Smad2蛋白在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程
作者：何文喜 牛忠英 陈健 岳玲 包柳郁
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；岳玲(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙乳头细胞； Smad2； 转化生长因子-β1；骨 形成蛋白-2
牙体牙髓牙周病学杂志000210 【摘 要】 目的：观察体外原代培养的人牙乳头细 胞内 Smad2蛋白的表达，以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1(transforming growth factor- β1, TGF-β1)信号转导中的作用。方法：原代培养人牙乳头细胞， 用TGF-β1和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein, BMP2)刺激培养的细胞，免疫组 化观察。结果：TGF-β1和BMP2刺激组均可见Smad2蛋白表达,但 与对照组相比无明显差异。TGF-β1组可见Smad2从胞浆转位至核内聚集,BMP2组未见此作用 。结论：人牙乳头细胞内存在Smad2蛋白的表达，Smad2 能特异地转导TGF-β1信号至核内发挥作用，提示TGF-β1调控成牙本质细胞分化的作用可能 是通过Smad2信号途径实现的。
, http://www.100md.com
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593 (2000)02-0081-03
Expression of Smad2 protein in human dental papilla cells and translocation process
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Sm ad2 protein in cultured human dental papilla cells (HDPC) and the role of S mad2 protein in mediating transforming growth factor-β1(TGF-β1) signaling in the HDPC. METHODS: Immunohistochemical staining of HDPC deriv ed from primary culture on stimulation from TGF-β1 or BMP2. RESULT S: The expression of protein of Smad2 protein was found in HDPC on stimulation from TGF-β1 and BMP2, but no significant difference compared with control group. Smad2 was found nuclear translocatio n acc umulation of cytoplasmical localization, but BMP2 had no function. C ONCLUSION: Smad2 is present and activated by TGF-β1 in the HDPC . Smad2 may be function as a specific downstream molecule of TGF-β1 recept ors medi ated signal transduction pathway in the HDPC.
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【Key words】 human dental papillae cells;Smad2; transfor ming growth factor-β1; bone morphogenetic protein-2
在牙齿发育过程中,成牙本质细胞的分化是由内釉上皮与基底膜下的外 胚间充质相互诱导 完成的。内釉上皮分泌的信号分子被基底膜捕获并活化,活化的信号分子与牙乳头的外胚间 充质细胞膜受体结合,引起相关基因表达并分泌，最终导致成牙本质细胞的分化完成。与成 牙 本质细胞分化有关的生长因子很多,其中TGF-β是诱导成牙本质细胞终末分化的重要信号分 子[1～3]。TGF-β与细胞膜表面TGF-β受体结合，将信号传导核内，引起基因表达 [4]。目前已经阐明TGF-β受体与配体结合方式，但是多年来人们不清楚TGF-β受 体下游的信号分子。Smads家族的发现是TGF-β信号转导的重大发现[5]。本 实验目的在于观察Smad2在人牙乳头细胞内的表达及其在TGF-β信号转导中的作用,探讨 成牙本质细胞分化的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月龄胎儿，取其牙乳头，组织块法[6]原代培养人牙乳头 细胞 。培养液为含150ml/L的胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。 取生长良好的第5代牙乳头细胞，用2.5g/L胰酶消化后，以2×104/L细胞浓度接种到24孔 板中，将处理好的盖玻片预先放到24孔板中，待细胞爬满盖玻片后，换用含100pmol/L TGF-β1(Promega)和10nmol/L BMP-2 (Promega)的2ml/L FCS的DMEM培养液培养，对照 组继续用2ml/L FCS的DMEM的培养液培养，不加任何刺激。培养1h后取出盖玻片，40g/L多聚 甲醛固定30min, 备用。
1.2 免疫组化染色
, 百拇医药
采用SABC法(武汉博士德公司试剂盒)，取固定好的细胞爬片，0.01mol/L PBS缓冲液洗5min, 2.5ml/L TritonX-100处理15min,3ml/L H2O2室温下孵育10min 以消除内源性过氧化物 酶,正常兔血清孵育30min,倾去血清，滴加1:200稀释的羊抗人Smad2抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.),4℃湿盒过夜,复温1h,滴加生物素化二抗,37℃孵育30min,滴加酶结合 物,37℃孵育30min,DAB(DAB试剂盒,棕黄色,武汉博士德公司)显微镜下控制显色,上述各步骤 后均用0.01mol/L PBS缓冲液振洗3次,每次5min,用人颌骨组织切片作为阳性对照，阴性对 照切片 则用兔血清替代一抗染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
2 结果
对照组细胞胞浆可见明显的棕黄色颗粒，表示强阳性，胞核内未见明显的棕黄色颗 粒(图1)。TGF-β1实验组可见人牙乳头细胞胞核出现明显的棕黄色颗粒，为强阳性 ，胞浆内仅见少许棕黄色颗粒(图2)。BMP2实验组和对照组无明显差异，牙乳头细胞胞浆可 见Smad2阳性表达，胞核未见表达(图3)。本实验结果表明，人牙乳头细胞存在Smad 2的表达，Smad2能特异地转导TGF-β1信号至核内发挥作用，而BMP2并不引起Smad 2转位变化。
, 百拇医药
图1 对照组人牙乳头细胞胞浆可见强阳性信号，胞核未见阳性信号 (SABC法 ×40)
图2 TGF-β1组人牙乳头细胞胞核可见强阳性信号，胞浆弱阳性信号 (SABC法 ×40)
图3 BMP-2组人牙乳头细胞胞浆可见强阳性信号，胞核未见阳性信号 (SABC法 ×40)
3 讨论
本研究结果表明，体外培养的人牙乳头细胞存在Smad2的表达，并能被TGF-β1 活化后 转位至核内发挥作用。Eppert等(1996)[7]从人肾文库中筛选出Smad2基因，并 证实Smad2是TGF-β1受体下游特异性的信号转导分子，本结果与Eppert等结果一致 。TGF-β1是诱 导成牙本质细胞分化和第三期牙本质主要的信号分子，TGF-βs和BMPs以自分泌和旁分泌的 方式调控成牙本质细胞分化[1～3]。 TGF-βs能促进成牙本质细胞表达并分泌基质 成分,如纤维粘连蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶和胶原等[1，3]。TGF-βs信号 是通过 细胞膜表面TGF-βⅠ、Ⅱ型丝/苏氨酸激酶受体介导，引起受体下游的Smads信号分子活 化并转位至核内调控靶基因转录，Smad2和Smad3是特异的TGF-β受体下游的信号分 子[5]。 本结果表明，TGF-β1刺激作用下Smad2从胞浆转位至核内聚集，而BMP-2并不引起Sma d2的转位变化，证实人牙乳头细胞内Smad2是 TGF-β1特异的细胞内信号分子。体外 实验证实，TGF-β1结合肝素能诱导牙乳头表层的牙乳头细胞发生成牙本质细胞样功能分化 [8，9]。本结果提示，TGF-β1在诱导牙乳头细胞分化形成成牙本质细胞过程中， 可能是通过Smad2转导信号至核内，作用于靶基因，如纤维粘连蛋白、骨钙素、碱性磷 酸酶和胶原等，调控 成牙本质细胞的终末分化。值得高兴的是，最近研究[10，11]证实，Smad2β 或和Smad4形成异源寡聚物转位至核内，直接和Jun家族(包括Jun-b,C-jun 和 Ju n-D)形成的AP-1转录因子结合，而骨钙素、碱性磷酸酶和胶原Ⅰ、Ⅲ基因存在AP-1结 合位点 。提示TGF-β1调控成牙本质细胞的分化机理可能是通过细胞内Smads信号分子 转导信号至核内，与转录 因子AP-1结合，调控与成牙本质细胞分化有关的基因表达，最终导致成牙本质细胞的终末分 化。
, 百拇医药
本实验证实，牙乳头细胞存在Smad2基因的表达，而且Smad2能特异性地将TGF-β1 的信号转导至核内发挥作用，提示TGF-β在成牙本质细胞分化中的重要作用可能是通过Sm ad2信号转导实现的。但是，关于牙乳头细胞Smad2的同源分子Smad3是否表达并 转导TGF-β1信号？它们的作用有何不同？有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesench ymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32(1-4):9
, 百拇医药
[3] Thesleff I , Vaahtokari A. The role of growth factors in determin ation and differentiation of the odontoblastic cell lineage. Proc Finn Dent Soc, 1992,88 (suppl 1):357
[4] Abdollah S, Macias-Sliva DM, Tsukazaki T, et al. TbetaRI ph osphorylation of Smad2 on Ser465 And Ser467 is required for Smad2-Smad4 compl ex formation and signaling. J Biol Chem,1997,272(44):27678
[5] Heldin CH,Miyazono K, Dijke PT. TGF-β signalling from cell membr ane to nucleus through Smad proteins.Nature,1997,390(4):465
, 百拇医药
[6] 吴军正，司徒镇强，陈健元,等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细胞生长 曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，3(4)：227
[7] Eppert T, Scheer S,Ozcelik H, et al. MADR2 maps to 18q21 and en codes a TGF-β-regulated MAD-related preotein that is functioning mutated in col orectal carcinoma.Cell,1996,86(4):543
[8] Begue-Kirn C, Smith AJ, Ruch JV, et al. Effect of dentin protei ns, transforming growth factor-β, and bone morphogenetic protein-2 on the diffe rentiation of odontoblasts in vitro. Int J Dev Biol, 1992,36:491
, 百拇医药
[9] Begue-Kirn C, Smith A, Loriot M, et al. Comparative analysis of TGF-βs, BMPs, IGF, msxs, fibronectin, osteonectin and bone sialoprotein gene e xpressions during normal and in vitro induced odontoblast differentiation. I nt J Dev Biol, 1994,38:405
[10] Katai H,Stephenson JD,Simkevich CP, et al. An AP-1 like motif i n the first intron of proα(CI) collagen is a critical determinant of its transc riptional activity. Mol Cell Biochem,1992,118(2):119
[11] Liberati NT,Datto MB,Frederick JP, et al. Smads bind directly to the Jun family of AP-1 transcription factors.Proc Natl Acad Sci USA, 1999,9 6 (9):4844
收稿日期：1999-11-19, 百拇医药
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；岳玲(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙乳头细胞； Smad2； 转化生长因子-β1；骨 形成蛋白-2
牙体牙髓牙周病学杂志000210 【摘 要】 目的：观察体外原代培养的人牙乳头细 胞内 Smad2蛋白的表达，以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1(transforming growth factor- β1, TGF-β1)信号转导中的作用。方法：原代培养人牙乳头细胞， 用TGF-β1和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein, BMP2)刺激培养的细胞，免疫组 化观察。结果：TGF-β1和BMP2刺激组均可见Smad2蛋白表达,但 与对照组相比无明显差异。TGF-β1组可见Smad2从胞浆转位至核内聚集,BMP2组未见此作用 。结论：人牙乳头细胞内存在Smad2蛋白的表达，Smad2 能特异地转导TGF-β1信号至核内发挥作用，提示TGF-β1调控成牙本质细胞分化的作用可能 是通过Smad2信号途径实现的。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593 (2000)02-0081-03
Expression of Smad2 protein in human dental papilla cells and translocation process
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Sm ad2 protein in cultured human dental papilla cells (HDPC) and the role of S mad2 protein in mediating transforming growth factor-β1(TGF-β1) signaling in the HDPC. METHODS: Immunohistochemical staining of HDPC deriv ed from primary culture on stimulation from TGF-β1 or BMP2. RESULT S: The expression of protein of Smad2 protein was found in HDPC on stimulation from TGF-β1 and BMP2, but no significant difference compared with control group. Smad2 was found nuclear translocatio n acc umulation of cytoplasmical localization, but BMP2 had no function. C ONCLUSION: Smad2 is present and activated by TGF-β1 in the HDPC . Smad2 may be function as a specific downstream molecule of TGF-β1 recept ors medi ated signal transduction pathway in the HDPC.
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【Key words】 human dental papillae cells;Smad2; transfor ming growth factor-β1; bone morphogenetic protein-2
在牙齿发育过程中,成牙本质细胞的分化是由内釉上皮与基底膜下的外 胚间充质相互诱导 完成的。内釉上皮分泌的信号分子被基底膜捕获并活化,活化的信号分子与牙乳头的外胚间 充质细胞膜受体结合,引起相关基因表达并分泌，最终导致成牙本质细胞的分化完成。与成 牙 本质细胞分化有关的生长因子很多,其中TGF-β是诱导成牙本质细胞终末分化的重要信号分 子[1～3]。TGF-β与细胞膜表面TGF-β受体结合，将信号传导核内，引起基因表达 [4]。目前已经阐明TGF-β受体与配体结合方式，但是多年来人们不清楚TGF-β受 体下游的信号分子。Smads家族的发现是TGF-β信号转导的重大发现[5]。本 实验目的在于观察Smad2在人牙乳头细胞内的表达及其在TGF-β信号转导中的作用,探讨 成牙本质细胞分化的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月龄胎儿，取其牙乳头，组织块法[6]原代培养人牙乳头 细胞 。培养液为含150ml/L的胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。 取生长良好的第5代牙乳头细胞，用2.5g/L胰酶消化后，以2×104/L细胞浓度接种到24孔 板中，将处理好的盖玻片预先放到24孔板中，待细胞爬满盖玻片后，换用含100pmol/L TGF-β1(Promega)和10nmol/L BMP-2 (Promega)的2ml/L FCS的DMEM培养液培养，对照 组继续用2ml/L FCS的DMEM的培养液培养，不加任何刺激。培养1h后取出盖玻片，40g/L多聚 甲醛固定30min, 备用。
1.2 免疫组化染色
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采用SABC法(武汉博士德公司试剂盒)，取固定好的细胞爬片，0.01mol/L PBS缓冲液洗5min, 2.5ml/L TritonX-100处理15min,3ml/L H2O2室温下孵育10min 以消除内源性过氧化物 酶,正常兔血清孵育30min,倾去血清，滴加1:200稀释的羊抗人Smad2抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.),4℃湿盒过夜,复温1h,滴加生物素化二抗,37℃孵育30min,滴加酶结合 物,37℃孵育30min,DAB(DAB试剂盒,棕黄色,武汉博士德公司)显微镜下控制显色,上述各步骤 后均用0.01mol/L PBS缓冲液振洗3次,每次5min,用人颌骨组织切片作为阳性对照，阴性对 照切片 则用兔血清替代一抗染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
2 结果
对照组细胞胞浆可见明显的棕黄色颗粒，表示强阳性，胞核内未见明显的棕黄色颗 粒(图1)。TGF-β1实验组可见人牙乳头细胞胞核出现明显的棕黄色颗粒，为强阳性 ，胞浆内仅见少许棕黄色颗粒(图2)。BMP2实验组和对照组无明显差异，牙乳头细胞胞浆可 见Smad2阳性表达，胞核未见表达(图3)。本实验结果表明，人牙乳头细胞存在Smad 2的表达，Smad2能特异地转导TGF-β1信号至核内发挥作用，而BMP2并不引起Smad 2转位变化。
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图1 对照组人牙乳头细胞胞浆可见强阳性信号，胞核未见阳性信号 (SABC法 ×40)
图2 TGF-β1组人牙乳头细胞胞核可见强阳性信号，胞浆弱阳性信号 (SABC法 ×40)
图3 BMP-2组人牙乳头细胞胞浆可见强阳性信号，胞核未见阳性信号 (SABC法 ×40)
3 讨论
本研究结果表明，体外培养的人牙乳头细胞存在Smad2的表达，并能被TGF-β1 活化后 转位至核内发挥作用。Eppert等(1996)[7]从人肾文库中筛选出Smad2基因，并 证实Smad2是TGF-β1受体下游特异性的信号转导分子，本结果与Eppert等结果一致 。TGF-β1是诱 导成牙本质细胞分化和第三期牙本质主要的信号分子，TGF-βs和BMPs以自分泌和旁分泌的 方式调控成牙本质细胞分化[1～3]。 TGF-βs能促进成牙本质细胞表达并分泌基质 成分,如纤维粘连蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶和胶原等[1，3]。TGF-βs信号 是通过 细胞膜表面TGF-βⅠ、Ⅱ型丝/苏氨酸激酶受体介导，引起受体下游的Smads信号分子活 化并转位至核内调控靶基因转录，Smad2和Smad3是特异的TGF-β受体下游的信号分 子[5]。 本结果表明，TGF-β1刺激作用下Smad2从胞浆转位至核内聚集，而BMP-2并不引起Sma d2的转位变化，证实人牙乳头细胞内Smad2是 TGF-β1特异的细胞内信号分子。体外 实验证实，TGF-β1结合肝素能诱导牙乳头表层的牙乳头细胞发生成牙本质细胞样功能分化 [8，9]。本结果提示，TGF-β1在诱导牙乳头细胞分化形成成牙本质细胞过程中， 可能是通过Smad2转导信号至核内，作用于靶基因，如纤维粘连蛋白、骨钙素、碱性磷 酸酶和胶原等，调控 成牙本质细胞的终末分化。值得高兴的是，最近研究[10，11]证实，Smad2β 或和Smad4形成异源寡聚物转位至核内，直接和Jun家族(包括Jun-b,C-jun 和 Ju n-D)形成的AP-1转录因子结合，而骨钙素、碱性磷酸酶和胶原Ⅰ、Ⅲ基因存在AP-1结 合位点 。提示TGF-β1调控成牙本质细胞的分化机理可能是通过细胞内Smads信号分子 转导信号至核内，与转录 因子AP-1结合，调控与成牙本质细胞分化有关的基因表达，最终导致成牙本质细胞的终末分 化。
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本实验证实，牙乳头细胞存在Smad2基因的表达，而且Smad2能特异性地将TGF-β1 的信号转导至核内发挥作用，提示TGF-β在成牙本质细胞分化中的重要作用可能是通过Sm ad2信号转导实现的。但是，关于牙乳头细胞Smad2的同源分子Smad3是否表达并 转导TGF-β1信号？它们的作用有何不同？有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesench ymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32(1-4):9
, 百拇医药
[3] Thesleff I , Vaahtokari A. The role of growth factors in determin ation and differentiation of the odontoblastic cell lineage. Proc Finn Dent Soc, 1992,88 (suppl 1):357
[4] Abdollah S, Macias-Sliva DM, Tsukazaki T, et al. TbetaRI ph osphorylation of Smad2 on Ser465 And Ser467 is required for Smad2-Smad4 compl ex formation and signaling. J Biol Chem,1997,272(44):27678
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[6] 吴军正，司徒镇强，陈健元,等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细胞生长 曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，3(4)：227
[7] Eppert T, Scheer S,Ozcelik H, et al. MADR2 maps to 18q21 and en codes a TGF-β-regulated MAD-related preotein that is functioning mutated in col orectal carcinoma.Cell,1996,86(4):543
[8] Begue-Kirn C, Smith AJ, Ruch JV, et al. Effect of dentin protei ns, transforming growth factor-β, and bone morphogenetic protein-2 on the diffe rentiation of odontoblasts in vitro. Int J Dev Biol, 1992,36:491
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[9] Begue-Kirn C, Smith A, Loriot M, et al. Comparative analysis of TGF-βs, BMPs, IGF, msxs, fibronectin, osteonectin and bone sialoprotein gene e xpressions during normal and in vitro induced odontoblast differentiation. I nt J Dev Biol, 1994,38:405
[10] Katai H,Stephenson JD,Simkevich CP, et al. An AP-1 like motif i n the first intron of proα(CI) collagen is a critical determinant of its transc riptional activity. Mol Cell Biochem,1992,118(2):119
[11] Liberati NT,Datto MB,Frederick JP, et al. Smads bind directly to the Jun family of AP-1 transcription factors.Proc Natl Acad Sci USA, 1999,9 6 (9):4844
收稿日期：1999-11-19, 百拇医药