脊髓缺血再灌流时脊髓神经元的电活动规律
作者：伍亚民 廖维宏 王正国 朱佩芳 陈恒胜
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所，重庆 400042
关键词：
中国应用生理学杂志000326 脊髓损伤的救治是神经科学研究的难点，目前实验性药物治疗取得了较好的效果，但临 床应用效果不理想，患者功能改善极为缓慢。加强损伤脊髓功能变化规律及其机制的研究十 分必要。在脊髓电生理功能的研究方面，除大量诱发电位的研究外，有关损伤条件下神经元 电活动、脊髓损伤电位及损伤电流等研究较少。本实验利用细胞外记录技术，观察脊髓缺血 及再灌流损伤时脊髓神经元的电活动变化，以分析损伤条件下神经元功能的变化规律及其意 义。
1 材料与方法
(1)模型制备 日本大耳白家兔10只，(2.25±0.25) kg，雌雄不拘，以选择性腰动脉 阻断法制备脊髓缺血再灌流损伤模型。即家兔用3%戊巴比妥钠麻醉(1 ml/kg，i.v.)后 ，无菌条件下行气管插管，呼吸机辅助呼吸，左腹膜后间隙钝性分离出腰动脉(紧邻左肾动 脉的上位腰动脉命名为上1支，其下的五支腰动脉自头端至尾端依次命名为下1、下2、 下3、下4、下5支)。将上1、下1、3、4、5腰动脉分支用1号丝线结扎后，下 2支套线并穿出一Teflon中空硅胶管，将硅胶管穿出家兔左侧腹壁后用线缝扎固定，通过 拉闭下2腰动脉而模拟腰髓缺血再灌流损伤。常规暴露出L4脊髓(用温热石蜡油覆盖)，d -筒箭毒制动(1 mg/kg，i.p.每1～2 h一次)，以备记录L4脊髓单位放电(spinal cord unit discharges，SCUDs)。
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(2)神经元电活动的记录与处理 ST-7型脑脊髓立体定位仪水平固定腰髓，用微电极操 纵器将灌以0.5 mol/L醋酸钠配制的2%旁胺天蓝的玻璃微电极(5～10 MΩ)定向引至L4脊 髓，并用液压推进器逐渐推进电极，当记录到神经元放电信号后输出至MEZ-8300型微电极 放大器放大，再输出到VC-10生物记忆示波器监视，同时输出到本室研制的SYD-4228生理 多媒体实验系统进行序列密度直方图处理。同一个放电单位，连续观察其缺血前、缺血时和 再灌流后的放电改变。
(3)结果分析 根据直方图计算出相应单位放电频率改变的百分数。如果某因素作用后 ，SCUDs频率变化高出对照20%，则认为该因素对其有兴奋作用；反之，如果频率变化低于 对照20%，则为抑制作用；如果频率改变在±20%以内，则认为该因素对本单位无作用。
2 结果
(1)脊髓神经元自发放电活动 共记录到52个SCUDs。其中绝大部分为较规整的单脉冲放 电(82.7%)，小部分为不规整的簇状放电(5.8%)；此外，还有单、簇相间的混合型放电( 11.5%)。并且放电频率以1～20 Hz的单位最多占63.4%，20～30 Hz的单位占25.0%， 大于30 Hz者占11.5%。
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(2)缺血再灌流时脊髓神经元放电的变化 在52个SCUDs中，对其中信噪比>4/l的30个 单位，连续观察了脊髓缺血及再灌流时的放电改变。结果见到：在缺血早期(≤2 min)，出 现兴奋性反应(excitatory responses，ER)、抑制性反应(inhibitory responses，IR)和无 反应(no responses，NR)三种改变，分别有12个、12个、6个单位。但随着缺血时间的延长 上述 改变均向IR以至放电消失的方向转变，缺血5 min时30个 SCUDs其放电活动全部消失。在经 历了缺血10 min后连续观察了同一神经元在再灌流(30 min)期间放电活动的恢复情况，结果 也出现三种类型的反应：放电活动无恢复，称之为无恢复型，有18个单位；放电活动在再灌 2 min内恢复然后又出现放电抑制以至消失，称之为早期恢复型，有6个单位；还有一种称之 为延期恢复型，再灌流2 min后才有放电活动，在我们的观察中有一个单位到再灌流22 min 时才见其放电活动恢复，但这种延期恢复型的神经元最终依然停止了其放电活动，这种类型 的反应也有6个单位。在后两种类型的反应中有不少单位发生类临死前的“哀鸣”性放电。
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3 讨论
单位放电是神经元活动的客观反映，是神经元行为功能的重要表现形式。本实验观察到 脊髓缺血2 min内，30个SCUDs出现了ER、IR和NR，其比率分别为40%、40%和20%，但随着 缺血时间的延长上述改变均向IR方向转变直至放电消失。提示：成年家兔脊髓神经元对缺血 损伤十分敏感。但为什么有的表现为ER，有的则为IR或NR。分析其原因可能有：(1)大部分 神经元在缺血时，由于缺氧激活了离子通道，去极化反应加强而表现为ER;(2)而有些神经元 ，可能在突然经受缺血打击后处于抑制状态或类似休克状态，神经元放电活动暂时性停止， 因而缺血时表现为 IR，在血流再灌周围微环境改善时就恢复其放电活动，从某种程度上讲 ，它是神经元的一种保护性反应。另外，有些神经元可能本身就是抑制性神经元或对缺血太 敏感以至经过短时间缺血损伤即引起死亡而表现为 IR;(3)随着缺血时间的延长ER的神经元 转为抑制可能是缺血缺氧导致兴奋性氨基酸等兴奋性递质大量释放而耗竭，此时GABA等抑制 性神经递质的作用相对加强，使相应神经元兴奋性降低的结果。而少数神经元在缺血时先 出现ER并表现为类临死前“哀鸣”性放电，在血流再灌时也无放电活动，表明该神经元已经 死亡。
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再灌流时，放电消失的神经元出现了无恢复型、早期恢复型和延期恢复型三种改变。其 中早期恢复型、延期恢复型在血流再灌时，由于脊髓组织血流恢复改善了细胞缺血缺氧状况 ，能量代谢恢复，ATP依赖的各种酶活性也趋于正常，神经元胞膜上离子通道(如Na+、K +、Ca2+通道)功能恢复，因而其放电活动得到恢复；但由于每个细胞缺血缺氧程度不 同，加之各自对缺氧耐受程度的差异，导致了再灌流早期神经元功能恢复的差别而表现为早 期、延期恢复型反应。在缺血和再灌流过程中一直处于放电消失的神经元(无恢复型)很可能 已经发生明显的功能障碍甚至细胞死亡。综合缺血及再灌流损伤的反应，可以看出再灌流时 无恢复型神经元占多数(18个单位)，高出缺血时任何一种反应的神经元数，提示再灌流时神 经元除了表现为功能恢复外也存在着再灌流损害。而且无论是早期恢复型，还是延期恢复 型的神经元，随着再灌流时间的延长，大部分神经元的放电活动最终消失，由此可见再灌流 损伤可能比缺血损伤更重。因为，脊髓神经元在经受缺血打击后，处于一种应激代偿保护状 态而十分脆弱，在再灌时，恢复的血流、血氧对这种受缺血打击的神经元也许又是一种新的 应激原，使其遭受二次打击功能损害更重。也可能由于“无复流现象”使再灌流时脊髓血流 不能恢复正常，脊髓实际处于较长时间的缺血缺氧状态，相应神经元则出现离子紊乱、放电 消失甚至细胞死亡。总之，在脊髓缺血再灌流过程中，脊髓神经元的兴奋性变化规律是先高 后低，且随缺血加重，相应神经元对缺氧的耐受力减弱，兴奋性降低，放电消失增多，神经 元死亡增加，而使再灌流时功能恢复减少。
全军“九五”攻关课题，No.96L035
收稿日期：1999-01-26；修回日期：2000-01-24, 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所，重庆 400042
关键词：
中国应用生理学杂志000326 脊髓损伤的救治是神经科学研究的难点，目前实验性药物治疗取得了较好的效果，但临 床应用效果不理想，患者功能改善极为缓慢。加强损伤脊髓功能变化规律及其机制的研究十 分必要。在脊髓电生理功能的研究方面，除大量诱发电位的研究外，有关损伤条件下神经元 电活动、脊髓损伤电位及损伤电流等研究较少。本实验利用细胞外记录技术，观察脊髓缺血 及再灌流损伤时脊髓神经元的电活动变化，以分析损伤条件下神经元功能的变化规律及其意 义。
1 材料与方法
(1)模型制备 日本大耳白家兔10只，(2.25±0.25) kg，雌雄不拘，以选择性腰动脉 阻断法制备脊髓缺血再灌流损伤模型。即家兔用3%戊巴比妥钠麻醉(1 ml/kg，i.v.)后 ，无菌条件下行气管插管，呼吸机辅助呼吸，左腹膜后间隙钝性分离出腰动脉(紧邻左肾动 脉的上位腰动脉命名为上1支，其下的五支腰动脉自头端至尾端依次命名为下1、下2、 下3、下4、下5支)。将上1、下1、3、4、5腰动脉分支用1号丝线结扎后，下 2支套线并穿出一Teflon中空硅胶管，将硅胶管穿出家兔左侧腹壁后用线缝扎固定，通过 拉闭下2腰动脉而模拟腰髓缺血再灌流损伤。常规暴露出L4脊髓(用温热石蜡油覆盖)，d -筒箭毒制动(1 mg/kg，i.p.每1～2 h一次)，以备记录L4脊髓单位放电(spinal cord unit discharges，SCUDs)。
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(2)神经元电活动的记录与处理 ST-7型脑脊髓立体定位仪水平固定腰髓，用微电极操 纵器将灌以0.5 mol/L醋酸钠配制的2%旁胺天蓝的玻璃微电极(5～10 MΩ)定向引至L4脊 髓，并用液压推进器逐渐推进电极，当记录到神经元放电信号后输出至MEZ-8300型微电极 放大器放大，再输出到VC-10生物记忆示波器监视，同时输出到本室研制的SYD-4228生理 多媒体实验系统进行序列密度直方图处理。同一个放电单位，连续观察其缺血前、缺血时和 再灌流后的放电改变。
(3)结果分析 根据直方图计算出相应单位放电频率改变的百分数。如果某因素作用后 ，SCUDs频率变化高出对照20%，则认为该因素对其有兴奋作用；反之，如果频率变化低于 对照20%，则为抑制作用；如果频率改变在±20%以内，则认为该因素对本单位无作用。
2 结果
(1)脊髓神经元自发放电活动 共记录到52个SCUDs。其中绝大部分为较规整的单脉冲放 电(82.7%)，小部分为不规整的簇状放电(5.8%)；此外，还有单、簇相间的混合型放电( 11.5%)。并且放电频率以1～20 Hz的单位最多占63.4%，20～30 Hz的单位占25.0%， 大于30 Hz者占11.5%。
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(2)缺血再灌流时脊髓神经元放电的变化 在52个SCUDs中，对其中信噪比>4/l的30个 单位，连续观察了脊髓缺血及再灌流时的放电改变。结果见到：在缺血早期(≤2 min)，出 现兴奋性反应(excitatory responses，ER)、抑制性反应(inhibitory responses，IR)和无 反应(no responses，NR)三种改变，分别有12个、12个、6个单位。但随着缺血时间的延长 上述 改变均向IR以至放电消失的方向转变，缺血5 min时30个 SCUDs其放电活动全部消失。在经 历了缺血10 min后连续观察了同一神经元在再灌流(30 min)期间放电活动的恢复情况，结果 也出现三种类型的反应：放电活动无恢复，称之为无恢复型，有18个单位；放电活动在再灌 2 min内恢复然后又出现放电抑制以至消失，称之为早期恢复型，有6个单位；还有一种称之 为延期恢复型，再灌流2 min后才有放电活动，在我们的观察中有一个单位到再灌流22 min 时才见其放电活动恢复，但这种延期恢复型的神经元最终依然停止了其放电活动，这种类型 的反应也有6个单位。在后两种类型的反应中有不少单位发生类临死前的“哀鸣”性放电。
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3 讨论
单位放电是神经元活动的客观反映，是神经元行为功能的重要表现形式。本实验观察到 脊髓缺血2 min内，30个SCUDs出现了ER、IR和NR，其比率分别为40%、40%和20%，但随着 缺血时间的延长上述改变均向IR方向转变直至放电消失。提示：成年家兔脊髓神经元对缺血 损伤十分敏感。但为什么有的表现为ER，有的则为IR或NR。分析其原因可能有：(1)大部分 神经元在缺血时，由于缺氧激活了离子通道，去极化反应加强而表现为ER;(2)而有些神经元 ，可能在突然经受缺血打击后处于抑制状态或类似休克状态，神经元放电活动暂时性停止， 因而缺血时表现为 IR，在血流再灌周围微环境改善时就恢复其放电活动，从某种程度上讲 ，它是神经元的一种保护性反应。另外，有些神经元可能本身就是抑制性神经元或对缺血太 敏感以至经过短时间缺血损伤即引起死亡而表现为 IR;(3)随着缺血时间的延长ER的神经元 转为抑制可能是缺血缺氧导致兴奋性氨基酸等兴奋性递质大量释放而耗竭，此时GABA等抑制 性神经递质的作用相对加强，使相应神经元兴奋性降低的结果。而少数神经元在缺血时先 出现ER并表现为类临死前“哀鸣”性放电，在血流再灌时也无放电活动，表明该神经元已经 死亡。
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再灌流时，放电消失的神经元出现了无恢复型、早期恢复型和延期恢复型三种改变。其 中早期恢复型、延期恢复型在血流再灌时，由于脊髓组织血流恢复改善了细胞缺血缺氧状况 ，能量代谢恢复，ATP依赖的各种酶活性也趋于正常，神经元胞膜上离子通道(如Na+、K +、Ca2+通道)功能恢复，因而其放电活动得到恢复；但由于每个细胞缺血缺氧程度不 同，加之各自对缺氧耐受程度的差异，导致了再灌流早期神经元功能恢复的差别而表现为早 期、延期恢复型反应。在缺血和再灌流过程中一直处于放电消失的神经元(无恢复型)很可能 已经发生明显的功能障碍甚至细胞死亡。综合缺血及再灌流损伤的反应，可以看出再灌流时 无恢复型神经元占多数(18个单位)，高出缺血时任何一种反应的神经元数，提示再灌流时神 经元除了表现为功能恢复外也存在着再灌流损害。而且无论是早期恢复型，还是延期恢复 型的神经元，随着再灌流时间的延长，大部分神经元的放电活动最终消失，由此可见再灌流 损伤可能比缺血损伤更重。因为，脊髓神经元在经受缺血打击后，处于一种应激代偿保护状 态而十分脆弱，在再灌时，恢复的血流、血氧对这种受缺血打击的神经元也许又是一种新的 应激原，使其遭受二次打击功能损害更重。也可能由于“无复流现象”使再灌流时脊髓血流 不能恢复正常，脊髓实际处于较长时间的缺血缺氧状态，相应神经元则出现离子紊乱、放电 消失甚至细胞死亡。总之，在脊髓缺血再灌流过程中，脊髓神经元的兴奋性变化规律是先高 后低，且随缺血加重，相应神经元对缺氧的耐受力减弱，兴奋性降低，放电消失增多，神经 元死亡增加，而使再灌流时功能恢复减少。
全军“九五”攻关课题，No.96L035
收稿日期：1999-01-26；修回日期：2000-01-24, 百拇医药