腹主动脉瘤病因新探讨
作者：徐 东 王京生 万 峰 MJ West Kim Summers Philip Walker
单位：徐 东 王京生 万 峰(北京大学人民医院心外科邮政编码 100044)；MJ West Kim Summers Philip Walker(Prince Charles Hospital,Australia 4032)
关键词：腹主动脉瘤；遗传因素；基因
北京医学000612 【摘要】 目的 证实家族性因素和遗传性因素在腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)发病中的作用。方法 308例澳大利亚欧洲腹主动脉瘤病人和110例健康对照组以及男女各40例的新生儿对照组。对动脉壁四种重要结构蛋白基因进行等位基因分析。等位基因频率分析采用Sham and Curtis方法。结果 50例AAA病人至少有一例直系亲属患有AAA。在539例存活的同代亲属中，14例查出AAA，其中12例已施行了手术治疗。对74例同代亲属筛选发现4例患有轻度主动脉扩张，6例患有中到重度主动脉扩张。女性病人与对照组之间及女性病人与男性病人之间，COL1A2基因的等位基因频率具有统计学差别。结论 在本组病例中遗传性因素在AAA发病中起着重要作用。COL1A2在男女AAA发病中作用不同，其详细机制有待进一步探讨。
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New approach to the cause of abdominal aortic aneurysm
Xu Dong,Wang Jingsheng,Wan Feng
(Department of Cardiac Surgery,People's Hospital,Beijing University,Beijing 100044)
【Abstract】 Objective To confirm the role of familial and genetic factors in the development of AAA.Methods 308 Australia European AAA patients,110 healthy elderly controls and neonatal controls (male 40,female 40) were obtained.Allele frequency was analysed for four main structural protein genes of aorta.Relative allele frequency was analysed using the method of Sham and Curtis.Results The allele frequencies of COL1A2 gene were significantly different between male AAA and female AAA and between female AAA and female controls.Fifty index cases had at least one first degree relative affected.Fourteen of the 539 alive siblings had known aneurysmal disease and 12 of those had had surgical repair.Seventy-four living siblings were screened.Four had mild aortic dilatation and six had moderate to severe aortic dilatation.Conclusions Genetic factors are significant elements in the development of AAA.COL1A2 is playing different role in the development of AAA between male and female subjects,the mechanism of this difference needs further study.
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【Key words】 Abdominal aortic aneurysm Genetic factors Gene
遗传性因素导致了许多疾病的发生。大多数情况下，疾病是许多基因和环境因素相互作用的结果。这些疾病有家族遗传倾向，但是不按照预定的方式遗传。腹主动脉瘤(AAA)就是一种多基因相互作用而形成的结缔组织疾病[1，2]。文献报道阳性家族史是患有AAA重要的危险因素[1，3]。腹主动脉瘤破裂的死亡率为80%[4]。为减少AAA的死亡率，对于高危AAA个体早期诊断显得非常重要。主动脉壁主要成分为胶原纤维和弹性纤维。为了阐述遗传性因素在AAA发病中的作用，本文选择了四个结构蛋白基因作为突破口：构成弹性纤维重要成分的原纤维蛋白基因(fibrillin)、弹性蛋白基因(elastin)、胶原纤维3型基因(collagenⅢal,COL3A1)、胶原纤维1型基因(collagenⅠa2,COL1A2)。
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材料与方法
一、临床研究
检测腹主动脉直径最常用的方法是超声学检查及CT检查。本研究中所有病人腹部超声资料来自于Royal Brisbane Hospital,Princess Alexandra Hospital和Redcliff Hospital三家医院。从门诊和医院信息中心获得临床病史及发病危险因素资料。当病人的肾下腹主动脉段直径超过同年龄段、同性别正常腹主动脉直径的1.5倍，就可确诊为腹主动脉瘤[5，6]。然而腹主动脉扩张小于正常肾下腹主动脉直径的50%，只能诊断为腹主动脉扩张[6]。本组每一个腹主动脉瘤病人在门诊抽静脉血10ml用于DNA提取，同时对所有病人和可以联系得到的病人亲属进行了体检及主动脉超声检查。我们还收集了有关心血管发病危险因素、腹主动脉瘤病史、腹主动脉瘤大小及发病年龄的临床资料。本文对照组分成人对照组及新生儿两组。成人对照组110例(男女各55例，平均年龄为65±8岁)，以及男女各80例的新生儿对照组。分别从两个对照组每一个个体中采取静脉血5ml作为DNA提取用。对照组皆为欧洲人。
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二、微卫星DNA多态性研究
用于扩增DNA所需的引物及PCR扩增条件可在基因库上查到。病人及对照组扩增后的DNA用于微卫星DNA多态性的检测。上文提及的结缔组织蛋白基因微卫星DNA多态性的检测是通过放射性末端标记、DNA扩增、聚丙烯纤胺电泳、放射性自显影、结果分析五个步骤完成的。其中elastin、COL3A1、COL1A2基因的放射性末端标记，DNA扩增条件相同。
引物5’末端在0.027μl T4多聚核苷酸激酶(10U/μl，New England Biolabs)，80mmol/L Tris-HCl，pH7.6及0.033μl 10倍浓度的激酶缓冲剂(10x，New England Biolabs)，用0.08μl[γ32P]dATP(6 000Ci/mmol/L,Amersham,UK)进行标记。将上述混合物在100℃温箱里加温30秒以便使激酶失活。标准的DNA扩增反应包括50～100ng DNA，0.2mmol/L dNTP，1.5～2mmol/L MgCl2，标记及未标记的4.0μmol/L的引物，一倍浓度的PCR缓冲剂(Perkin Elmer)及0.5U taqDNA聚合酶(5U/μl,Perkin Elmer)。
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BioRadSequiGen电泳仪用于微卫星DNA电泳分析。PCR扩增产物在0.5倍TBE(45mmol/L Tris-Borate,1mmol/L EDTA,pH 8.0)缓冲剂，55℃恒温中进行电泳。聚丙烯纤胺电泳胶(Accu Gel,Hull,England)厚度和浓度分别为0.35mm、7%。电泳时间在2～4小时，取决于放大片段的大小。电泳完毕，将电泳胶固定于固定液中(10%甲醇，10%乙酸)20分钟，转移到Whatman纸(Whatman,Springfield Mill,Maidstone Kent,USA)，然后在干胶机上(Model SE 160,Hoefer Scientific Instruments,SanFrancisco,CA,USA)干胶30分钟。将干胶放在装有Kodak胶片的暗盒里曝光一夜，最后在富士洗片机上显影洗像。
放射性自显影后，对每一位病人的等位基因的基因型分别进行确定。所有个体的基因型的判定都由两个人共同完成。对于基因型不明确的病例，重复实验来明确基因型。
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三、统计学方法
对于四种预选基因各组之间等位基因的多态性的分析，采用Sham和Curtis统计学分析方法[7]。
结 果
一、本组共收集了308例AAA病人(男252例，女56例)，平均年龄为70±9岁。在AAA组中，66%有吸烟史，56%患有高血压，7%有糖尿病，高胆固醇血占26%。对照组一为老年健康对照组(男女各55例)，平均年龄为65±8岁。对照组二为新生儿对照组(男女各40例)。另外搜集的935例AAA病人同代亲属中，其中396例病故。这396例中的14例亲属死于主动脉破裂。在539例存活的亲属中，14例患有动脉瘤，而这14例中的12例已施行了动脉瘤手术。
二、对存活的539例亲属中的74例进行了仔细筛选，其中4例患有轻度主动脉扩张，6例患有中到严重程度的主动脉扩张。在308例AAA病人中，50例先证者至少有一例直系亲属患有AAA。另外还从29个家庭中筛选出38例患有AAA的同代亲属。
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三、胶原纤维1型基因的微卫星多态性是由于7号染色体(7q21.3-q22.1)上三核苷酸重复片段造成的。相关的等位基因3，4，5及6列在英特网上的GDB(Genome Data Base,http//www.gdb.org.gdb-bin.general/hgd/)，基因片段大小范围在264～273bp之间。等位基因基因型判断结果显示，男性与女性AAA病人之间及女性病人与两组女性对照组之间的等位基因频率存在显著性差异。男女AAA病人等位基因3频率有显著性差异，P=0.016。女性AAA病人与二对照组间的等位基因3有显著性差异，P=0.001。本研究还对COL3A1、ELN及FBN1三个基因进行了微卫星DNA多态性的研究与比较，结果各组之间无显著性差异。
讨 论
主动脉破裂仍然是腹主动脉瘤最严重的并发症。如果能早期诊断早期治疗，其死亡率可以大大降低。患有AAA的病人仍然有患有其他部位动脉瘤的危险。任何提高AAA的检出率都可以改善AAA的治疗。本组主要对遗传因素在AAA发病中的作用进行了研究。
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一、本组共搜集了AAA病人308例及同代亲属935例。心血管高危因素在这组AAA病人中是非常普遍的病因。吸烟、高血压、高胆固醇血症是最重要的发病因素。然而，遗传因素在AAA的发病中已越来越引起人们的重视，对传统的AAA发病原理提出了挑战。本研究中的308例AAA病人中，50例患者至少有一例直系亲属患有AAA(17%)。如果完成所有AAA病人直系亲属的筛选工作，这种家族性AAA的发病率将会更高。这个结果证实了家族史是AAA非常重要的发病因素。然而，澳大利亚悉尼1995年一项研究表明，在对132例AAA病人的52例亲属筛选中，没有发现AAA病人。这组接受筛选的家属平均年龄为53岁，要比本研究平均筛选年龄小12岁。两个研究结果对比可以得知，选择适当年龄的AAA亲属进行临床筛选对于提高检出率是非常重要的。
二、对于四个基因的筛选，病人与对照组的统计学差异仅见于COL1A2基因。这种区别见于男女AAA病人之间及女性AAA与女性对照组之间，这是由于该基因的3号等位基因缺乏导致的。可能是COL1A2等位基因3在女性个体中可以阻碍腹主动脉瘤的形成。COL1A2基因，尤其是等位基因3在AAA发生发展中的作用有待进一步探讨研究。
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三、目前认为，AAA是由于多种病因引起的一种结缔组织疾病。遗传因素在AAA的发生发展中起着重要的作用。虽然有报道COL3A1基因突变可引起显性遗传的AAA，但是，本研究还没有发现具有结论性的证据来证实该基因在AAA中的作用。
在寻找一个可以引起AAA的基因研究中，编码结构蛋白基因及参与细胞外基质代谢的基因应该作为候选基因。本文着重研究了构成主动脉基本结构因素基因，因此，负责编码蛋白沉积和降解的基因应该作为下一步研究重点。
参 考 文 献
1.Webster MW,St Jean PL,Steed DL,et al.Abdominal aortic aneurysm:result of a family study.J Vasc Surg,1991,13:366.
2.Norrgard O,Rais O,Angqvist KA.Familial occurrence of abdominal aortic aneurysms.Surgery,1984,95:650.
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3.Darling RC III,Brewster DC,Darling RC,et al.Are familial abdominal aortic aneurysm different? J Vasc Surg,1980,10:39.
4.Ingoldby CJH,Wujianto R,Mitchell JE.Impact of vascular surgery on community mortality from ruptured aortic aneurysms.Br J Surg,1986,73:551.
5.Johnston KW,Rutherford RB,Tilson DM,et al.Suggested standards for reporting on arterial aneurysms.J Vasc Surg,1991,13:444.
6.Verloes A,Sakalihasan N,Limet R,Aneurysms of abdominal aorta:familial and genetic aspects in three hundred thirteen pedigrees.J Vasc Surg,1995,21:646.
7.Sham PC,Curtis DM.Carlo tests for associations between disease and growth factor (EGF)-highly polymorphic loci.Ann Hum Genet,1995,59:97.
(收稿：2000-05-15 修回：2000-10-08), 百拇医药
单位：徐 东 王京生 万 峰(北京大学人民医院心外科邮政编码 100044)；MJ West Kim Summers Philip Walker(Prince Charles Hospital,Australia 4032)
关键词：腹主动脉瘤；遗传因素；基因
北京医学000612 【摘要】 目的 证实家族性因素和遗传性因素在腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)发病中的作用。方法 308例澳大利亚欧洲腹主动脉瘤病人和110例健康对照组以及男女各40例的新生儿对照组。对动脉壁四种重要结构蛋白基因进行等位基因分析。等位基因频率分析采用Sham and Curtis方法。结果 50例AAA病人至少有一例直系亲属患有AAA。在539例存活的同代亲属中，14例查出AAA，其中12例已施行了手术治疗。对74例同代亲属筛选发现4例患有轻度主动脉扩张，6例患有中到重度主动脉扩张。女性病人与对照组之间及女性病人与男性病人之间，COL1A2基因的等位基因频率具有统计学差别。结论 在本组病例中遗传性因素在AAA发病中起着重要作用。COL1A2在男女AAA发病中作用不同，其详细机制有待进一步探讨。
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New approach to the cause of abdominal aortic aneurysm
Xu Dong,Wang Jingsheng,Wan Feng
(Department of Cardiac Surgery,People's Hospital,Beijing University,Beijing 100044)
【Abstract】 Objective To confirm the role of familial and genetic factors in the development of AAA.Methods 308 Australia European AAA patients,110 healthy elderly controls and neonatal controls (male 40,female 40) were obtained.Allele frequency was analysed for four main structural protein genes of aorta.Relative allele frequency was analysed using the method of Sham and Curtis.Results The allele frequencies of COL1A2 gene were significantly different between male AAA and female AAA and between female AAA and female controls.Fifty index cases had at least one first degree relative affected.Fourteen of the 539 alive siblings had known aneurysmal disease and 12 of those had had surgical repair.Seventy-four living siblings were screened.Four had mild aortic dilatation and six had moderate to severe aortic dilatation.Conclusions Genetic factors are significant elements in the development of AAA.COL1A2 is playing different role in the development of AAA between male and female subjects,the mechanism of this difference needs further study.
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【Key words】 Abdominal aortic aneurysm Genetic factors Gene
遗传性因素导致了许多疾病的发生。大多数情况下，疾病是许多基因和环境因素相互作用的结果。这些疾病有家族遗传倾向，但是不按照预定的方式遗传。腹主动脉瘤(AAA)就是一种多基因相互作用而形成的结缔组织疾病[1，2]。文献报道阳性家族史是患有AAA重要的危险因素[1，3]。腹主动脉瘤破裂的死亡率为80%[4]。为减少AAA的死亡率，对于高危AAA个体早期诊断显得非常重要。主动脉壁主要成分为胶原纤维和弹性纤维。为了阐述遗传性因素在AAA发病中的作用，本文选择了四个结构蛋白基因作为突破口：构成弹性纤维重要成分的原纤维蛋白基因(fibrillin)、弹性蛋白基因(elastin)、胶原纤维3型基因(collagenⅢal,COL3A1)、胶原纤维1型基因(collagenⅠa2,COL1A2)。
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材料与方法
一、临床研究
检测腹主动脉直径最常用的方法是超声学检查及CT检查。本研究中所有病人腹部超声资料来自于Royal Brisbane Hospital,Princess Alexandra Hospital和Redcliff Hospital三家医院。从门诊和医院信息中心获得临床病史及发病危险因素资料。当病人的肾下腹主动脉段直径超过同年龄段、同性别正常腹主动脉直径的1.5倍，就可确诊为腹主动脉瘤[5，6]。然而腹主动脉扩张小于正常肾下腹主动脉直径的50%，只能诊断为腹主动脉扩张[6]。本组每一个腹主动脉瘤病人在门诊抽静脉血10ml用于DNA提取，同时对所有病人和可以联系得到的病人亲属进行了体检及主动脉超声检查。我们还收集了有关心血管发病危险因素、腹主动脉瘤病史、腹主动脉瘤大小及发病年龄的临床资料。本文对照组分成人对照组及新生儿两组。成人对照组110例(男女各55例，平均年龄为65±8岁)，以及男女各80例的新生儿对照组。分别从两个对照组每一个个体中采取静脉血5ml作为DNA提取用。对照组皆为欧洲人。
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二、微卫星DNA多态性研究
用于扩增DNA所需的引物及PCR扩增条件可在基因库上查到。病人及对照组扩增后的DNA用于微卫星DNA多态性的检测。上文提及的结缔组织蛋白基因微卫星DNA多态性的检测是通过放射性末端标记、DNA扩增、聚丙烯纤胺电泳、放射性自显影、结果分析五个步骤完成的。其中elastin、COL3A1、COL1A2基因的放射性末端标记，DNA扩增条件相同。
引物5’末端在0.027μl T4多聚核苷酸激酶(10U/μl，New England Biolabs)，80mmol/L Tris-HCl，pH7.6及0.033μl 10倍浓度的激酶缓冲剂(10x，New England Biolabs)，用0.08μl[γ32P]dATP(6 000Ci/mmol/L,Amersham,UK)进行标记。将上述混合物在100℃温箱里加温30秒以便使激酶失活。标准的DNA扩增反应包括50～100ng DNA，0.2mmol/L dNTP，1.5～2mmol/L MgCl2，标记及未标记的4.0μmol/L的引物，一倍浓度的PCR缓冲剂(Perkin Elmer)及0.5U taqDNA聚合酶(5U/μl,Perkin Elmer)。
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BioRadSequiGen电泳仪用于微卫星DNA电泳分析。PCR扩增产物在0.5倍TBE(45mmol/L Tris-Borate,1mmol/L EDTA,pH 8.0)缓冲剂，55℃恒温中进行电泳。聚丙烯纤胺电泳胶(Accu Gel,Hull,England)厚度和浓度分别为0.35mm、7%。电泳时间在2～4小时，取决于放大片段的大小。电泳完毕，将电泳胶固定于固定液中(10%甲醇，10%乙酸)20分钟，转移到Whatman纸(Whatman,Springfield Mill,Maidstone Kent,USA)，然后在干胶机上(Model SE 160,Hoefer Scientific Instruments,SanFrancisco,CA,USA)干胶30分钟。将干胶放在装有Kodak胶片的暗盒里曝光一夜，最后在富士洗片机上显影洗像。
放射性自显影后，对每一位病人的等位基因的基因型分别进行确定。所有个体的基因型的判定都由两个人共同完成。对于基因型不明确的病例，重复实验来明确基因型。
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三、统计学方法
对于四种预选基因各组之间等位基因的多态性的分析，采用Sham和Curtis统计学分析方法[7]。
结 果
一、本组共收集了308例AAA病人(男252例，女56例)，平均年龄为70±9岁。在AAA组中，66%有吸烟史，56%患有高血压，7%有糖尿病，高胆固醇血占26%。对照组一为老年健康对照组(男女各55例)，平均年龄为65±8岁。对照组二为新生儿对照组(男女各40例)。另外搜集的935例AAA病人同代亲属中，其中396例病故。这396例中的14例亲属死于主动脉破裂。在539例存活的亲属中，14例患有动脉瘤，而这14例中的12例已施行了动脉瘤手术。
二、对存活的539例亲属中的74例进行了仔细筛选，其中4例患有轻度主动脉扩张，6例患有中到严重程度的主动脉扩张。在308例AAA病人中，50例先证者至少有一例直系亲属患有AAA。另外还从29个家庭中筛选出38例患有AAA的同代亲属。
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三、胶原纤维1型基因的微卫星多态性是由于7号染色体(7q21.3-q22.1)上三核苷酸重复片段造成的。相关的等位基因3，4，5及6列在英特网上的GDB(Genome Data Base,http//www.gdb.org.gdb-bin.general/hgd/)，基因片段大小范围在264～273bp之间。等位基因基因型判断结果显示，男性与女性AAA病人之间及女性病人与两组女性对照组之间的等位基因频率存在显著性差异。男女AAA病人等位基因3频率有显著性差异，P=0.016。女性AAA病人与二对照组间的等位基因3有显著性差异，P=0.001。本研究还对COL3A1、ELN及FBN1三个基因进行了微卫星DNA多态性的研究与比较，结果各组之间无显著性差异。
讨 论
主动脉破裂仍然是腹主动脉瘤最严重的并发症。如果能早期诊断早期治疗，其死亡率可以大大降低。患有AAA的病人仍然有患有其他部位动脉瘤的危险。任何提高AAA的检出率都可以改善AAA的治疗。本组主要对遗传因素在AAA发病中的作用进行了研究。
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一、本组共搜集了AAA病人308例及同代亲属935例。心血管高危因素在这组AAA病人中是非常普遍的病因。吸烟、高血压、高胆固醇血症是最重要的发病因素。然而，遗传因素在AAA的发病中已越来越引起人们的重视，对传统的AAA发病原理提出了挑战。本研究中的308例AAA病人中，50例患者至少有一例直系亲属患有AAA(17%)。如果完成所有AAA病人直系亲属的筛选工作，这种家族性AAA的发病率将会更高。这个结果证实了家族史是AAA非常重要的发病因素。然而，澳大利亚悉尼1995年一项研究表明，在对132例AAA病人的52例亲属筛选中，没有发现AAA病人。这组接受筛选的家属平均年龄为53岁，要比本研究平均筛选年龄小12岁。两个研究结果对比可以得知，选择适当年龄的AAA亲属进行临床筛选对于提高检出率是非常重要的。
二、对于四个基因的筛选，病人与对照组的统计学差异仅见于COL1A2基因。这种区别见于男女AAA病人之间及女性AAA与女性对照组之间，这是由于该基因的3号等位基因缺乏导致的。可能是COL1A2等位基因3在女性个体中可以阻碍腹主动脉瘤的形成。COL1A2基因，尤其是等位基因3在AAA发生发展中的作用有待进一步探讨研究。
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三、目前认为，AAA是由于多种病因引起的一种结缔组织疾病。遗传因素在AAA的发生发展中起着重要的作用。虽然有报道COL3A1基因突变可引起显性遗传的AAA，但是，本研究还没有发现具有结论性的证据来证实该基因在AAA中的作用。
在寻找一个可以引起AAA的基因研究中，编码结构蛋白基因及参与细胞外基质代谢的基因应该作为候选基因。本文着重研究了构成主动脉基本结构因素基因，因此，负责编码蛋白沉积和降解的基因应该作为下一步研究重点。
参 考 文 献
1.Webster MW,St Jean PL,Steed DL,et al.Abdominal aortic aneurysm:result of a family study.J Vasc Surg,1991,13:366.
2.Norrgard O,Rais O,Angqvist KA.Familial occurrence of abdominal aortic aneurysms.Surgery,1984,95:650.
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3.Darling RC III,Brewster DC,Darling RC,et al.Are familial abdominal aortic aneurysm different? J Vasc Surg,1980,10:39.
4.Ingoldby CJH,Wujianto R,Mitchell JE.Impact of vascular surgery on community mortality from ruptured aortic aneurysms.Br J Surg,1986,73:551.
5.Johnston KW,Rutherford RB,Tilson DM,et al.Suggested standards for reporting on arterial aneurysms.J Vasc Surg,1991,13:444.
6.Verloes A,Sakalihasan N,Limet R,Aneurysms of abdominal aorta:familial and genetic aspects in three hundred thirteen pedigrees.J Vasc Surg,1995,21:646.
7.Sham PC,Curtis DM.Carlo tests for associations between disease and growth factor (EGF)-highly polymorphic loci.Ann Hum Genet,1995,59:97.
(收稿：2000-05-15 修回：2000-10-08), 百拇医药
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