绿脓杆菌外膜蛋白D2(OprD2)与耐药关系的研究
作者：陈瑞 唐英春 朱家馨 吴本权
单位：中山医科大学附属三院呼吸室 广州 510630
关键词：外膜蛋白D2；绿脓杆菌；碳青霉烯类；耐药性
中国现代医学杂志000402 该文采用外膜蛋白SDS-PAGE、凝胶分光光度扫描分析方法，研究该室临床分离的绿脓杆菌OprD2与耐药的关系。结果表明绿脓杆菌泰能耐药株均有不同程度OprD2的减少，耐药组OprD2的相对含量明显低于敏感组，提示OprD2的减少甚至缺失是绿脓杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
分类号 R378.99
HE RESEARCH ON PYOCYANIN IVOLUCER PROTEIN
D2(OPRD2 AND ITS DRUG-RESISTANT RELATIONSHIP
, 百拇医药
Chen Rui Tang Yingchun Zhu Jiaxin Wu Benquan
(Department of Internal Medicine, The 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Science)
In this paper, we use SDS-PAGE method and a scanning densimeter to study the relation between resistance and outer membrane protein D2 (OprD2) in Pseudomonas Aeruginosas. The results show that the amounts of OprD2 in resistant isolates are significantly lower than that of sensitive isolates, that the amounts of OprD2 are reduced respectively in all resistant isolates. In a conclusion, the reduction of OprD2 is primary element which is responsible for Pseudomonas acruginosas’s resistance to Carbapenem.
, 百拇医药
Key words:Outer membrane proteinD2; Pseudomonoas aeruginosa; Carbapeam; Resistance.
本文通过分析20株PA临床分离株外膜蛋白图谱及OprD2的相对含量，研究以泰能为代表的碳青霉烯类抗生素耐药与外膜蛋白的关系，为临床治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 20株PA临床分离株均由中山医科大学附属三院呼吸室痰标本中分离,并经法国BIOMERIEUX公司API 20NE系统鉴定。标准质控株ATCC27853为本室保存菌株。
1.1.2 培养基 Muller-Hinton肉汤、Muller-Hinton琼脂均为Difco公司产品；L-肉汤(L-B)：氯化钠5 g/l，胰蛋白胨10 g/l，酵母浸膏5 g/l，其中胰蛋白胨和酵母浸膏为Difco公司产品，氯化钠为广州化学制剂厂产品。
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1.1.3 试剂 泰能：美国Merk公司产品，批号V5595；十二烷基肌氨酸钠(N-Lauryl Sarcosine Na):Sigma公司产品；丙烯酰胺：BIO-RAD公司产品；亚甲基双丙烯酰胺：BIO-RAD公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)：日本和光纯药株式会社产品；四甲基乙二胺(TEMED)：Serva公司产品；Tris:Sigma公司产品；甘氨酸：日本和光纯药株式会社产品；蛋白质分子量标准：上海东风生化试剂厂产品。
1.1.4 仪器 L8-M低温超速离心机：美国Beckman公司产品；DF-D恒流恒压电泳仪：北京东方仪器厂产品；Mini-PROTEANⅡ垂直板电泳槽：BIO-RAD公司产品；JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机：宁波新芝科器研究所产品；HZS-H水浴恒温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；751-GW紫外分光光度计：上海分析仪器厂产品；分光光度扫描仪：美国Beckman公司产品；高速冷冻离心机：美国Beckman公司产品。
, http://www.100md.com 1.2 方法
1.2.1 体外抗菌实验及耐药菌株筛选 按常规试管双倍稀释法进行药物MIC测定。培养基为Muller-Hinton肉汤,接种菌量105cfu/ml,18～24 h后观察结果。根据1997年美国临床检验委员会标准(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS),MIC≤4 mg/L为敏感,MIC>4 mg/L为耐药。
1.2.2 外膜蛋白制备[1] 从M-H琼脂平板上挑取单个PA菌落到20 ml L-肉汤中振荡培养16 h至对数生长期。然后转种至300 ml L-肉汤中接种菌量为5%，37 ℃振荡培养20 h。7 000 rpm 4 ℃离心10 min收菌，用10 mmol/L pH7.0PBS洗涤2次并悬浮于其中。置冰浴超声碎菌4 min，每次10 s，间隔5 s。5 000 rpm 4 ℃离心15 min，弃未破碎的细胞。取上清液4 ℃ 40 000 rpm离心1 h，弃上清，将沉淀颗粒悬浮于10 mmol/L pH7.0PBS中(内含2%十二烷基肌氨酸钠)，室温作用30 min。将此混悬液30 000 rpm室温离心30 min，弃上清，并用1%十二烷基肌氨酸钠洗涤2次。提纯后的外膜蛋白悬浮于10 mmol/L pH7.0PBS中。紫外吸收法测定蛋白含量。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)＝1.450D280-0.740D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40 μg/μl，该蛋白质样品-70 ℃贮存。
, 百拇医药
1.2.3 蛋白质电泳 蛋白样品溶于等体积样品缓冲液中，100 ℃加热5 min使蛋白质变性。经SDS-PAGE(分离胶10%)分离外膜蛋白。恒流电泳32 mA 1 h，经固定、考马斯亮兰R-250染色、脱色后观察。
1.2.4 凝胶分光光度扫描 用标准蛋白分子量与电泳蛋白带至分离胶距离在半对数坐标纸上作标准直线，根据标准直线测量分子量45KD离分离胶的距离及OprD2能被水杨酸盐抑制的特性[2]，确定OprD2的位置。用分光光度扫描仪测定OprD2的相对含量。
2 结果
2.1 20株临床分离PA和质控株ATCC27853对泰能的MIC值
2.2 外膜蛋白图谱分析
由附图可知泰能敏感株1，2产生了分子量为45 KD的OprD2，而泰能耐药株3，4，5，6OprD2均有不同程度的减少。其它主要蛋白耐药株和敏感株相比无明显差别。
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表1 20株PA对泰能的MIC值 敏感株
MIC(μg/ml)
耐药株
MIC(μg/ml)
ATCC27853
4
ATCC27853
4
1
2
1
8
2
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0.5
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7
4
7
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>32
10
1
10
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附图 绿脓杆菌OMP图谱，10%SDS-PAGE
1,2：泰能敏感株
3,4,5,6：泰能耐药株
2.3 耐药组OprD2的相对含量显著低于敏感组
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表2 耐药组与敏感组OprD2相对含量(%)的比较 编号
敏感组
编号
耐药组
OprD2相对含量(%)
OprD2相对含量(%)
1
5.9
1
3.2
2
3.4
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2.5
3
3.0
3
2.3
4
4.9
4
4.0
5
2.8
5
2.3
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6
4.1
6
2.4
7
5.5
7
3.0
8
5.0
8
2.6
9
4.7
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9
0.3
10
4.0
10
2.9
±s
4.33±1.05±s
2.47±0.92
注：t＝4.23 P<0.001
3 讨论
, 百拇医药
PA的外膜蛋白中Oprc(分子量70 KD),OprD2(分子量45 KD),OprE(分子量43 KD)均具有孔道活性[3],是分子量<350～400的小分子亲水物质进入细菌的通道。碳青霉烯类抗生素是目前临床上治疗PA感染最好的药物之一,OprD2是以泰能为代表的碳霉烯类抗生素进入菌体的特异性通道,其它的β-内酰胺类抗生素例如：头孢菌素青霉素类等不能通过OprD2通道，所以碳青霉烯类与其它的β-内酰胺类抗生素之间无交叉耐药性[4]。PA对该类药物耐药主要是由于OprD2含量减少甚至丢失引起外膜通透性下降所致,而与青霉素结合蛋白的改变、多种β-内酰胺酶水解无关。Yoneyama等人将克隆OprD的质粒转导OprD2缺失的泰能耐药株中,发现该耐药株恢复了其对泰能的敏感性,并在外膜上有OprD2的表达[5]。本文分别研究了10株临床分离的泰能耐药株和泰能敏感株外膜蛋白图谱、OprD2的相对含量,发现在SDS-PAGE图谱上与敏感株相比耐药组均有不同程度OprD2的减少;凝胶分光光度扫描定量分析耐药组OprD2的相对含量显著(P<0.001)低于敏感组,提示OprD2的减少是PA对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Lynch MJ,Drusano GL,Mobley HLT.Emergency of resistance to imipenem in pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1987;31(12):1892～1896
2，Sumita Y,Fukasawa M.Traisient carbapenem resistance induced by salicylate in Pseudomonas aerugionsa associated with suppression of outer membrane protinD2 synthesis.Antimicrob Agents Chemother,1993;37(12):2743～2746
3，Yoshihara E,Nakae T.Identification of porins in the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa that form small diffusion pores.J Bio Chem,1989;264:6297～6301
4，Watanable M,Iyobe S,Inoue M,et al.Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1991;35(1):147～151
5，Yoneyama H,Nakae T.Mechanism of efficient elimination of proteinD2.Antimicrob Agents Chemother,1993;37(11):2385～2390
收稿s, 百拇医药
单位：中山医科大学附属三院呼吸室 广州 510630
关键词：外膜蛋白D2；绿脓杆菌；碳青霉烯类；耐药性
中国现代医学杂志000402 该文采用外膜蛋白SDS-PAGE、凝胶分光光度扫描分析方法，研究该室临床分离的绿脓杆菌OprD2与耐药的关系。结果表明绿脓杆菌泰能耐药株均有不同程度OprD2的减少，耐药组OprD2的相对含量明显低于敏感组，提示OprD2的减少甚至缺失是绿脓杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
分类号 R378.99
HE RESEARCH ON PYOCYANIN IVOLUCER PROTEIN
D2(OPRD2 AND ITS DRUG-RESISTANT RELATIONSHIP
, 百拇医药
Chen Rui Tang Yingchun Zhu Jiaxin Wu Benquan
(Department of Internal Medicine, The 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Science)
In this paper, we use SDS-PAGE method and a scanning densimeter to study the relation between resistance and outer membrane protein D2 (OprD2) in Pseudomonas Aeruginosas. The results show that the amounts of OprD2 in resistant isolates are significantly lower than that of sensitive isolates, that the amounts of OprD2 are reduced respectively in all resistant isolates. In a conclusion, the reduction of OprD2 is primary element which is responsible for Pseudomonas acruginosas’s resistance to Carbapenem.
, 百拇医药
Key words:Outer membrane proteinD2; Pseudomonoas aeruginosa; Carbapeam; Resistance.
本文通过分析20株PA临床分离株外膜蛋白图谱及OprD2的相对含量，研究以泰能为代表的碳青霉烯类抗生素耐药与外膜蛋白的关系，为临床治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 20株PA临床分离株均由中山医科大学附属三院呼吸室痰标本中分离,并经法国BIOMERIEUX公司API 20NE系统鉴定。标准质控株ATCC27853为本室保存菌株。
1.1.2 培养基 Muller-Hinton肉汤、Muller-Hinton琼脂均为Difco公司产品；L-肉汤(L-B)：氯化钠5 g/l，胰蛋白胨10 g/l，酵母浸膏5 g/l，其中胰蛋白胨和酵母浸膏为Difco公司产品，氯化钠为广州化学制剂厂产品。
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1.1.3 试剂 泰能：美国Merk公司产品，批号V5595；十二烷基肌氨酸钠(N-Lauryl Sarcosine Na):Sigma公司产品；丙烯酰胺：BIO-RAD公司产品；亚甲基双丙烯酰胺：BIO-RAD公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)：日本和光纯药株式会社产品；四甲基乙二胺(TEMED)：Serva公司产品；Tris:Sigma公司产品；甘氨酸：日本和光纯药株式会社产品；蛋白质分子量标准：上海东风生化试剂厂产品。
1.1.4 仪器 L8-M低温超速离心机：美国Beckman公司产品；DF-D恒流恒压电泳仪：北京东方仪器厂产品；Mini-PROTEANⅡ垂直板电泳槽：BIO-RAD公司产品；JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机：宁波新芝科器研究所产品；HZS-H水浴恒温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；751-GW紫外分光光度计：上海分析仪器厂产品；分光光度扫描仪：美国Beckman公司产品；高速冷冻离心机：美国Beckman公司产品。
, http://www.100md.com 1.2 方法
1.2.1 体外抗菌实验及耐药菌株筛选 按常规试管双倍稀释法进行药物MIC测定。培养基为Muller-Hinton肉汤,接种菌量105cfu/ml,18～24 h后观察结果。根据1997年美国临床检验委员会标准(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS),MIC≤4 mg/L为敏感,MIC>4 mg/L为耐药。
1.2.2 外膜蛋白制备[1] 从M-H琼脂平板上挑取单个PA菌落到20 ml L-肉汤中振荡培养16 h至对数生长期。然后转种至300 ml L-肉汤中接种菌量为5%，37 ℃振荡培养20 h。7 000 rpm 4 ℃离心10 min收菌，用10 mmol/L pH7.0PBS洗涤2次并悬浮于其中。置冰浴超声碎菌4 min，每次10 s，间隔5 s。5 000 rpm 4 ℃离心15 min，弃未破碎的细胞。取上清液4 ℃ 40 000 rpm离心1 h，弃上清，将沉淀颗粒悬浮于10 mmol/L pH7.0PBS中(内含2%十二烷基肌氨酸钠)，室温作用30 min。将此混悬液30 000 rpm室温离心30 min，弃上清，并用1%十二烷基肌氨酸钠洗涤2次。提纯后的外膜蛋白悬浮于10 mmol/L pH7.0PBS中。紫外吸收法测定蛋白含量。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)＝1.450D280-0.740D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40 μg/μl，该蛋白质样品-70 ℃贮存。
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1.2.3 蛋白质电泳 蛋白样品溶于等体积样品缓冲液中，100 ℃加热5 min使蛋白质变性。经SDS-PAGE(分离胶10%)分离外膜蛋白。恒流电泳32 mA 1 h，经固定、考马斯亮兰R-250染色、脱色后观察。
1.2.4 凝胶分光光度扫描 用标准蛋白分子量与电泳蛋白带至分离胶距离在半对数坐标纸上作标准直线，根据标准直线测量分子量45KD离分离胶的距离及OprD2能被水杨酸盐抑制的特性[2]，确定OprD2的位置。用分光光度扫描仪测定OprD2的相对含量。
2 结果
2.1 20株临床分离PA和质控株ATCC27853对泰能的MIC值
2.2 外膜蛋白图谱分析
由附图可知泰能敏感株1，2产生了分子量为45 KD的OprD2，而泰能耐药株3，4，5，6OprD2均有不同程度的减少。其它主要蛋白耐药株和敏感株相比无明显差别。
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表1 20株PA对泰能的MIC值 敏感株
MIC(μg/ml)
耐药株
MIC(μg/ml)
ATCC27853
4
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附图 绿脓杆菌OMP图谱，10%SDS-PAGE
1,2：泰能敏感株
3,4,5,6：泰能耐药株
2.3 耐药组OprD2的相对含量显著低于敏感组
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表2 耐药组与敏感组OprD2相对含量(%)的比较 编号
敏感组
编号
耐药组
OprD2相对含量(%)
OprD2相对含量(%)
1
5.9
1
3.2
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2.5
3
3.0
3
2.3
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±s4.33±1.05
±s2.47±0.92
注：t＝4.23 P<0.001
3 讨论
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PA的外膜蛋白中Oprc(分子量70 KD),OprD2(分子量45 KD),OprE(分子量43 KD)均具有孔道活性[3],是分子量<350～400的小分子亲水物质进入细菌的通道。碳青霉烯类抗生素是目前临床上治疗PA感染最好的药物之一,OprD2是以泰能为代表的碳霉烯类抗生素进入菌体的特异性通道,其它的β-内酰胺类抗生素例如：头孢菌素青霉素类等不能通过OprD2通道，所以碳青霉烯类与其它的β-内酰胺类抗生素之间无交叉耐药性[4]。PA对该类药物耐药主要是由于OprD2含量减少甚至丢失引起外膜通透性下降所致,而与青霉素结合蛋白的改变、多种β-内酰胺酶水解无关。Yoneyama等人将克隆OprD的质粒转导OprD2缺失的泰能耐药株中,发现该耐药株恢复了其对泰能的敏感性,并在外膜上有OprD2的表达[5]。本文分别研究了10株临床分离的泰能耐药株和泰能敏感株外膜蛋白图谱、OprD2的相对含量,发现在SDS-PAGE图谱上与敏感株相比耐药组均有不同程度OprD2的减少;凝胶分光光度扫描定量分析耐药组OprD2的相对含量显著(P<0.001)低于敏感组,提示OprD2的减少是PA对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
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参 考 文 献
1，Lynch MJ,Drusano GL,Mobley HLT.Emergency of resistance to imipenem in pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1987;31(12):1892～1896
2，Sumita Y,Fukasawa M.Traisient carbapenem resistance induced by salicylate in Pseudomonas aerugionsa associated with suppression of outer membrane protinD2 synthesis.Antimicrob Agents Chemother,1993;37(12):2743～2746
3，Yoshihara E,Nakae T.Identification of porins in the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa that form small diffusion pores.J Bio Chem,1989;264:6297～6301
4，Watanable M,Iyobe S,Inoue M,et al.Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1991;35(1):147～151
5，Yoneyama H,Nakae T.Mechanism of efficient elimination of proteinD2.Antimicrob Agents Chemother,1993;37(11):2385～2390
收稿s, 百拇医药