一种简易的检测人血浆中喷昔洛韦浓度的HPLC法
作者：何磊 龙启才 谭炳炎 汤丽芬
单位：何磊 龙启才(中山医科大学临床药理教研室 广州 510080)；谭炳炎 汤丽芬(中山医科大学分析测试中心)
关键词：泛昔洛韦；喷昔洛韦；高效液相色谱法；药代动力学
药物分析杂志000407 摘要 目的：建立一种简易的反相高效液相色谱法检测人血浆中喷昔洛韦浓度。方法：用10%高氯酸沉淀血浆蛋白，三氯甲烷抽提血浆杂质成分，取上清液用HPLC分析。色谱柱为Hypersil BDS C18，流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)(5∶0.1∶94.9)，流速：2.0 mL.min-1。紫外检测波长为254 nm。结果：喷昔洛韦与杂峰分离良好，最低检测限为0.025 mg.L-1。线性范围在0.05～5 mg.L-1。标准曲线回归方程C=0.001 2 H-0.038 6(r=0.999 9)。平均回收率为93.7%～104.8%。结论：本测定方法可满足泛昔洛韦和喷昔洛韦药代动力学和生物利用度研究的要求。
, 百拇医药
A Simple and Rapid HPLC Method for Determination of Penciclovir Concentration in HumanPlasma
He Lei Long Qicai
(Department of Clinical Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Tan Bingyan Tang Lifen
(Analytical Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
Abstract Objective：A simple and rapid HPLC method was developed for the determination of penciclovir in human plasma.Methods:Proteins in plasma samples were precipitated by perchloric acid.Chloroform was used to extract the disturbing materials in the plasma.This method involved in a C18 column as stationary phase and phosphate buffer-methanol-acetonitril(94.9∶5∶0.1)as mobile phase.The speed of flow was 2 mL.min-1.Detection wavelength was 254 nm.Results:The limit of detection was 0.025 mg.L-1.The calibration curve was linear between 0.05～5 mg.L-1 with a regression coefficient of 0.999 9.The recoveries of penciclovir samples were 93.7%～104.8%.Conclusion:The method can be applied to study of pharmacokinetics and bioavailability of famciclovir.
, 百拇医药
Key words famciclovir,penciclovir,HPLC,pharmacokinetics▲
泛昔洛韦(famciclovir)是核苷类抗病毒药物，是喷昔洛韦的前体药，由SmithKline Beecham Pharmaceuticals公司于1993年开发合成成功[1]。泛昔洛韦用于治疗带状疱疹病毒感染，用药次数少，效果优于现有第一线的抗疱疹药物阿昔洛韦。临床试验治疗乙型肝炎病人有效，现于扩大临床试验中[1，2]。
由于泛昔洛韦在体内迅速转变成喷昔洛韦(penciclovir)，血浆中不能检测到原型药，只可检测到喷昔洛韦[1]，故一般只测定口服泛昔洛韦后血浆中的喷昔洛韦浓度。
检测人体体液中的喷昔洛韦国外常用HPLC法[2～5]。本试验建立一个简便、快速检测血浆中喷昔洛韦浓度的方法并用于药动学研究。
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1 实验药品及仪器
1.1 药品 喷昔洛韦标准品：含量99.91%，批号980705，由浙江省海正药业股份有限公司提供。泛昔洛韦片(Famciclovir Tablet)商品名Famvir,英国SmithKline Beecham Pharmaceuticals产品，批号：Bn 67294，规格：每片125 mg，用于药动学实验。
1.2 仪器 Waters公司高效液相色谱仪：M 510泵、486紫外检测器、HEODYNE 7725进样器，810色谱工作站。PU 8800紫外分光光度计。
1.3 试剂 均为分析纯，水为双蒸水。
2 实验方法
2.1 标准液的配制 精确称取喷昔洛韦标准品100 mg，用17%磷酸溶解后移入100 mL的容量瓶中，稀释至刻度，即成浓度为1 000 mg.L-1的标准储备液。取储备液1 mL移入100 mL的容量瓶，用双蒸水稀释至刻度，配成10 mg.L-1标准液。依次稀释成5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg.L-1的标准溶液。
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2.2 色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS C18，5 μm，4.6 mm×12.5 cm。流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)(5∶0.1∶94.9)，流速：2.0 mL.min-1。紫外检测波长为254 nm。
2.3 样品处理 分别取标准品血浆溶液(见“3.2”项)0.5 mL，旋涡条件下加10%高氯酸0.1 mL；加三氯甲烷3 mL，旋涡5 min；4 000 r.min-1离心20 min，收集上清液，过滤后取10 μL进样测定。
3 实验结果
3.1 色谱行为 喷昔洛韦在波长210及254 nm均有紫外吸收峰，选择254 nm为本实验测定喷昔洛韦的波长。喷昔洛韦标准品及血浆样品按前述色谱条件进样分析，其保留时间约为4 min。见图1。
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图1 喷昔洛韦的色谱图
A.服药后血浆 B.空白血浆 C.标准品
1.喷昔洛韦
3.2 标准曲线的制备 精密称取喷昔洛韦标准品，配成浓度为0.05～5 mg.L-1(0.05，0.1，0.25，0.5，1，2，5 mg.L-1)的标准品血浆溶液，各取0.5 mL，按上述方法处理后进行测定。以喷昔洛韦的色谱峰高对浓度作图，求出标准曲线的回归方程为：
C=0.001 2 H-0.038 6 r=0.999 9 n=7
3.3 最低检测限 在上述色谱条件下，喷昔洛韦在血浆中最低检测限(S/N=3)为0.025 mg.L-1。
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3.4 回收率 选择0.1，0.5， 2 mg.L-13个浓度的喷昔洛韦标准血浆样品，经上述方法提取处理后，进样分析，求得喷昔洛韦在血浆中的回收率。为了解加入氯仿后旋涡时间对回收率的影响，我们分别设置旋涡5 min和10 min。结果见表1。
表1 旋涡时间对喷昔洛韦的回收率的影响(%) 浓度/mg.L-1
旋涡10 min
旋涡5 min
回收率
RSD
回收率
RSD
, 百拇医药
0.1
87.2
9.4
102.7
8.5
0.5
90.0
3.9
96.8
3.6
2
91.9
3.8
, 百拇医药
94.2
3.9
3.5 净化回收率 为观察加入三氯甲烷对待测组分的影响，取“2.1”项下的标准溶液，进样分析，再用三氯甲烷提取净化，净化后的溶液再进样分析。根据净化前、后标准品峰高的比值可得保持率为96.8%。
3.6 方法重现性评价 在同一天内和不同天间对0.1，0.5，2 mg.L-1 3个浓度的喷昔洛韦标准血浆样品重复提取处理5批后进样分析，测得各浓度喷昔洛韦的平均色谱峰高并算出RSD，分析天内和天间RSD。结果见表2。
表2 喷昔洛韦在血浆中日内及日间RSD(%) 浓度/mg.L-1
日内RSD
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日间RSD
0.1
9.4
9.8
0.5
3.9
8.1
2
3.3
6.9
3.7 方法学应用 9名志愿者分别于清晨空腹1次po泛昔洛韦片250 mg。于0～12 h共14个时间点经上肢静脉分别取血4 mL，分离血浆。按上述方法进行提取处理后进样分析。结果见图2。
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图2 9人口服泛昔洛韦片剂后血浆
喷昔洛韦平均药-时曲线
4 讨论
与文献[2～5]相比，本试验主要改进之处在于抽提方法，即用高氯酸沉淀杂质蛋白，再用三氯甲烷抽提，取水相进样分析。其回收率达到97.3%～104.8%。用这种抽提方法，色谱图显示干扰峰很少，可以不加预柱。提示三氯甲烷对血浆杂质有很高的吸附性，而喷昔洛韦在其中的溶解度很小。净化回收率实验结果(保持率96.8%)表明，加入三氯甲烷不会影响待测组分的测定。
喷昔洛韦分别在210 nm和254 nm均有吸收峰，前者比后者更大，如果用210 nm测定血浆中喷昔洛韦，会产生严重的杂质干扰，难以分离样品峰。用254 nm测定，可获得较好的分离效果。
表1的数据表明，血浆样本加入氯仿后，旋涡时间的长短可以影响回收率。旋涡时间以5 min为合适，时间过长因产生严重的乳化会造成回收率下降。
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流动相pH对喷昔洛韦峰的保留时间影响不大，分离亦影响不大；但考虑到样本处理时使用了高氯酸，为减小色谱柱内pH的变化，减轻对色谱柱及整个高效液相系统的腐蚀，仍使用磷酸盐缓冲液。■
参考文献
1.Gill KS,Wood MJ.The clinical pharmacokinetics of famciclovir.Clin Pharmacokinet,1996,31(1):1
2.Filer CW,Ramji J,Takahashi N,et al.Pharmacokinetics of famciclovir-absorption,distribution,metabolism and excretion in rats and dogs.Jpn Pharmacol Ther,1996,24(8):159
3.Hsu LC,Constable DJ,Orvos DR,et al.Comparison of high performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis in penciclovir biodegradation kinetic studies.J Chroma B Biomed Appl,1995,669:85
, 百拇医药
4.McMeekin JR,Fowles SE,Winton CF,et al.Rapid high-performance liquid chromatographic method for the analysis of the active antiherpes agent,penciclovir and its precursor,BRL 42359,in human plasma and urine following administration of the oral prodrug,famciclovir.Anal Proc,1992,29:178
5.Filer CW,Allen GD,Brown TA,et al.Metabolic and pharmacokinetic studies following oral administration of 14C-famciclovir to healthy subjects.Xenobiotica,1994,24(4):357
(本文于2000年3月3日修改回), http://www.100md.com
单位：何磊 龙启才(中山医科大学临床药理教研室 广州 510080)；谭炳炎 汤丽芬(中山医科大学分析测试中心)
关键词：泛昔洛韦；喷昔洛韦；高效液相色谱法；药代动力学
药物分析杂志000407 摘要 目的：建立一种简易的反相高效液相色谱法检测人血浆中喷昔洛韦浓度。方法：用10%高氯酸沉淀血浆蛋白，三氯甲烷抽提血浆杂质成分，取上清液用HPLC分析。色谱柱为Hypersil BDS C18，流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)(5∶0.1∶94.9)，流速：2.0 mL.min-1。紫外检测波长为254 nm。结果：喷昔洛韦与杂峰分离良好，最低检测限为0.025 mg.L-1。线性范围在0.05～5 mg.L-1。标准曲线回归方程C=0.001 2 H-0.038 6(r=0.999 9)。平均回收率为93.7%～104.8%。结论：本测定方法可满足泛昔洛韦和喷昔洛韦药代动力学和生物利用度研究的要求。
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A Simple and Rapid HPLC Method for Determination of Penciclovir Concentration in HumanPlasma
He Lei Long Qicai
(Department of Clinical Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Tan Bingyan Tang Lifen
(Analytical Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
Abstract Objective：A simple and rapid HPLC method was developed for the determination of penciclovir in human plasma.Methods:Proteins in plasma samples were precipitated by perchloric acid.Chloroform was used to extract the disturbing materials in the plasma.This method involved in a C18 column as stationary phase and phosphate buffer-methanol-acetonitril(94.9∶5∶0.1)as mobile phase.The speed of flow was 2 mL.min-1.Detection wavelength was 254 nm.Results:The limit of detection was 0.025 mg.L-1.The calibration curve was linear between 0.05～5 mg.L-1 with a regression coefficient of 0.999 9.The recoveries of penciclovir samples were 93.7%～104.8%.Conclusion:The method can be applied to study of pharmacokinetics and bioavailability of famciclovir.
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Key words famciclovir,penciclovir,HPLC,pharmacokinetics▲
泛昔洛韦(famciclovir)是核苷类抗病毒药物，是喷昔洛韦的前体药，由SmithKline Beecham Pharmaceuticals公司于1993年开发合成成功[1]。泛昔洛韦用于治疗带状疱疹病毒感染，用药次数少，效果优于现有第一线的抗疱疹药物阿昔洛韦。临床试验治疗乙型肝炎病人有效，现于扩大临床试验中[1，2]。
由于泛昔洛韦在体内迅速转变成喷昔洛韦(penciclovir)，血浆中不能检测到原型药，只可检测到喷昔洛韦[1]，故一般只测定口服泛昔洛韦后血浆中的喷昔洛韦浓度。
检测人体体液中的喷昔洛韦国外常用HPLC法[2～5]。本试验建立一个简便、快速检测血浆中喷昔洛韦浓度的方法并用于药动学研究。
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1 实验药品及仪器
1.1 药品 喷昔洛韦标准品：含量99.91%，批号980705，由浙江省海正药业股份有限公司提供。泛昔洛韦片(Famciclovir Tablet)商品名Famvir,英国SmithKline Beecham Pharmaceuticals产品，批号：Bn 67294，规格：每片125 mg，用于药动学实验。
1.2 仪器 Waters公司高效液相色谱仪：M 510泵、486紫外检测器、HEODYNE 7725进样器，810色谱工作站。PU 8800紫外分光光度计。
1.3 试剂 均为分析纯，水为双蒸水。
2 实验方法
2.1 标准液的配制 精确称取喷昔洛韦标准品100 mg，用17%磷酸溶解后移入100 mL的容量瓶中，稀释至刻度，即成浓度为1 000 mg.L-1的标准储备液。取储备液1 mL移入100 mL的容量瓶，用双蒸水稀释至刻度，配成10 mg.L-1标准液。依次稀释成5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg.L-1的标准溶液。
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2.2 色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS C18，5 μm，4.6 mm×12.5 cm。流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)(5∶0.1∶94.9)，流速：2.0 mL.min-1。紫外检测波长为254 nm。
2.3 样品处理 分别取标准品血浆溶液(见“3.2”项)0.5 mL，旋涡条件下加10%高氯酸0.1 mL；加三氯甲烷3 mL，旋涡5 min；4 000 r.min-1离心20 min，收集上清液，过滤后取10 μL进样测定。
3 实验结果
3.1 色谱行为 喷昔洛韦在波长210及254 nm均有紫外吸收峰，选择254 nm为本实验测定喷昔洛韦的波长。喷昔洛韦标准品及血浆样品按前述色谱条件进样分析，其保留时间约为4 min。见图1。
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图1 喷昔洛韦的色谱图
A.服药后血浆 B.空白血浆 C.标准品
1.喷昔洛韦
3.2 标准曲线的制备 精密称取喷昔洛韦标准品，配成浓度为0.05～5 mg.L-1(0.05，0.1，0.25，0.5，1，2，5 mg.L-1)的标准品血浆溶液，各取0.5 mL，按上述方法处理后进行测定。以喷昔洛韦的色谱峰高对浓度作图，求出标准曲线的回归方程为：
C=0.001 2 H-0.038 6 r=0.999 9 n=7
3.3 最低检测限 在上述色谱条件下，喷昔洛韦在血浆中最低检测限(S/N=3)为0.025 mg.L-1。
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3.4 回收率 选择0.1，0.5， 2 mg.L-13个浓度的喷昔洛韦标准血浆样品，经上述方法提取处理后，进样分析，求得喷昔洛韦在血浆中的回收率。为了解加入氯仿后旋涡时间对回收率的影响，我们分别设置旋涡5 min和10 min。结果见表1。
表1 旋涡时间对喷昔洛韦的回收率的影响(%) 浓度/mg.L-1
旋涡10 min
旋涡5 min
回收率
RSD
回收率
RSD
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0.1
87.2
9.4
102.7
8.5
0.5
90.0
3.9
96.8
3.6
2
91.9
3.8
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94.2
3.9
3.5 净化回收率 为观察加入三氯甲烷对待测组分的影响，取“2.1”项下的标准溶液，进样分析，再用三氯甲烷提取净化，净化后的溶液再进样分析。根据净化前、后标准品峰高的比值可得保持率为96.8%。
3.6 方法重现性评价 在同一天内和不同天间对0.1，0.5，2 mg.L-1 3个浓度的喷昔洛韦标准血浆样品重复提取处理5批后进样分析，测得各浓度喷昔洛韦的平均色谱峰高并算出RSD，分析天内和天间RSD。结果见表2。
表2 喷昔洛韦在血浆中日内及日间RSD(%) 浓度/mg.L-1
日内RSD
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日间RSD
0.1
9.4
9.8
0.5
3.9
8.1
2
3.3
6.9
3.7 方法学应用 9名志愿者分别于清晨空腹1次po泛昔洛韦片250 mg。于0～12 h共14个时间点经上肢静脉分别取血4 mL，分离血浆。按上述方法进行提取处理后进样分析。结果见图2。
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图2 9人口服泛昔洛韦片剂后血浆
喷昔洛韦平均药-时曲线
4 讨论
与文献[2～5]相比，本试验主要改进之处在于抽提方法，即用高氯酸沉淀杂质蛋白，再用三氯甲烷抽提，取水相进样分析。其回收率达到97.3%～104.8%。用这种抽提方法，色谱图显示干扰峰很少，可以不加预柱。提示三氯甲烷对血浆杂质有很高的吸附性，而喷昔洛韦在其中的溶解度很小。净化回收率实验结果(保持率96.8%)表明，加入三氯甲烷不会影响待测组分的测定。
喷昔洛韦分别在210 nm和254 nm均有吸收峰，前者比后者更大，如果用210 nm测定血浆中喷昔洛韦，会产生严重的杂质干扰，难以分离样品峰。用254 nm测定，可获得较好的分离效果。
表1的数据表明，血浆样本加入氯仿后，旋涡时间的长短可以影响回收率。旋涡时间以5 min为合适，时间过长因产生严重的乳化会造成回收率下降。
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流动相pH对喷昔洛韦峰的保留时间影响不大，分离亦影响不大；但考虑到样本处理时使用了高氯酸，为减小色谱柱内pH的变化，减轻对色谱柱及整个高效液相系统的腐蚀，仍使用磷酸盐缓冲液。■
参考文献
1.Gill KS,Wood MJ.The clinical pharmacokinetics of famciclovir.Clin Pharmacokinet,1996,31(1):1
2.Filer CW,Ramji J,Takahashi N,et al.Pharmacokinetics of famciclovir-absorption,distribution,metabolism and excretion in rats and dogs.Jpn Pharmacol Ther,1996,24(8):159
3.Hsu LC,Constable DJ,Orvos DR,et al.Comparison of high performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis in penciclovir biodegradation kinetic studies.J Chroma B Biomed Appl,1995,669:85
, 百拇医药
4.McMeekin JR,Fowles SE,Winton CF,et al.Rapid high-performance liquid chromatographic method for the analysis of the active antiherpes agent,penciclovir and its precursor,BRL 42359,in human plasma and urine following administration of the oral prodrug,famciclovir.Anal Proc,1992,29:178
5.Filer CW,Allen GD,Brown TA,et al.Metabolic and pharmacokinetic studies following oral administration of 14C-famciclovir to healthy subjects.Xenobiotica,1994,24(4):357
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