大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析
作者：常胜军 王锡锋 马占鸿 李莉 周广和
单位：中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100094
关键词：大麦黄矮病毒；外壳蛋白基因；序列
病毒学报990412 中图分类号：S435.121.4；Q785 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0368-04
CLONING AND SEQUENCING OF COAT PROTEIN GENE FROM BARLEY YELLOW DWARF VIRUR GAV VIRUS
CHANG Sheng-jun, WANG Xi-feng, MA Zhan-hong, LI Li, ZHOU Guang-he
, 百拇医药
(The State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094, China)
Abstract: The Barley yellow dwarf virus (BYDV) GAV isolate was preserved at the Institute of Plant Protection of the Chinese Academy of Agricultural Sciences. The cDNA of BYDV GAV coat protein (CP) gene was amplified from the extracted RNA of BYDV GAV by using the polymerase chain reaction (PCR), and cloned into pGEM-7zf(+). Its complete nucleotide sequence has been determined by means of Sanger's dideoxy-mediated chain-termination method. The result showed that BYDV GAV CP gene has 600nt. It shares 97.5% and 96.5% identity with CP gene of BYDV MAV-PS1 in terms of nucleotide and amino acid sequences respectively.
, 百拇医药
Key words: Barley yellow dwarf virus GAV; Coat protein gene; Sequence
大麦黄矮病毒(BYDV)是麦类作物的重要病害，靠蚜虫传播，介体专化性强，仅局限于植物的韧皮部生长且细胞内病毒含量很低，目前还没有理想的方法来防治该病毒。我国的BYDV有4种株系即GPV、GAV、PAGV和RMV[1]。GAV与国外报道的BYDV MAV有较密切的血清学关系，但MAV仅由麦长管蚜传播，而GAV除麦长管蚜传播外，还可由麦二叉蚜传播[2]。近年来，GAV已成为我国BYDV的优势株系，在冬春麦区分布较广。本文以BYDV GAV株系的RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得外壳蛋白(CP)基因的目的片段。将其重组到pGEM-7zf(+)并转化DH5α得到了含有完整CP基因的重组子。采用双脱氧终止法对其进行了序列分析，为利用基因工程技术防治黄矮病提供了基础。
由中国农科院植物保护研究所植物病毒组保存的BYDV GAV取样，经薄膜饲毒麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rond.)，然后接种到“岸黑”燕麦上繁殖。BYDV GAV的提纯按成卓敏的方法[3]进行。提纯的病毒悬浮于磷酸缓冲液中，-20℃保存。
, 百拇医药
依据Ueng等[4]报道的BYDV MAV-PS1的RNA序列，设计并合成了两个引物。引物1：(与BYDV MAV RNA的3400-3420核苷酸互补，划线部分)5＇ACGGATCCCGGGAATTCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3＇；引物2：(与BYDV MAV RNA的2820-2841相对应，划线部分)5＇CCGAA-TTCCCGGGATCCATGAATCAGTAGGCCGTAGAA3＇。
取上述病毒核酸材料1μl、1μl引物1(150ng/μl)、2μl 5×MMLV缓冲液和6μl水，混合液置80℃处理1分钟，50℃处理5分钟，然后加入2μl 10mmol/L dNTP、1μl RNasin(40U/μl)、1μl 100mmol/L DTT、1.3μl 50mmol/L MgCl2、1μl MMLV逆转录酶(BRL，200U/μl)和3.7μl水，混合后经37℃处理30分钟，10℃处理1分钟。
, http://www.100md.com
在上述的cDNA中加入5μl 10×PCR缓冲液、引物1和引物2各1μl(150ng/L)、2μl 10mmol/L dNTP、2μl 50mmol/L MgCl2、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，加水至50μl。然后在液面上加3滴石蜡油，放入PCR仪，以94℃45秒，50℃30秒，72℃2分钟为一周期，重复循环35次，最后72℃处理10分钟。扩增完毕后加入3U的DNA聚合酶I Klenow片段进行补齐，0.8%琼脂糖凝胶电泳检查，在约600bp的位置有一条带(图1)，回收目的片段。
图1 PCR产物的凝胶电泳图
Figure 1 The agarose gel electrophoresis of GAV CP PCR products
M.λDNA/EcoRⅠand HindⅢ marker；A.PCR product of BYDV GAV CP；B.PCR product of BYDV GAV CP.
, 百拇医药
基因克隆、筛选和质粒提取均参照Sambrook等[5]的方法进行。克隆载体pGEM-7zf(+)及回收的目的片段用BamHⅠ切成粘性末端，然后进行连接并转化大肠杆菌DH5α，经选择性培养基筛选，碱法提取质粒，电泳和酶切鉴定外源片段的插入情况，两个批次的PCR产物分别得到转化子pGC13和pGC22。用Xho Ⅰ和BstxⅠ双酶切鉴定筛选出的重组质粒，证明pGC13和pGC22均含有所需的完整的CP基因片段(图2)。
图2 重组质粒pGC13和pGC22双酶切的凝胶电泳图
Figure 2 The agarose gel electrophoresis of pGC13 and pGC22 digested by endonucleases
M.λ DNA/EcoRⅠ and HindⅢ marker；A.pGC13 digested with Xho Ⅰ and Bstx Ⅰ；B.pGC22 digested with Xho Ⅰ and Bstx Ⅰ.
, 百拇医药
将含有pGC13和pGC22的工程菌，放入含有Amp100μg/ml的LB培养液震荡过夜，用碱法提取质粒并用PEG法纯化质粒，采用ABI377全自动测序仪进行序列测定，分别从T7和SP6两端测序。序列分析结果表明，重组质粒pGC13和pGC22插入片段全长均为619nt(包括59nt人工合成引物)，均含有BYDV GAV CP基因的完整编码区600nt(图3)，两个批次的PCR产物的测序结果相同。其核苷酸序列与Ueng等[4]报道的BYDV MAV-PS1相应片段的序列同源性为97.5%。由此序列推出的BYDV GAV CP的氨基酸序列与BYDV MAV-PS1的比较，同源性为96.5%。这一结果进一步证实了BYDV GAV和BYDV MAV血清学密切相关的分子基础。
图3 重组质粒pGC13和pGC22插入片段的DNA序列(去掉人工合成引物中限制酶序列)及由序列推导出的氨基酸序列与MAV相应序列的比较，从上至下依次为：CP插入片段的氨基酸序列，CP插入片段的核苷酸序列，BYDV MAV-PS1对应片段的DNA序列(相同碱基用‘+’表示)，BYDV MAV-PS1对应的氨基酸序列(相同的氨基酸用‘*’表示)。
, 百拇医药
Figure 3 The nucleotide and deduced amino acid sequences of the pGC13 and pGC22 inserted fragments(RE sequences of the two primers are not included) and comparison of these sequences with those of BYDV MAV. From top to bottom: the amino acid sequence of the CP inserted fragment, the DNA sequence of the CP inserted fragment, the DNA sequence of the corresponding fragment of BYDV MAV-PS1 (the identical nucleotides are indicated with‘+’), the amino acid sequence of BYDV MAV-PS1(the identical amino acids are indicated with‘*’).
, 百拇医药
基金项目：国家攀登计划资助项目。
作者简介：常胜军(1963—)，男，1984年9月毕业于上海医科大学，1996年在贵州大学生物技术学院获理学硕士学位；1999年9月在中国农业科学院获农学博士学位。现在清华大学生物系读博士后。
联系作者：周广和
参考文献
1 周广和，张淑香，钱幼亭.小麦黄矮病毒4种株系鉴定与应用[J].中国农业科学，1987，20：7-12.
2 周广和，张淑香，W.F.罗乔.一种由麦二叉蚜和麦长管蚜传播的小麦黄矮病毒株系的鉴定[J].植物病理学报，1986，16：17-21.
3 成卓敏，周广和.小麦黄矮病毒GPV株系的提纯及血清学研究[J].病毒学报，1986，2：275-277.
, 百拇医药
4 Ueng P P, Vincent J R, Kawata E E, et al. Nucleotide sequence analysis of the genomes of the MAV-PS1 and P-PAV isolates of barley yellow dwarf virus[J]. J. Gen, Virol., 1992, 73: 487-492.
5 Sambrook J., Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual[M]. 2nd ed, New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
收稿日期：1998-04-07；修回日期：1998-05-19, 百拇医药
单位：中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100094
关键词：大麦黄矮病毒；外壳蛋白基因；序列
病毒学报990412 中图分类号：S435.121.4；Q785 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0368-04
CLONING AND SEQUENCING OF COAT PROTEIN GENE FROM BARLEY YELLOW DWARF VIRUR GAV VIRUS
CHANG Sheng-jun, WANG Xi-feng, MA Zhan-hong, LI Li, ZHOU Guang-he
, 百拇医药
(The State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094, China)
Abstract: The Barley yellow dwarf virus (BYDV) GAV isolate was preserved at the Institute of Plant Protection of the Chinese Academy of Agricultural Sciences. The cDNA of BYDV GAV coat protein (CP) gene was amplified from the extracted RNA of BYDV GAV by using the polymerase chain reaction (PCR), and cloned into pGEM-7zf(+). Its complete nucleotide sequence has been determined by means of Sanger's dideoxy-mediated chain-termination method. The result showed that BYDV GAV CP gene has 600nt. It shares 97.5% and 96.5% identity with CP gene of BYDV MAV-PS1 in terms of nucleotide and amino acid sequences respectively.
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Key words: Barley yellow dwarf virus GAV; Coat protein gene; Sequence
大麦黄矮病毒(BYDV)是麦类作物的重要病害，靠蚜虫传播，介体专化性强，仅局限于植物的韧皮部生长且细胞内病毒含量很低，目前还没有理想的方法来防治该病毒。我国的BYDV有4种株系即GPV、GAV、PAGV和RMV[1]。GAV与国外报道的BYDV MAV有较密切的血清学关系，但MAV仅由麦长管蚜传播，而GAV除麦长管蚜传播外，还可由麦二叉蚜传播[2]。近年来，GAV已成为我国BYDV的优势株系，在冬春麦区分布较广。本文以BYDV GAV株系的RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得外壳蛋白(CP)基因的目的片段。将其重组到pGEM-7zf(+)并转化DH5α得到了含有完整CP基因的重组子。采用双脱氧终止法对其进行了序列分析，为利用基因工程技术防治黄矮病提供了基础。
由中国农科院植物保护研究所植物病毒组保存的BYDV GAV取样，经薄膜饲毒麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rond.)，然后接种到“岸黑”燕麦上繁殖。BYDV GAV的提纯按成卓敏的方法[3]进行。提纯的病毒悬浮于磷酸缓冲液中，-20℃保存。
, 百拇医药
依据Ueng等[4]报道的BYDV MAV-PS1的RNA序列，设计并合成了两个引物。引物1：(与BYDV MAV RNA的3400-3420核苷酸互补，划线部分)5＇ACGGATCCCGGGAATTCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3＇；引物2：(与BYDV MAV RNA的2820-2841相对应，划线部分)5＇CCGAA-TTCCCGGGATCCATGAATCAGTAGGCCGTAGAA3＇。
取上述病毒核酸材料1μl、1μl引物1(150ng/μl)、2μl 5×MMLV缓冲液和6μl水，混合液置80℃处理1分钟，50℃处理5分钟，然后加入2μl 10mmol/L dNTP、1μl RNasin(40U/μl)、1μl 100mmol/L DTT、1.3μl 50mmol/L MgCl2、1μl MMLV逆转录酶(BRL，200U/μl)和3.7μl水，混合后经37℃处理30分钟，10℃处理1分钟。
, http://www.100md.com
在上述的cDNA中加入5μl 10×PCR缓冲液、引物1和引物2各1μl(150ng/L)、2μl 10mmol/L dNTP、2μl 50mmol/L MgCl2、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，加水至50μl。然后在液面上加3滴石蜡油，放入PCR仪，以94℃45秒，50℃30秒，72℃2分钟为一周期，重复循环35次，最后72℃处理10分钟。扩增完毕后加入3U的DNA聚合酶I Klenow片段进行补齐，0.8%琼脂糖凝胶电泳检查，在约600bp的位置有一条带(图1)，回收目的片段。
图1 PCR产物的凝胶电泳图
Figure 1 The agarose gel electrophoresis of GAV CP PCR products
M.λDNA/EcoRⅠand HindⅢ marker；A.PCR product of BYDV GAV CP；B.PCR product of BYDV GAV CP.
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基因克隆、筛选和质粒提取均参照Sambrook等[5]的方法进行。克隆载体pGEM-7zf(+)及回收的目的片段用BamHⅠ切成粘性末端，然后进行连接并转化大肠杆菌DH5α，经选择性培养基筛选，碱法提取质粒，电泳和酶切鉴定外源片段的插入情况，两个批次的PCR产物分别得到转化子pGC13和pGC22。用Xho Ⅰ和BstxⅠ双酶切鉴定筛选出的重组质粒，证明pGC13和pGC22均含有所需的完整的CP基因片段(图2)。
图2 重组质粒pGC13和pGC22双酶切的凝胶电泳图
Figure 2 The agarose gel electrophoresis of pGC13 and pGC22 digested by endonucleases
M.λ DNA/EcoRⅠ and HindⅢ marker；A.pGC13 digested with Xho Ⅰ and Bstx Ⅰ；B.pGC22 digested with Xho Ⅰ and Bstx Ⅰ.
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将含有pGC13和pGC22的工程菌，放入含有Amp100μg/ml的LB培养液震荡过夜，用碱法提取质粒并用PEG法纯化质粒，采用ABI377全自动测序仪进行序列测定，分别从T7和SP6两端测序。序列分析结果表明，重组质粒pGC13和pGC22插入片段全长均为619nt(包括59nt人工合成引物)，均含有BYDV GAV CP基因的完整编码区600nt(图3)，两个批次的PCR产物的测序结果相同。其核苷酸序列与Ueng等[4]报道的BYDV MAV-PS1相应片段的序列同源性为97.5%。由此序列推出的BYDV GAV CP的氨基酸序列与BYDV MAV-PS1的比较，同源性为96.5%。这一结果进一步证实了BYDV GAV和BYDV MAV血清学密切相关的分子基础。
图3 重组质粒pGC13和pGC22插入片段的DNA序列(去掉人工合成引物中限制酶序列)及由序列推导出的氨基酸序列与MAV相应序列的比较，从上至下依次为：CP插入片段的氨基酸序列，CP插入片段的核苷酸序列，BYDV MAV-PS1对应片段的DNA序列(相同碱基用‘+’表示)，BYDV MAV-PS1对应的氨基酸序列(相同的氨基酸用‘*’表示)。
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Figure 3 The nucleotide and deduced amino acid sequences of the pGC13 and pGC22 inserted fragments(RE sequences of the two primers are not included) and comparison of these sequences with those of BYDV MAV. From top to bottom: the amino acid sequence of the CP inserted fragment, the DNA sequence of the CP inserted fragment, the DNA sequence of the corresponding fragment of BYDV MAV-PS1 (the identical nucleotides are indicated with‘+’), the amino acid sequence of BYDV MAV-PS1(the identical amino acids are indicated with‘*’).
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基金项目：国家攀登计划资助项目。
作者简介：常胜军(1963—)，男，1984年9月毕业于上海医科大学，1996年在贵州大学生物技术学院获理学硕士学位；1999年9月在中国农业科学院获农学博士学位。现在清华大学生物系读博士后。
联系作者：周广和
参考文献
1 周广和，张淑香，钱幼亭.小麦黄矮病毒4种株系鉴定与应用[J].中国农业科学，1987，20：7-12.
2 周广和，张淑香，W.F.罗乔.一种由麦二叉蚜和麦长管蚜传播的小麦黄矮病毒株系的鉴定[J].植物病理学报，1986，16：17-21.
3 成卓敏，周广和.小麦黄矮病毒GPV株系的提纯及血清学研究[J].病毒学报，1986，2：275-277.
, 百拇医药
4 Ueng P P, Vincent J R, Kawata E E, et al. Nucleotide sequence analysis of the genomes of the MAV-PS1 and P-PAV isolates of barley yellow dwarf virus[J]. J. Gen, Virol., 1992, 73: 487-492.
5 Sambrook J., Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual[M]. 2nd ed, New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
收稿日期：1998-04-07；修回日期：1998-05-19, 百拇医药