含变链菌Pac蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
作者：彭志翔 钟燕 樊明文 边专
单位：彭志翔(武汉市同济医院口腔医学中心，430030)；钟燕(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)；樊明文(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)；边专(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)
关键词：
中华口腔医学杂志0000528 人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc，由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子，因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后，再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒，从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.目的片段的体外扩增：从pac基因中选定包含两个主要免疫活性区(A区及P区) 的编码DNA序列, 同时弃用与人IgG有相同抗原决定簇的C末端区域及非免疫活性区，设计出带酶切位点以及起始、终止密码的一对引物。以含pac基因的重组质粒pPC41(日本Nakano教授赠)为模板，PCR扩增目的片段，扩增产物进行酶切鉴定。
2.PCR产物对质粒pGEM-T的亚克隆：将载体pGEM-T(美国Promega公司)与扩增产物进行T-A克隆连接后转化感受态JM109，转化产物铺于IPTG/X-Gal琼脂平板，由蓝白菌落识别出可能带阳性重组体的单菌落，培养后提取质粒，经电泳初筛及酶切鉴定确定阳性重组质粒G3。
3.目的片段对表达质粒pCI的克隆：将G3酶切后，低熔点琼脂糖电泳回收目的片段，与同组酶切后的pCI质粒(日本Koide教授赠)进行粘-平端定向连接。将连接产物转化入感受态JM109，提取质粒后进行酶切鉴定。
, 百拇医药
4.对重组质粒作DNA测序及计算机分析。
二、结果
选择PAc基因中含编码重要抗原决定簇的保守区域 (A区及P区)的DNA序列,设计出两端带有酶切位点及起始、终止密码的引物, PCR扩增出2.2 kb DNA片段,经酶切电泳分析确定为目的片段后，将PCR产物亚克隆入中间载体pGEM-T，通过α-互补筛选及酶切鉴定出阳性重组质粒， 从其中切下目的片段，通过粘-平端连接反应将目的片段插入哺乳动物表达质粒pCI ，定向克隆构建成重组质粒pCIA-P。DNA序列测定证实目的DNA片段插入位置准确，运用计算机分析软件包将所测插入片段DNA序列与pac基因对应区域作同源性分析，两者核苷酸同源性为99.69%；所编码氨基酸序列同源性为94.49%。
三、讨论
S.mutans由于与龋病的高度相关性而为研究者们所重视。其细胞表面蛋白PAc由于参与介导细菌与牙表面获得性膜之间的粘附，同时又没有全菌疫苗与哺乳动物心肌交叉免疫反应的缺点，因而被视为构建防龋疫苗的合适抗原。国外学者研究发现，PAc分子内的两个高度保守区域A区与P区为该蛋白的免疫功能区，并指出它们对制备防龋疫苗有重要意义[1-3]。
, 百拇医药
DNA疫苗是90年代初出现的一种全新免疫预防概念，其具有长期稳定表达抗原蛋白，在宿主体内表达的蛋白与天然构象更为接近等优点，该技术为龋病的免疫预防开辟了新的途径。本研究将S.mutans的重要毒力因子PAc蛋白编码基因中的免疫功能区域克隆入带有强启动子的哺乳动物表达质粒，构建出可进行抗S.mutans主动免疫研究的重组DNA，为探索DNA疫苗预防龋病的途径完成了重要的准备工作。
参考文献
1，Okahashi N, Tkahashi J, Nakai M, et al. Identification of antigenic epitopes in an alanine-rich repeating region of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Infect Immun, 1993, 61：1 301-1306.
, http://www.100md.com
2，Matsushita K, Nisizawa T, Nagaoka S, et al. Identification of antigenic epitopes in a surface protein antigen of Streptococcus mutans in humans. Infect Immun, 1994, 62:4 034-4 042.
3，Brandy LJ, Cvitkovitch DG, Geric CM, et al. Deletion of the central proline-rich repeat domain results in altered antigenicity and lack of surface expression of the Streptococcus mutans P1 adhesin molecule. Infect Immun, 1998, 66:4 274-4 282.
(收稿日期：2000-01-17), 百拇医药
单位：彭志翔(武汉市同济医院口腔医学中心，430030)；钟燕(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)；樊明文(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)；边专(武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔内科 430079)
关键词：
中华口腔医学杂志0000528 人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc，由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子，因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后，再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒，从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.目的片段的体外扩增：从pac基因中选定包含两个主要免疫活性区(A区及P区) 的编码DNA序列, 同时弃用与人IgG有相同抗原决定簇的C末端区域及非免疫活性区，设计出带酶切位点以及起始、终止密码的一对引物。以含pac基因的重组质粒pPC41(日本Nakano教授赠)为模板，PCR扩增目的片段，扩增产物进行酶切鉴定。
2.PCR产物对质粒pGEM-T的亚克隆：将载体pGEM-T(美国Promega公司)与扩增产物进行T-A克隆连接后转化感受态JM109，转化产物铺于IPTG/X-Gal琼脂平板，由蓝白菌落识别出可能带阳性重组体的单菌落，培养后提取质粒，经电泳初筛及酶切鉴定确定阳性重组质粒G3。
3.目的片段对表达质粒pCI的克隆：将G3酶切后，低熔点琼脂糖电泳回收目的片段，与同组酶切后的pCI质粒(日本Koide教授赠)进行粘-平端定向连接。将连接产物转化入感受态JM109，提取质粒后进行酶切鉴定。
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4.对重组质粒作DNA测序及计算机分析。
二、结果
选择PAc基因中含编码重要抗原决定簇的保守区域 (A区及P区)的DNA序列,设计出两端带有酶切位点及起始、终止密码的引物, PCR扩增出2.2 kb DNA片段,经酶切电泳分析确定为目的片段后，将PCR产物亚克隆入中间载体pGEM-T，通过α-互补筛选及酶切鉴定出阳性重组质粒， 从其中切下目的片段，通过粘-平端连接反应将目的片段插入哺乳动物表达质粒pCI ，定向克隆构建成重组质粒pCIA-P。DNA序列测定证实目的DNA片段插入位置准确，运用计算机分析软件包将所测插入片段DNA序列与pac基因对应区域作同源性分析，两者核苷酸同源性为99.69%；所编码氨基酸序列同源性为94.49%。
三、讨论
S.mutans由于与龋病的高度相关性而为研究者们所重视。其细胞表面蛋白PAc由于参与介导细菌与牙表面获得性膜之间的粘附，同时又没有全菌疫苗与哺乳动物心肌交叉免疫反应的缺点，因而被视为构建防龋疫苗的合适抗原。国外学者研究发现，PAc分子内的两个高度保守区域A区与P区为该蛋白的免疫功能区，并指出它们对制备防龋疫苗有重要意义[1-3]。
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DNA疫苗是90年代初出现的一种全新免疫预防概念，其具有长期稳定表达抗原蛋白，在宿主体内表达的蛋白与天然构象更为接近等优点，该技术为龋病的免疫预防开辟了新的途径。本研究将S.mutans的重要毒力因子PAc蛋白编码基因中的免疫功能区域克隆入带有强启动子的哺乳动物表达质粒，构建出可进行抗S.mutans主动免疫研究的重组DNA，为探索DNA疫苗预防龋病的途径完成了重要的准备工作。
参考文献
1，Okahashi N, Tkahashi J, Nakai M, et al. Identification of antigenic epitopes in an alanine-rich repeating region of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Infect Immun, 1993, 61：1 301-1306.
, http://www.100md.com
2，Matsushita K, Nisizawa T, Nagaoka S, et al. Identification of antigenic epitopes in a surface protein antigen of Streptococcus mutans in humans. Infect Immun, 1994, 62:4 034-4 042.
3，Brandy LJ, Cvitkovitch DG, Geric CM, et al. Deletion of the central proline-rich repeat domain results in altered antigenicity and lack of surface expression of the Streptococcus mutans P1 adhesin molecule. Infect Immun, 1998, 66:4 274-4 282.
(收稿日期：2000-01-17), 百拇医药