双歧杆菌脂磷壁酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响
作者：王跃 邓一平 胡宏
单位：400016 重庆医科大学临床微生物学教研室
关键词：双歧杆菌；HL-60细胞；端粒酶
中华微生物学和免疫学杂志000411 【 摘要 】 目的 探讨双歧杆菌表面分子脂磷壁酸(LTA)对体外培养的HL-60白血病细胞端粒酶活性的影响。 方法 采用PCR-ELISA法检测经LTA处理前后的HL-60白血病细胞株端粒酶活性的改变。 结果 经LTA处理后，HL-60白血病细胞的生长受到抑制，端粒酶活性明显降低。 结论 双歧杆菌LTA对HL-60白血病细胞具有生长抑制作用，其抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞的端粒酶活性有关。
Effects to telomerase activity by lipoteichoic acids of Bifidobacterium in HL-60 cells
, http://www.100md.com
WANG Yue, DENG Yiping, HU Hong
(Department of Clinical Microbiology, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To investigate effects to telomerase activity by lipoteichoic acids (LTA) of Bifidobacterium in HL-60 cells in culture. Methods MTT assay was used to investigate the inhibitory effect of LTA on HL-60 cell in culture. The telomerase activity in cells treated by LTA was detected by PCR-ELISA assay which is based upon PCR amplification of the initial telomerase product and detected by ELISA. Results The growth of HL-60 cells was inhibited by 20μg/ml LTA and the inhibitory effect was time-and dose-dependent. After being treated with 40μg/ml LTA for 3 days, the telomerase activity in HL-60 cells was significantly reduced to about 34.2% of that in untreated control. Conclusion The lipoteichoic acids of Bifidobacterium could directly inhibit the growth of HL-60 cells. The mechanism of anti-tumor by lipoteichoic acid may be explained by the inhibition of telomerase activity in cells by LTA.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Bifidobacterium; HL-60 cells; Telomerase
端粒(telomere)是真核生物染色体末端的一种保护性结构，在维持染色体的稳定性和一致性等方面具有重要作用。正常人体细胞由于周期性复制而使端粒的长度逐渐缩短。端粒酶(Telomerase)是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶, 它能够利用自身携带的RNA作为模板逆转录合成端粒，从而维持端粒的长度，使细胞获得无限增殖的能力，成为永生化细胞。大多数肿瘤细胞都表现出较高的端粒酶活性。正常体细胞由于缺乏端粒酶活性，其端粒随着细胞分裂逐渐缩短，细胞逐渐老化、死亡。大量研究表明，端粒酶活性与肿瘤的发生有密切关系，抑制端粒酶活性可以抑制肿瘤细胞的生长。因此，寻找端粒酶抑制剂正逐渐受到人们的关注〔1-4〕。 双歧杆菌是人体肠道内的正常菌群，其抗肿瘤作用已经得到肯定〔5,6〕，对其抗肿瘤机制也进行了广泛研究，主要认为双歧杆菌通过增强机体的免疫功能而间接发挥抗肿瘤作用，对其表面分子在抗肿瘤中的直接作用研究尚少。本实验通过测定双歧杆菌LTA处理后HL-60白血病细胞端粒酶活性的变化，探讨双歧杆菌LTA对肿瘤细胞端粒酶的影响，为进一步研究双歧杆菌的抗肿瘤机制提供依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
双歧杆菌脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)的制备：分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum, B.bifidum)由本室分离保存，经中国科学院微生物研究所鉴定。LTA由本室按Sutcliffe等〔7〕的方法从B.bifidum中提取，-20℃保存。
细胞株：人早幼粒白血病细胞株HL-60由军事医学科学院药理研究室提供。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃ 5%CO2条件下培养，2～3d换液传代。
主要试剂
(1)Telomerase PCR ELISA试剂盒：购自德国Boehringer Mannheim公司。
(2)MTT：Sigma公司产品。
, 百拇医药
MTT显色法测定LTA对HL-60细胞的生长抑制作用：HL-60细胞以5×104/ml接种96孔培养板，每孔100μl，重复3 孔，于37℃ 5%CO2条件下培养24h ，换液，分别加入含不同浓度LTA的培养液，每孔200μl，继续培养至所需时间后，参照Saladowski〔8〕的方法作MTT显色法测定，计算LTA对肿瘤细胞的抑制率。
端粒酶活性测定
(1)细胞处理：取对数生长期细胞，以105/ml密度接种于100ml培养瓶内，加入含40μg/ml LTA的RPMI 1640培养液，置37℃ 5%CO2培养1～5d。
(2)端粒酶提取：收集待测细胞，用台盼蓝拒染法计数，取106个细胞于Eppendorf管内，用PBS洗涤2次，每次4℃ 3000×g离心10min。弃上清，加入200μl CHAPS裂解液，冰浴30min，4℃ 12000×g 离心20min，小心移取上清液于新的Eppendorf管，-80℃保存待测。
, 百拇医药
(3)RT-PCR扩增：按试剂盒说明书进行。取上述提取物2μl，反应混合液25μl，加入DEPC处理的无菌重蒸水至总体积50μl，并按以下步骤循环：25℃ 30min循环1次，94℃ 5min循环1次，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s，循环30次，再经72℃ 10min后置4℃保存。
(4)扩增产物的检测：取扩增产物5μl加入20μl变性液中，室温放置10min，再加入225μl杂交混合液，充分混匀，取100μl加入亲和素包被的酶标板内，37℃振荡孵育2h，加入抗DIG-POD的抗体与之作用，最后加入POD的底物TMB显色，加入中止液中止反应，在自动酶标仪上测定450nm和690nm的吸光度(A)值。按A值＝A450-A690计算。
结果
1.双歧杆菌LTA对HL-60的抑制作用：不同浓度LTA对HL-60 细胞的生长抑制作用见图1。结果显示，不同浓度LTA对HL-60细胞均有明显的生长抑制作用，且LTA的浓度越大，作用的时间越长，对HL-60细胞的抑制作用越强。仅 20μg/ml LTA即能抑制HL-60细胞的生长，40μg/ml LTA作用3d，抑制率为57%，作用5d，抑制率达到71%。
, 百拇医药
2.双歧杆菌LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响：结果见图2。HL-60细胞经40μg/ml LTA处理24h后，即出现端粒酶活性的降低，连续处理72h后，其端粒酶活性明显下降，仅为未处理细胞的34.2%，连续处理96h后，其端粒酶活性接近阴性水平。
图1 LTA对HL-60细胞的生长抑制作用
Fig 1. Inhibitory effect of LTA on the growth of HL-60 cells
图2 LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响
Fig 2. Effect of LTA on the telomerase activity in HL-60 cells
, 百拇医药
讨论
大量研究已经证实，双歧杆菌及其表面成分不仅在动物实验中能抑制肝癌、结肠癌、乳腺癌、Math A纤维肉瘤和小鼠S180等多种肿瘤的生长，而且在体外实验中也能抑制人结肠腺癌细胞株HT-29的生长，并诱导其分化。蒋虹等 最近的研究发现，双歧杆菌的脂磷壁酸(LTA)对体外培养的人结肠腺癌LoVo细胞有很强的抑制作用，并且其抑制作用具有时间和剂量的依赖性。双歧杆菌及其表面分子对白血病细胞是否也有同样的抑制作用，目前尚未见报道。MTT显色法因具有简便、快速、灵敏等优点，是目前应用非常广泛的可定量测定细胞增殖和活性状况的检测方法〔9〕。我们采用MTT显色法观察双歧杆菌LTA对HL-60细胞的影响，结果发现经LTA处理后，HL-60细胞的生长增殖能力及细胞活力均受到明显抑制，并且其抑制作用随使用剂量的增大和作用时间的延长而明显增强，与LTA对LoVo细胞的作用相似。
关于双歧杆菌抗肿瘤的作用机理，多数认为主要是通过增强机体的免疫功能，激活免疫活性细胞并释放多种免疫活性物质如IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等〔10〕，从而发挥间接的抗肿瘤作用。1995年Barrcault等〔11〕报道，双歧杆菌奶制品在体外能抑制人结肠腺癌细胞株HT-29的生长，并诱导其分化。蒋虹等认为，LTA也是一种分化诱导剂，能够诱导LoVo细胞向分化方向发展，提示在双歧杆菌的抗肿瘤作用中，除了通过调节机体的免疫功能来发挥间接的抗肿瘤作用外，通过双歧杆菌的表面分子尤其是LTA，直接诱导肿瘤细胞向分化方向发展，进而抑制肿瘤细胞的生长，可能是其抗肿瘤作用的另一重要机制。
, 百拇医药
自从1989年Morin〔12〕首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，端粒酶活性与肿瘤发生密切相关已为越来越多的研究结果所证实，端粒酶已成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。实验表明，肿瘤细胞分化诱导剂可以抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，使细胞停滞于G1期。HL-60细胞有很高的端粒酶活性，使用肿瘤细胞分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)可以降低HL-60细胞的端粒酶活性，并使其转化为静息细胞〔13〕。我们在研究中发现，用40μg/ml LTA处理HL-60细胞3d后，其端粒酶活性明显降低，仅为原来的34.2%，处理4d后，其端粒酶活性已经接近阴性水平。表明双歧杆菌LTA对HL-60细胞的端粒酶活性有明显的抑制作用，提示双歧杆菌LTA可能也具有类似肿瘤细胞分化剂的作用，通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性而诱导肿瘤细胞的分化、凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。 本文仅探讨了双歧杆菌LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响，LTA对其它肿瘤细胞的端粒酶活性是否也具有同样的抑制作用还有待进一步研讨。
, 百拇医药 基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870007)
参考文献
1，Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature，1991, 350:569-573.
2，Blackburn EH. Telomerases. Annu Rev Biochem, 1992, 61:113-129.
3，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011-2015.
, 百拇医药 4，赵万洲，张洪杰，韩锐. 端粒酶活性调节与端粒酶抑制剂的研究. 中华肿瘤杂志, 1999, 21:156-158.
5，Reddy BS, Rirenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo〔4,5-f〕 quindine, a food mutagen. Cancer Res，1993, 53:3914-3918.
6，Biff A. Antiproliferative effect of fermented milk on the growth of a human breast cell line. Nutr Cancer, 1997, 28:93-99.
7，Sutcliffe IC, Hogg SD. Extraction of Lipoteichoic acid from Streptococcus mutans with the non-ionic detergent TritonX-114. J Microbiol Methods, 1993, 17:215-225.
, 百拇医药
8，Saladowski D, Streer SJ, Clothier RH, et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993, 157:203-207.
9，边兴艳，尹学念. MTT比色法及其应用. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 1998，19:83-85.
10，Skeine K, Ohta J, Onishi M, et al. Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of Bifidobacterium infants. Biol Pharm Bull, 1995, 18:148-153.
11，Barrcault L, Denariaz G, Houri JJ, et al. Use of HT-29, a cultured human colon cancer line, to study the effect of fermented milks on colon cancer cell growth and differentiation. Carcinogenesis, 1995, 16:245-252.
, 百拇医药
12，Morin GB. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribomecleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 1989, 59:521-529.
13，Bestilny LJ, Brown CB, Miura Y, et al. Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines. Cancer Res, 1996, 56:3796-3820.
(收稿日期：1999-07-27), 百拇医药
单位：400016 重庆医科大学临床微生物学教研室
关键词：双歧杆菌；HL-60细胞；端粒酶
中华微生物学和免疫学杂志000411 【 摘要 】 目的 探讨双歧杆菌表面分子脂磷壁酸(LTA)对体外培养的HL-60白血病细胞端粒酶活性的影响。 方法 采用PCR-ELISA法检测经LTA处理前后的HL-60白血病细胞株端粒酶活性的改变。 结果 经LTA处理后，HL-60白血病细胞的生长受到抑制，端粒酶活性明显降低。 结论 双歧杆菌LTA对HL-60白血病细胞具有生长抑制作用，其抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞的端粒酶活性有关。
Effects to telomerase activity by lipoteichoic acids of Bifidobacterium in HL-60 cells
, http://www.100md.com
WANG Yue, DENG Yiping, HU Hong
(Department of Clinical Microbiology, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To investigate effects to telomerase activity by lipoteichoic acids (LTA) of Bifidobacterium in HL-60 cells in culture. Methods MTT assay was used to investigate the inhibitory effect of LTA on HL-60 cell in culture. The telomerase activity in cells treated by LTA was detected by PCR-ELISA assay which is based upon PCR amplification of the initial telomerase product and detected by ELISA. Results The growth of HL-60 cells was inhibited by 20μg/ml LTA and the inhibitory effect was time-and dose-dependent. After being treated with 40μg/ml LTA for 3 days, the telomerase activity in HL-60 cells was significantly reduced to about 34.2% of that in untreated control. Conclusion The lipoteichoic acids of Bifidobacterium could directly inhibit the growth of HL-60 cells. The mechanism of anti-tumor by lipoteichoic acid may be explained by the inhibition of telomerase activity in cells by LTA.
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【 Subject words 】 Bifidobacterium; HL-60 cells; Telomerase
端粒(telomere)是真核生物染色体末端的一种保护性结构，在维持染色体的稳定性和一致性等方面具有重要作用。正常人体细胞由于周期性复制而使端粒的长度逐渐缩短。端粒酶(Telomerase)是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶, 它能够利用自身携带的RNA作为模板逆转录合成端粒，从而维持端粒的长度，使细胞获得无限增殖的能力，成为永生化细胞。大多数肿瘤细胞都表现出较高的端粒酶活性。正常体细胞由于缺乏端粒酶活性，其端粒随着细胞分裂逐渐缩短，细胞逐渐老化、死亡。大量研究表明，端粒酶活性与肿瘤的发生有密切关系，抑制端粒酶活性可以抑制肿瘤细胞的生长。因此，寻找端粒酶抑制剂正逐渐受到人们的关注〔1-4〕。 双歧杆菌是人体肠道内的正常菌群，其抗肿瘤作用已经得到肯定〔5,6〕，对其抗肿瘤机制也进行了广泛研究，主要认为双歧杆菌通过增强机体的免疫功能而间接发挥抗肿瘤作用，对其表面分子在抗肿瘤中的直接作用研究尚少。本实验通过测定双歧杆菌LTA处理后HL-60白血病细胞端粒酶活性的变化，探讨双歧杆菌LTA对肿瘤细胞端粒酶的影响，为进一步研究双歧杆菌的抗肿瘤机制提供依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
双歧杆菌脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)的制备：分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum, B.bifidum)由本室分离保存，经中国科学院微生物研究所鉴定。LTA由本室按Sutcliffe等〔7〕的方法从B.bifidum中提取，-20℃保存。
细胞株：人早幼粒白血病细胞株HL-60由军事医学科学院药理研究室提供。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃ 5%CO2条件下培养，2～3d换液传代。
主要试剂
(1)Telomerase PCR ELISA试剂盒：购自德国Boehringer Mannheim公司。
(2)MTT：Sigma公司产品。
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MTT显色法测定LTA对HL-60细胞的生长抑制作用：HL-60细胞以5×104/ml接种96孔培养板，每孔100μl，重复3 孔，于37℃ 5%CO2条件下培养24h ，换液，分别加入含不同浓度LTA的培养液，每孔200μl，继续培养至所需时间后，参照Saladowski〔8〕的方法作MTT显色法测定，计算LTA对肿瘤细胞的抑制率。
端粒酶活性测定
(1)细胞处理：取对数生长期细胞，以105/ml密度接种于100ml培养瓶内，加入含40μg/ml LTA的RPMI 1640培养液，置37℃ 5%CO2培养1～5d。
(2)端粒酶提取：收集待测细胞，用台盼蓝拒染法计数，取106个细胞于Eppendorf管内，用PBS洗涤2次，每次4℃ 3000×g离心10min。弃上清，加入200μl CHAPS裂解液，冰浴30min，4℃ 12000×g 离心20min，小心移取上清液于新的Eppendorf管，-80℃保存待测。
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(3)RT-PCR扩增：按试剂盒说明书进行。取上述提取物2μl，反应混合液25μl，加入DEPC处理的无菌重蒸水至总体积50μl，并按以下步骤循环：25℃ 30min循环1次，94℃ 5min循环1次，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s，循环30次，再经72℃ 10min后置4℃保存。
(4)扩增产物的检测：取扩增产物5μl加入20μl变性液中，室温放置10min，再加入225μl杂交混合液，充分混匀，取100μl加入亲和素包被的酶标板内，37℃振荡孵育2h，加入抗DIG-POD的抗体与之作用，最后加入POD的底物TMB显色，加入中止液中止反应，在自动酶标仪上测定450nm和690nm的吸光度(A)值。按A值＝A450-A690计算。
结果
1.双歧杆菌LTA对HL-60的抑制作用：不同浓度LTA对HL-60 细胞的生长抑制作用见图1。结果显示，不同浓度LTA对HL-60细胞均有明显的生长抑制作用，且LTA的浓度越大，作用的时间越长，对HL-60细胞的抑制作用越强。仅 20μg/ml LTA即能抑制HL-60细胞的生长，40μg/ml LTA作用3d，抑制率为57%，作用5d，抑制率达到71%。
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2.双歧杆菌LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响：结果见图2。HL-60细胞经40μg/ml LTA处理24h后，即出现端粒酶活性的降低，连续处理72h后，其端粒酶活性明显下降，仅为未处理细胞的34.2%，连续处理96h后，其端粒酶活性接近阴性水平。
图1 LTA对HL-60细胞的生长抑制作用
Fig 1. Inhibitory effect of LTA on the growth of HL-60 cells
图2 LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响
Fig 2. Effect of LTA on the telomerase activity in HL-60 cells
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讨论
大量研究已经证实，双歧杆菌及其表面成分不仅在动物实验中能抑制肝癌、结肠癌、乳腺癌、Math A纤维肉瘤和小鼠S180等多种肿瘤的生长，而且在体外实验中也能抑制人结肠腺癌细胞株HT-29的生长，并诱导其分化。蒋虹等 最近的研究发现，双歧杆菌的脂磷壁酸(LTA)对体外培养的人结肠腺癌LoVo细胞有很强的抑制作用，并且其抑制作用具有时间和剂量的依赖性。双歧杆菌及其表面分子对白血病细胞是否也有同样的抑制作用，目前尚未见报道。MTT显色法因具有简便、快速、灵敏等优点，是目前应用非常广泛的可定量测定细胞增殖和活性状况的检测方法〔9〕。我们采用MTT显色法观察双歧杆菌LTA对HL-60细胞的影响，结果发现经LTA处理后，HL-60细胞的生长增殖能力及细胞活力均受到明显抑制，并且其抑制作用随使用剂量的增大和作用时间的延长而明显增强，与LTA对LoVo细胞的作用相似。
关于双歧杆菌抗肿瘤的作用机理，多数认为主要是通过增强机体的免疫功能，激活免疫活性细胞并释放多种免疫活性物质如IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等〔10〕，从而发挥间接的抗肿瘤作用。1995年Barrcault等〔11〕报道，双歧杆菌奶制品在体外能抑制人结肠腺癌细胞株HT-29的生长，并诱导其分化。蒋虹等认为，LTA也是一种分化诱导剂，能够诱导LoVo细胞向分化方向发展，提示在双歧杆菌的抗肿瘤作用中，除了通过调节机体的免疫功能来发挥间接的抗肿瘤作用外，通过双歧杆菌的表面分子尤其是LTA，直接诱导肿瘤细胞向分化方向发展，进而抑制肿瘤细胞的生长，可能是其抗肿瘤作用的另一重要机制。
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自从1989年Morin〔12〕首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，端粒酶活性与肿瘤发生密切相关已为越来越多的研究结果所证实，端粒酶已成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。实验表明，肿瘤细胞分化诱导剂可以抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，使细胞停滞于G1期。HL-60细胞有很高的端粒酶活性，使用肿瘤细胞分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)可以降低HL-60细胞的端粒酶活性，并使其转化为静息细胞〔13〕。我们在研究中发现，用40μg/ml LTA处理HL-60细胞3d后，其端粒酶活性明显降低，仅为原来的34.2%，处理4d后，其端粒酶活性已经接近阴性水平。表明双歧杆菌LTA对HL-60细胞的端粒酶活性有明显的抑制作用，提示双歧杆菌LTA可能也具有类似肿瘤细胞分化剂的作用，通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性而诱导肿瘤细胞的分化、凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。 本文仅探讨了双歧杆菌LTA对HL-60细胞端粒酶活性的影响，LTA对其它肿瘤细胞的端粒酶活性是否也具有同样的抑制作用还有待进一步研讨。
, 百拇医药 基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870007)
参考文献
1，Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature，1991, 350:569-573.
2，Blackburn EH. Telomerases. Annu Rev Biochem, 1992, 61:113-129.
3，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011-2015.
, 百拇医药 4，赵万洲，张洪杰，韩锐. 端粒酶活性调节与端粒酶抑制剂的研究. 中华肿瘤杂志, 1999, 21:156-158.
5，Reddy BS, Rirenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo〔4,5-f〕 quindine, a food mutagen. Cancer Res，1993, 53:3914-3918.
6，Biff A. Antiproliferative effect of fermented milk on the growth of a human breast cell line. Nutr Cancer, 1997, 28:93-99.
7，Sutcliffe IC, Hogg SD. Extraction of Lipoteichoic acid from Streptococcus mutans with the non-ionic detergent TritonX-114. J Microbiol Methods, 1993, 17:215-225.
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8，Saladowski D, Streer SJ, Clothier RH, et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993, 157:203-207.
9，边兴艳，尹学念. MTT比色法及其应用. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 1998，19:83-85.
10，Skeine K, Ohta J, Onishi M, et al. Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of Bifidobacterium infants. Biol Pharm Bull, 1995, 18:148-153.
11，Barrcault L, Denariaz G, Houri JJ, et al. Use of HT-29, a cultured human colon cancer line, to study the effect of fermented milks on colon cancer cell growth and differentiation. Carcinogenesis, 1995, 16:245-252.
, 百拇医药
12，Morin GB. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribomecleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 1989, 59:521-529.
13，Bestilny LJ, Brown CB, Miura Y, et al. Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines. Cancer Res, 1996, 56:3796-3820.
(收稿日期：1999-07-27), 百拇医药