SFE-CGC法测定四神丸中主要成分的含量
作者：陈 伟 陈 斌
单位：陈 伟 福州医学高等专科学校；陈 斌 上海第二军医大学药学院
关键词：超临界流体萃取；四神丸；补骨脂素；异补骨脂素；毛细管气相色谱
海峡药学990225 摘要 目的建立超临界流体萃取(SFE)技术和毛细管气相色谱(CGC)非在线联用技术测定中成药四神丸中的主要成分。本文以SFE法样品前处理，采用含5%苯基硅氧烷交联毛细管柱，蒽作为内标进行定量试验。结果四神丸中的补骨脂素和异补骨脂素的含量分别为：补骨脂素0.89 mg/g，异补骨脂素1.03 mg/g，说明SFE-CGC法是四神丸质量控制的快速可靠、准确灵敏的方法。
Determination of Major Components in Shishenwan Using SFE-CGC
, http://www.100md.com
Chen Wei，Chen Bin
(Research Lab of Pharmacology，Fuzhou Military Medical College)
Abstract A method based on the off-line coupling of SFE and CGC has been established for quantitative analysis of major components in Shishenwan.Samples prepared by SFE were analyzed upon follow condition：crosslinked 5% Ph Me Silicone as stationary phase；FID detector，anthracene as internal standard.The content of psoralen and isopsoralen are 0.89 mg/g and 1.03mg/g respectly in Shishenwan.SFE-CGC method can be used in the quality control of Chinese patent medicinals.
, 百拇医药
Key words Supercritical fluid extraction Shishenwan Psoralen Isopsoralen CGC
中成药成分复杂，用现代分析技术进行质量控制的研究，必须先经提取分离。而传统的萃取方法，萃取时间长，不完全，后分析复杂，且环境污染重，越来越不适应当今药学的发展。超临界流体萃取(SFE)是近代分离领域内的先进的样品制备技术，具有传质速度快、萃取效率高、无毒、经济、操作简便、选择性好等优于传统溶剂萃取法的特点[1]。四神丸是由补骨脂、肉豆蔻、五味子、吴茱萸和大枣加工而成的中成药，具有温肾暖脾、涩肠止泻作用。用于命门火衰，脾肾虚寒，五更泄泻或便溏腹痛，腰酸肢冷。已有作者报道采用高效液相色谱法进行含量测定[2]，本文以药中主要成分补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素为定量指标，系统地考察了影响超临界流体萃取的诸因素，筛选出压力、温度、改性剂加入量、CO2动态萃取量和静态萃取时间等5个变量的最佳条件。用毛细管气相色谱进行定量，结果快速、准确、灵敏、分辨率好。
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1 仪器与试药
1.1 仪器 DM 100 注射泵，SFX2-10萃取器(美国ISCO公司)，气相色谱仪HP-5890 Series Ⅱ，FID检测器，HP-5柱(Crosslinked 5% Ph Me Silicone，25 m×0.32 mm×0.52 μm)。HP-3365化学工作站(美国Hewlett-Packard公司)，HM-202十万分之一电子天平(日本A＆G有限公司)。
1.2 试药 补骨脂素和异补骨脂素(中国药品生物制品检定所)；蒽(光谱纯)，上海试剂一厂；四神丸(上海中药一厂)。
1.3 标准溶液 精密称取105℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素适量，分别用乙酸乙酯配成0.548 mg/ml和0.534 mg/ml溶液，置4℃冰箱放置。
1.4 内标液配制 精密称取蒽适量，用乙酸乙酯配成1.035 mg/ml溶液，置4℃冰箱放置。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件 气化温度250℃，检测器温度280℃，柱温210℃，载气N2，柱头压55 kPa，分流比50∶1，内标为蒽，进样量：1 μl。
2.2 标准曲线制备 分取标准液20、40、80、160、500 μl于10 ml量瓶中，注入内标溶液100 μl，稀释至刻度，进行气相色谱分析。以峰面积比(Y)对含量(X)作回归计算，得回归方程：补骨脂素Y＝32.53X-1.840×10-2，r＝0.9999；异补骨脂素Y＝34.53X+6.832×10-3，r＝0.9998，线性范围为1.096～27.40 ng和1.068～26.70 ng。
2.3 萃取条件的选择 固定萃取条件，分别以氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为改性剂，以氯仿所得效率最高，本实验选择氯仿。固定其它参数，压力从24.5～45.5 mPa，每隔7 mPa萃取测定1个点；温度从50～80℃，每隔10℃萃取测定1个点；改性剂加入量从0～150 μl，每隔50 μl萃取测定1个点；动态萃取量从2～8 ml，每隔2 ml萃取测定1个点；静态萃取时间从0～9 min，每隔3 min萃取测定1个点，结果(见图2)。
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通过以上试验，可确定最佳萃取条件为：压力38.5 mPa，温度70℃，改性剂加入量50 μl，动态萃取体积6 ml，静态萃取时间2 min。
2.4 SFE萃取 分别精称3份碾碎后过100目筛的腰痛片干燥药粉约100 mg置萃取池中，按最佳萃取条件操作，用适量乙酸乙酯吸收，精取内标100 μl，定容至10 ml。
2.5 含量测定 萃取液进样1 μl，色谱图(见图1)，计算补骨脂和异补骨脂的含量，结果为补骨脂素：0.89 mg/g(RSD＝3.32%，n＝3)，异补骨脂素：1.03 mg/g(RSD＝2.53%，n＝3)。
图1 对照品(A)和腰痛片(B)的气相色谱图
1.异补骨脂素 2.补骨脂素 3.蒽
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2.6 加样回收试验 在药粉中定量加入标准液0.4 ml，吹干，测定方法相同，测得加样回收率，补骨脂素97.56%(RSD＝2.31%，n＝3)，异补骨脂素108.79%(RSD＝3.28%，n＝3)。
2.7 精密度试验 按样品测定方法分别对标准品补骨脂素和异补骨脂素重复进样5次，每次1 μl，测得峰面积比的RSD分别为1.21%和1.36%。
图2 SFE影响因素系统法最优化的结果
(A：压力；B：温度；C：改性剂量；D：动态萃取体；E：静态萃取时间)
3 讨论
从图2中可以看出，改性剂加入量的斜率最大，因此其影响最大，但改性剂量不宜加得太多，否则杂质也增加，易污染毛细管柱，此外还易造成萃取仪中限流管的堵塞；压力影响其次，温度和静态萃取时间的影响较小。
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该方法操作简便，快速，整个过程20 min内即可完成；CO2价格低廉、无毒、不可燃、化学惰性及易挥发；此外，SFE具有良好的选择性，样品萃取后无须预处理可直接进样，节约了大量时间和精力；CGC对补骨脂素和异补骨脂素的分离效果非常好，在完全分离的情况下还能在两峰之间插入内标蒽，测量结果准确可靠、重现性好。因此SFE和CGC联用技术在该类药物的质量控制方面有着重要意义。
参考文献
1.缪海均等：超临界流体萃取法-毛细管色相色谱法分析厚朴酚、和厚朴酚的含量 药物分析杂志，1998；18(3)：182
2.谭生建等：高效液相色谱法测定补骨脂和四神丸中两种有效成分色谱1993；11(6)：354, 百拇医药
单位：陈 伟 福州医学高等专科学校；陈 斌 上海第二军医大学药学院
关键词：超临界流体萃取；四神丸；补骨脂素；异补骨脂素；毛细管气相色谱
海峡药学990225 摘要 目的建立超临界流体萃取(SFE)技术和毛细管气相色谱(CGC)非在线联用技术测定中成药四神丸中的主要成分。本文以SFE法样品前处理，采用含5%苯基硅氧烷交联毛细管柱，蒽作为内标进行定量试验。结果四神丸中的补骨脂素和异补骨脂素的含量分别为：补骨脂素0.89 mg/g，异补骨脂素1.03 mg/g，说明SFE-CGC法是四神丸质量控制的快速可靠、准确灵敏的方法。
Determination of Major Components in Shishenwan Using SFE-CGC
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Chen Wei，Chen Bin
(Research Lab of Pharmacology，Fuzhou Military Medical College)
Abstract A method based on the off-line coupling of SFE and CGC has been established for quantitative analysis of major components in Shishenwan.Samples prepared by SFE were analyzed upon follow condition：crosslinked 5% Ph Me Silicone as stationary phase；FID detector，anthracene as internal standard.The content of psoralen and isopsoralen are 0.89 mg/g and 1.03mg/g respectly in Shishenwan.SFE-CGC method can be used in the quality control of Chinese patent medicinals.
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Key words Supercritical fluid extraction Shishenwan Psoralen Isopsoralen CGC
中成药成分复杂，用现代分析技术进行质量控制的研究，必须先经提取分离。而传统的萃取方法，萃取时间长，不完全，后分析复杂，且环境污染重，越来越不适应当今药学的发展。超临界流体萃取(SFE)是近代分离领域内的先进的样品制备技术，具有传质速度快、萃取效率高、无毒、经济、操作简便、选择性好等优于传统溶剂萃取法的特点[1]。四神丸是由补骨脂、肉豆蔻、五味子、吴茱萸和大枣加工而成的中成药，具有温肾暖脾、涩肠止泻作用。用于命门火衰，脾肾虚寒，五更泄泻或便溏腹痛，腰酸肢冷。已有作者报道采用高效液相色谱法进行含量测定[2]，本文以药中主要成分补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素为定量指标，系统地考察了影响超临界流体萃取的诸因素，筛选出压力、温度、改性剂加入量、CO2动态萃取量和静态萃取时间等5个变量的最佳条件。用毛细管气相色谱进行定量，结果快速、准确、灵敏、分辨率好。
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1 仪器与试药
1.1 仪器 DM 100 注射泵，SFX2-10萃取器(美国ISCO公司)，气相色谱仪HP-5890 Series Ⅱ，FID检测器，HP-5柱(Crosslinked 5% Ph Me Silicone，25 m×0.32 mm×0.52 μm)。HP-3365化学工作站(美国Hewlett-Packard公司)，HM-202十万分之一电子天平(日本A＆G有限公司)。
1.2 试药 补骨脂素和异补骨脂素(中国药品生物制品检定所)；蒽(光谱纯)，上海试剂一厂；四神丸(上海中药一厂)。
1.3 标准溶液 精密称取105℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素适量，分别用乙酸乙酯配成0.548 mg/ml和0.534 mg/ml溶液，置4℃冰箱放置。
1.4 内标液配制 精密称取蒽适量，用乙酸乙酯配成1.035 mg/ml溶液，置4℃冰箱放置。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件 气化温度250℃，检测器温度280℃，柱温210℃，载气N2，柱头压55 kPa，分流比50∶1，内标为蒽，进样量：1 μl。
2.2 标准曲线制备 分取标准液20、40、80、160、500 μl于10 ml量瓶中，注入内标溶液100 μl，稀释至刻度，进行气相色谱分析。以峰面积比(Y)对含量(X)作回归计算，得回归方程：补骨脂素Y＝32.53X-1.840×10-2，r＝0.9999；异补骨脂素Y＝34.53X+6.832×10-3，r＝0.9998，线性范围为1.096～27.40 ng和1.068～26.70 ng。
2.3 萃取条件的选择 固定萃取条件，分别以氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为改性剂，以氯仿所得效率最高，本实验选择氯仿。固定其它参数，压力从24.5～45.5 mPa，每隔7 mPa萃取测定1个点；温度从50～80℃，每隔10℃萃取测定1个点；改性剂加入量从0～150 μl，每隔50 μl萃取测定1个点；动态萃取量从2～8 ml，每隔2 ml萃取测定1个点；静态萃取时间从0～9 min，每隔3 min萃取测定1个点，结果(见图2)。
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通过以上试验，可确定最佳萃取条件为：压力38.5 mPa，温度70℃，改性剂加入量50 μl，动态萃取体积6 ml，静态萃取时间2 min。
2.4 SFE萃取 分别精称3份碾碎后过100目筛的腰痛片干燥药粉约100 mg置萃取池中，按最佳萃取条件操作，用适量乙酸乙酯吸收，精取内标100 μl，定容至10 ml。
2.5 含量测定 萃取液进样1 μl，色谱图(见图1)，计算补骨脂和异补骨脂的含量，结果为补骨脂素：0.89 mg/g(RSD＝3.32%，n＝3)，异补骨脂素：1.03 mg/g(RSD＝2.53%，n＝3)。
图1 对照品(A)和腰痛片(B)的气相色谱图
1.异补骨脂素 2.补骨脂素 3.蒽
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2.6 加样回收试验 在药粉中定量加入标准液0.4 ml，吹干，测定方法相同，测得加样回收率，补骨脂素97.56%(RSD＝2.31%，n＝3)，异补骨脂素108.79%(RSD＝3.28%，n＝3)。
2.7 精密度试验 按样品测定方法分别对标准品补骨脂素和异补骨脂素重复进样5次，每次1 μl，测得峰面积比的RSD分别为1.21%和1.36%。
图2 SFE影响因素系统法最优化的结果
(A：压力；B：温度；C：改性剂量；D：动态萃取体；E：静态萃取时间)
3 讨论
从图2中可以看出，改性剂加入量的斜率最大，因此其影响最大，但改性剂量不宜加得太多，否则杂质也增加，易污染毛细管柱，此外还易造成萃取仪中限流管的堵塞；压力影响其次，温度和静态萃取时间的影响较小。
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该方法操作简便，快速，整个过程20 min内即可完成；CO2价格低廉、无毒、不可燃、化学惰性及易挥发；此外，SFE具有良好的选择性，样品萃取后无须预处理可直接进样，节约了大量时间和精力；CGC对补骨脂素和异补骨脂素的分离效果非常好，在完全分离的情况下还能在两峰之间插入内标蒽，测量结果准确可靠、重现性好。因此SFE和CGC联用技术在该类药物的质量控制方面有着重要意义。
参考文献
1.缪海均等：超临界流体萃取法-毛细管色相色谱法分析厚朴酚、和厚朴酚的含量 药物分析杂志，1998；18(3)：182
2.谭生建等：高效液相色谱法测定补骨脂和四神丸中两种有效成分色谱1993；11(6)：354, 百拇医药
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