人外周血IL-2活性检测两种方法的对比研究
作者：郭亚平 雷 军
单位：郭亚平(川北医学院微生物学教研室 637000)；雷 军(川北医学院药理学教研室)
关键词：IL-2；MTT比色分析法；3H-TdR掺入法
川北医学院学报/990101提要 本文采用MTT比色分析法及3H-TdR掺入法检测IL-2活性，结果显示：MTT比色法与3H-TdR掺入法测定结果一致，但是 MTT比色分析法检测IL-2活性更简便、快速、经济、实用。
The comparison of two methods in detecting the activity of IL-2 in humanperipheral blood
Guo Yaping Lei Jun
, http://www.100md.com
Department of Microbiology,Department of Pharmacology
Abstract The activity of IL-2 in human peripheral blood was measured with MTT colorimetric analysis and 3 H-TdR incorporation methods and consistent results were obtained,however the former method is more convenient,faster,cheaper and therefore more practical.
Key Words IL-2,MTT 3H-TdR analysis
白细胞介素2(Interleukin2、IL-2)在免疫应答过程中有许多重要的生物学功能，IL-2含量测定是临床疾病诊断的重要指标之一。IL-2活性测定可采用IL-2依赖株及ConA活化的小鼠脾脏细胞测定，IL-2依赖株的维持需要严格的特定的条件。因此，本文采用活化的小鼠脾母细胞通过MTT比色分析法，3H-TdR掺入法对比检测IL-2活性，以期获得效果肯定并且简便、经济、实用的IL-2活性检测方法。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1 动物 C57BL/6小鼠(北京医科大学实验动物部提供)。
1.2 试剂
1.2.1 ConA(sigma公司产品)用RPMI-1640培养液配成7μg/ml，置—20℃保存。
1.2.2 RPMI-1640培养基 GIBCO公司产品。
1.2.3 3H-TdR：上海原子能所产品，放射比活性浓度lmci/ml。
1.2.4 MTT[3-(4，5-dimethylthiazolzyl)-2-5-dipheny]:(瑞士产品)lmg/ml。
1.2.5 标准rIL-2北京医科大学免疫室提供。
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1.2.6 待测人外周血清 来自于8名正常人。
2 方法
2.1 活化脾母细胞制备 取C57BL/6小鼠脾脏，用HanK’S液研磨离心，用蒸馏水或Tris-NH3CL溶红细胞，将脾细胞浓度配成5×106/mL,加入相应ConA7μg/ml，CO2孵箱培养48h，用淋巴细胞分层液分离脾母细胞，离心2500rpm,20min,经2次洗涤后，重悬于培养液中配成1×106/mL。
2.2 3H-TdR掺入法 96孔培养板中，每孔加1×106/mL细胞100μl，再加入倍比稀释的标准rIL-2及待测人外周血清，每个样品各三个复孔，培养64h后各孔加入3H-TdR 30μl/孔，继续培养6～8h，收获细胞至玻璃纤维滤纸上，液闪仪测Cpm值。
, http://www.100md.com
2.3 MTT比色分析法 96孔培养板中，每孔加1×106/mL细胞100μl，再加入培养比稀释的标准rIL-2及待测人外周血清，每个样品各三个复孔，培养66h，各孔加入lmg/ml MTT试剂50μl/孔，继续培养4～6h后4℃过夜，弃上清，各孔加入0.04mol/L盐酸-异内醇，120μl/孔，振荡5min,30min内在ELISA-Reader上测OD值，测定波长570nm。
2.4 IL-2定量计算 以IL-2待测样品和标准品的稀释度为横轴，以检测细胞Cpm值或OD值为纵轴作图，求出IL-2标准品的最高掺入值的50%的稀释度，画找出待测样品得到50%IL-2标准品最高Cpm或OD值的稀释度。待测IL-2含量
3 结果
3H-TdR与MTT比色法检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 3H-TdR掺入法与MTT比色分析法比较(n＝8) 方法
IL-2(u/ml)
3 H-TdR掺入法
3.62±0.35
MTT比色法
3.53±0.64
t检验：p>0.05，与3H-TdR掺入法比较。
4 讨论
IL-2是人体内细胞因子中重要的淋巴因子之一，主要由T淋巴细胞产生，人体内IL-2含量的变动能直接反映人体免疫功能状况。资料显示，癌症病人及病毒感染患者其体内IL-2含量明显降低[1]。因此，IL-2含量与活性的测定对某些疾病的诊断及预后判断具有十分重要的意义。目前，有关IL-2的检测方法较多，常用的有3H-TdR掺入法。该方法的原理是：3H-TdR作为DNA合成的原料掺入至新增殖的细胞染色体中，掺入的3H-TdR的β射线量与IL-2剂量在一定范围内显正相关。由于3H-TdR掺入法所需试剂、设备昂贵，操作复杂，且试剂具有放射性污染，故推广应用十分困难。而MTT比色法是基于细胞内线粒体氧化酶可氧化黄橙色的MTT为蓝色甲瓒(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经异丙醇溶解后显色，其显色程度能准确反映出增殖细胞的活性[2]。与3H-TdR掺入法相比，MTT比色法则具有所需设备及试剂相对低廉，操作简便，特别是试剂无放射性污染等优点。本文的实验结果表明：3H-TdR掺入法与MTT比色分析法在测定IL-2活性时，虽然前者反映的是细胞DNA合成，后者反应的是细胞增殖的能量代谢，而细胞增殖与DNA合成及能量代谢密切相关，所以两种方法测定IL-2活性的结果是一致的。因此MTT比色法检测人外周血IL-2活性更适合在基层医院推广应用。
参考文献
[1] 赵满仓，刘菊林，周景林.人血清白细胞介素2含量的直接检测-ELLSA双抗夹心法.中国实验临床免疫学杂志，1995；7(1)：26～28
[2] 吴明生.MTT比色分析法在豚鼠淋巴细胞转化实验中的应用.中国实验临床免疫学杂志，1992；4(4)：10～12
(收稿日期：1999-01-19), 百拇医药
单位：郭亚平(川北医学院微生物学教研室 637000)；雷 军(川北医学院药理学教研室)
关键词：IL-2；MTT比色分析法；3H-TdR掺入法
川北医学院学报/990101提要 本文采用MTT比色分析法及3H-TdR掺入法检测IL-2活性，结果显示：MTT比色法与3H-TdR掺入法测定结果一致，但是 MTT比色分析法检测IL-2活性更简便、快速、经济、实用。
The comparison of two methods in detecting the activity of IL-2 in humanperipheral blood
Guo Yaping Lei Jun
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Department of Microbiology,Department of Pharmacology
Abstract The activity of IL-2 in human peripheral blood was measured with MTT colorimetric analysis and 3 H-TdR incorporation methods and consistent results were obtained,however the former method is more convenient,faster,cheaper and therefore more practical.
Key Words IL-2,MTT 3H-TdR analysis
白细胞介素2(Interleukin2、IL-2)在免疫应答过程中有许多重要的生物学功能，IL-2含量测定是临床疾病诊断的重要指标之一。IL-2活性测定可采用IL-2依赖株及ConA活化的小鼠脾脏细胞测定，IL-2依赖株的维持需要严格的特定的条件。因此，本文采用活化的小鼠脾母细胞通过MTT比色分析法，3H-TdR掺入法对比检测IL-2活性，以期获得效果肯定并且简便、经济、实用的IL-2活性检测方法。
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1 材料
1.1 动物 C57BL/6小鼠(北京医科大学实验动物部提供)。
1.2 试剂
1.2.1 ConA(sigma公司产品)用RPMI-1640培养液配成7μg/ml，置—20℃保存。
1.2.2 RPMI-1640培养基 GIBCO公司产品。
1.2.3 3H-TdR：上海原子能所产品，放射比活性浓度lmci/ml。
1.2.4 MTT[3-(4，5-dimethylthiazolzyl)-2-5-dipheny]:(瑞士产品)lmg/ml。
1.2.5 标准rIL-2北京医科大学免疫室提供。
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1.2.6 待测人外周血清 来自于8名正常人。
2 方法
2.1 活化脾母细胞制备 取C57BL/6小鼠脾脏，用HanK’S液研磨离心，用蒸馏水或Tris-NH3CL溶红细胞，将脾细胞浓度配成5×106/mL,加入相应ConA7μg/ml，CO2孵箱培养48h，用淋巴细胞分层液分离脾母细胞，离心2500rpm,20min,经2次洗涤后，重悬于培养液中配成1×106/mL。
2.2 3H-TdR掺入法 96孔培养板中，每孔加1×106/mL细胞100μl，再加入倍比稀释的标准rIL-2及待测人外周血清，每个样品各三个复孔，培养64h后各孔加入3H-TdR 30μl/孔，继续培养6～8h，收获细胞至玻璃纤维滤纸上，液闪仪测Cpm值。
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2.3 MTT比色分析法 96孔培养板中，每孔加1×106/mL细胞100μl，再加入培养比稀释的标准rIL-2及待测人外周血清，每个样品各三个复孔，培养66h，各孔加入lmg/ml MTT试剂50μl/孔，继续培养4～6h后4℃过夜，弃上清，各孔加入0.04mol/L盐酸-异内醇，120μl/孔，振荡5min,30min内在ELISA-Reader上测OD值，测定波长570nm。
2.4 IL-2定量计算 以IL-2待测样品和标准品的稀释度为横轴，以检测细胞Cpm值或OD值为纵轴作图，求出IL-2标准品的最高掺入值的50%的稀释度，画找出待测样品得到50%IL-2标准品最高Cpm或OD值的稀释度。待测IL-2含量
3 结果
3H-TdR与MTT比色法检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 3H-TdR掺入法与MTT比色分析法比较(n＝8) 方法
IL-2(u/ml)
3 H-TdR掺入法
3.62±0.35
MTT比色法
3.53±0.64
t检验：p>0.05，与3H-TdR掺入法比较。
4 讨论
IL-2是人体内细胞因子中重要的淋巴因子之一，主要由T淋巴细胞产生，人体内IL-2含量的变动能直接反映人体免疫功能状况。资料显示，癌症病人及病毒感染患者其体内IL-2含量明显降低[1]。因此，IL-2含量与活性的测定对某些疾病的诊断及预后判断具有十分重要的意义。目前，有关IL-2的检测方法较多，常用的有3H-TdR掺入法。该方法的原理是：3H-TdR作为DNA合成的原料掺入至新增殖的细胞染色体中，掺入的3H-TdR的β射线量与IL-2剂量在一定范围内显正相关。由于3H-TdR掺入法所需试剂、设备昂贵，操作复杂，且试剂具有放射性污染，故推广应用十分困难。而MTT比色法是基于细胞内线粒体氧化酶可氧化黄橙色的MTT为蓝色甲瓒(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经异丙醇溶解后显色，其显色程度能准确反映出增殖细胞的活性[2]。与3H-TdR掺入法相比，MTT比色法则具有所需设备及试剂相对低廉，操作简便，特别是试剂无放射性污染等优点。本文的实验结果表明：3H-TdR掺入法与MTT比色分析法在测定IL-2活性时，虽然前者反映的是细胞DNA合成，后者反应的是细胞增殖的能量代谢，而细胞增殖与DNA合成及能量代谢密切相关，所以两种方法测定IL-2活性的结果是一致的。因此MTT比色法检测人外周血IL-2活性更适合在基层医院推广应用。
参考文献
[1] 赵满仓，刘菊林，周景林.人血清白细胞介素2含量的直接检测-ELLSA双抗夹心法.中国实验临床免疫学杂志，1995；7(1)：26～28
[2] 吴明生.MTT比色分析法在豚鼠淋巴细胞转化实验中的应用.中国实验临床免疫学杂志，1992；4(4)：10～12
(收稿日期：1999-01-19), 百拇医药