAGC CGT(1082-1104)，下游引物P2 5′-ATTGCGGCAATCGCATGAGGCGT(1647-1625)，DNA提取方法、PCR扩增仪及条件同文献[4]。各种试剂购于北京天象人生物公司。
三、DNA序列分析
PCR扩增DNA片段用美国Clontech公司Advantage PCR-Pure Kit纯化，用美国PE公司Genetic Analyzer进行DNA序列分析。
四、随机扩增多态性DNA
分别采用PCR扩增的ctx A2-B基因的下游引物P2和随机引物P3 GGGGTGACGA作为RAPD的随机引物。引物浓度2pmol,94°C,60秒，72°C，120秒，36°C，60秒，40个循环，其它同文献[4]。
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结果
一、PCR
3株O139群、3株O1群El Tor生物型和2株古典生物型，均扩增出566bp的DNA片段，见图1。2株大肠杆菌扩增阴性。
图1 PCR：1.El Tor(8号)；2. El Tor(7号)；3.古典型(6号)；4.古典型(5号)；5. El Tor(4号)；6. O139(3号，印度)；7. O139(2号)；8. O139(1号)；9.核酸分子量标准
二、DNA序列分析
O139群、O1群El Tor生物型和古典生物型扩增的566bp DNA片段DNA序列与文献[3]ctx A2-B基因序列基本一致，各生物型之间DNA序列无大的变异。
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三、RAPD
两种引物产生的DNA指纹图谱一致显示O139群与O1群El Tor生物型分子构象几乎完全相同。O1群古典生物型有两条完全不同的片段，其中图2最清晰。国外株O139群DNA指纹图谱与国内株O139在图3无明显差异。大肠杆菌的DNA指纹图谱与霍乱弧菌有明显的区别。见图2、3。
图2 RAPD(P2)；1. 大肠杆菌(10号)；2.大肠杆菌(9号)；3. El Tor(8号)；4. El Tor(7号)；5. 古典型(6号)；6. 古典型(5号)；7. El Tor(4号)；8. O139(2号)；9. O139(1号)；10. λDNA Est Ⅱ
图3 RAPD(P3)：1.大肠杆菌(10号)；2.大肠杆菌(9号)；3.El Tor(8号)；4.El Tor(7号)；5. 古典型(6号)；6. 古典型(5号)；7. El Tor(4号)；8. O139(3号，印度)；9.O139(2号)；10.O139(1号)
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讨论
霍乱是一种烈性传染病，曾在世界范围发生七次大流行[1]。O1群霍乱弧菌是引起霍乱病的致病原。然而，1992年出现了非O1群霍乱弧菌O139群，由其引起的霍乱病迅速在东南亚地区流行[1，2]。O139群具有不同的O抗原，它能产生霍乱肠毒素等毒力因子[5]。任少堂等[6]用PCR检测ctxA1亚单位基因证实O139群的ctx基因结构与O1群完全相同。本实验采用了ctx A2-B亚单位基因作为靶序列，3株O139群和5株O1群均扩增出特异的566bp DNA片段，DNA序列分析证实该片段源于ctx A2-B亚单位基因[3]，结果进一步证实O139群的ctx基因结构与O1群完全相同。
RAPD是一种较新的分子生物学方法[7，8]，它是在PCR的基础上，选择随机引物扩增产生DNA指纹图谱。该图谱遵循着孟德尔的遗传定律，具有属、种、群及亚群的遗传特征，适用于DNA结构不清楚的生物体检测。因此，RAPD在生物分类中得到广泛应用。本实验采用RAPD，以两种引物分别产生的DNA指纹图谱，显示O139群与O1群El Tor生物型遗传特征几乎完全相同，而与古典型略有区别。后者有两条完全不同的DNA片段，其中以图2最清晰。结果表明O139群与O1群El Tor生物型存在密切的种系进化关系，而与古典生物的遗传距离较远。国外O139株与国内O139株分子构象无明显差异。
, http://www.100md.com
1961年以后霍乱流行株从古典生物型转变成El Tor生物型，1992年又出现O139群霍乱弧菌，并引发霍乱病流行[1，2]。在生存能力上，古典生物型
本实验采用扩增ctx A2-B特异片段的下游引物，作为RAPD的随机引物，由其产生的DNA指纹图谱与随机引物(P3)同样能显示生物体的遗传特征。采用这种引物既可以用于PCR扩增特异DNA片段，又可以用于RAPD，节省费用，减少了引物筛选的工作量。该方法重复性好、简便、快捷、敏感，产生的DNA指纹图谱清晰可辨，适用于大量样本的检测，在流行病学调查及细菌鉴定分型中有较强的实用性。
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参考文献
1 WHO Cholera in 1992. Wkly Epidemi Rec, 1993, 68:141-142.
2 WHO Cholera in 1994. Wkly Epidemi Rec, 1995, 70:201-208.
3 Yamamoto T, Gojobori T, Yokota T, et al. Evolutionary origin of pathogenic determinants in enterotoxi genic escherichia coli and vibrio cholera O1. J Bacteriology, 1987, 169:1352-1357.
4 王军，刘耀清，虞爱华，等.聚合酶链反应直接检测粪便中志贺氏菌和侵袭性大肠肝菌.中华传染病杂志，1995，13：208-210.
, 百拇医药
5 Waldor MK, Mokalanos JJ. ToxR regulates virulence gene expression in non-O1 strains of vibro cholerae that cause epidemic cholerae. Infect Immun, 1994, 62:72-78.
6 任少堂，秦一中，张晓琴，等.聚合酶链反应检测O1霍乱弧菌A亚单位基因.中华传染病杂志，1996，14：77-80.
7 Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 1990, 18:6531-6535.
8 Welsh J, Mc Clelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 1990, 18:7213-7218.
9 江丽君，乔榕，王燕，等.O1群与非O1群O139型霍乱弧菌毒力的对比研究.微生物免疫学进展，1995，23：1-11.
收稿：1998-04-22 修回：1998-09-28, 百拇医药