IL-4对重型肝炎患者外周血单个核细胞IL-1α表达调节的研究
作者：石裕明 张立煌 方海林 何南祥 刘克洲 李敏伟 姚航平
单位：310031 杭州，激，浙江 医科大学传染病研究所(石裕明，现在广州市第八人民医院传染病研究所工作)
关键词：亚急性重型肝炎；慢性重型肝炎；白细胞介素-4；白细胞介素-1α外周血单个核细胞
中华传染病杂志980306 【摘要】 目的 评价IL-4在重型肝炎治疗中的潜在应用价值。方法 应用免疫组化法和半定量RT-PCR系统地观察IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响。结果 IL-4在蛋白质和mRNA水平明显抑制LPS诱导的亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的产生，这种抑制作用呈剂量和时间依赖的方式。IL-4于100U/ml时开始出现抑制效应，于1 000U/ml时抑制作用接近最大。虽然IL-4对慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用略低，但与未经IL-4处理的PBMCs相比较，IL-1α的表达水平仍明显下降。结论 IL-4对亚急性和慢性重型肝炎PBMCs IL-1α的表达均具有较强的下向调节作用，在重型肝炎的治疗上可能具有潜在的应用价值，值得进一步研究。
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Study on regulation of IL-4 on expression of IL-1α in PBMCs from patients with subacute and chronic severe hepatitis Shi Yuming, Zhang Lihuang, Fang Hailin, et al. Institute of Infectious Diseases,Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031
【Abstract】 Objective To estimate the potential clinical value of IL-4 in the treatment of severe hepatitis. Methods In the present study, we observed the effect of IL-4 on expression of IL-1α in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with severe hepatitis at cellular and molecular levels using immunohistochemical assay and the technique of semiquantitative reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR).The isolated PBMCs were cultured in the presence of increasing concentration of IL-4 or IL-4 was added to cultures at different time courses after the challenge of LPS. Results It was found that IL-4 in dose-and time-dependent manner down-regulated the LPS-induced production of IL-1α in PBMCs from patients with severe hepatitis at the level of protein and mRNA. The inhibitory effect of IL-4 could be observed at the concentration of 100U/ml and nearly got to the climax at 1 000U/ml.Although the suppression of IL-4 on the production of IL-1α in PBMCs from chronic severe hepatitis was slightly weaker than on that from subacute severe hepatitis,there existed significant difference when compared with the control PBMCs untreated with IL-4. Conclusion These findings showed that IL-4 was a potent down-regulator of IL-1α and might play a potential role in the treatment of severe hepatitis.The further clinical study on IL-4 remained to be done.
, 百拇医药
【Key words】 Subacute severe hepatitis Chronic severe hepatitis Interleukin-4
Interleukin-1α Peripheral blood mononuclear cells
研究表明，IL-1的过度表达是重型病毒性肝炎发病机制的重要因素之一[1]，IL-1一方面参与机体的炎症反应，引起肝脏Schwartzman反应[2]，另一方面可明显增强肝细胞对TNF-α的敏感性，加重TNF-α介导的肝损伤[3]，因此，控制重型肝炎患者IL-1的异常表达，对于重型肝炎的治疗可能具有重要的意义。IL-4是一种由TH2细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子，体内、外实验已证明，IL-4可抑制单核/巨噬细胞分泌IL-1和TNF-α，而且，促进IL-1受体拮抗剂的表达。Dinarello等[4]已将IL-4试用于败血症休克的治疗，发现其疗效较单用IL-1受体拮抗剂为佳，这表明IL-4是一种有效的抗炎症因子。为了评价IL-4在重型肝炎的治疗中是否具有潜在的应用价值，本研究在体外观察了IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响。
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材料与方法
一、病例来源
本组病例为浙江医科大学附属第一医院和嘉兴市第一人民医院1994年9月至1996年2月间的住院患者，诊断符合北京1995年全国传染病和寄生虫病学术会议修订的标准。亚急性重型肝炎8例(男4例，女4例，年龄28～50岁)，慢性重型肝炎6例(男4例，女2例，年龄26～58岁)。
二、主要实验材料与试剂
重组人IL-4、内毒素(LPS)和RPMI 1640培养液均为Sigma产品。兔抗人IL-1α多克隆抗体和DNA分子量标准为GIBCOBRL产品。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为PE/Cetus产品。ABC免疫组化试剂盒为Vector产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。兔抗人IL-4多克隆抗体为Genzyme产品。IL-1α引物：正义链GCCAATGACTCAGAGGAAGA，反义链TCTCAGGCATCTCCTTCAGC，扩增产物为328bp，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成；β-actin引物：正义链TTCCAGCCTTCCTTCCTGG，反义链TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT，扩增产物为225bp，由本所陈智博士合成并惠赠。PCR仪：TC-1型，PE/Cetus产品。
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三、PBMCs的分离
抽取患者外周静脉血10～15ml，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离PBMCs,进行细胞计数后，用无血清RPMI 1640培养液将细胞数调整至1×106/ml。
四、单核细胞内IL-1α的诱生和检测
于24孔培养板每孔加入细胞悬液1ml，置37℃、5% CO2条件下培养2小时后，用D-Hank's液洗去悬浮细胞，再加无血清RPMI 1640培养液1ml，对照孔加LPS(1μg/ml)，处理孔同时加LPS和IL-4，继续培养8小时。用细胞涂片装置制片，冷丙酮固定后用塑料薄膜密封，置-80℃保存待用。细胞内IL-1α的检测采用ABC免疫组化法，参照试剂盒说明书进行操作，在高倍境下观察结果，计算200个单核细胞中IL-1α阳性细胞数，求其百分率。
五、IL-1α mRNA的诱生及总RNA的抽提
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于24孔培养板每孔加入细胞悬液1ml,对照孔加LPS(1μg/ml)，处理孔同时加LPS和IL-4，置37℃、5% CO2条件下培养4小时。参照Chomezynski等[5]的方法抽提总RNA。
六、半定量RT-PCR
RT-PCR参照试剂盒说明书进行。在同一反应管内加入15μmol/L IL-1α及β-actin正义链和反义链引物各1μl。扩增条件为：变性94℃、复性56℃、延伸72℃，时间均为1分钟，循环数为30个。取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙啶染色，在紫外检测仪上观察结果并照相，用Pharmacia ultrascan LK光密度扫描仪对底片产物条带进行扫描，计算IL-1α产物与β-actin产物的比值，以此比值来反映IL-1α mRNA量的变化。
七、统计学处理
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组间均数比较采用双侧t检验。
结 果
一、IL-4的阻断试验
在预试验中，为了确定IL-4作用的特异性，我们预先应用兔抗人IL-4多克隆抗体200μl(1mg/ml)与1 000U重组人IL-4处理过夜后再进行试验，结果表明，兔抗人IL-4多克隆抗体可完全阻断IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用。
二、不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
为了选择IL-4作用的最佳浓度，我们选择3例重型肝炎标本(2、4、7号)，观察不同浓度IL-4对LPS刺激的PBMCs IL-1α表达的影响。图1和2显示，IL-4对重型肝炎PBMCs的作用呈剂量依赖方式，IL-4于100U/ml时对PBMCs IL-1α的表达开始出现抑制效应，随着IL-4浓度的增加，对IL-1α的抑制作用逐渐增强，于1 000U/ml时接近最大，故以1 000U/ml作为IL-4的工作浓度。
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三、IL-4加入时间对重型肝炎患者PBMCsIL-1α表达的影响
图1 不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
1：DNA分子量标准(100bp DNA ladder); 2:0U/ml; 3：10U/ml; 4:100U/ml; 5:500U/ml; 6:1 000U/ml; 7:2 000U/ml
图2 不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α mRNA
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表达的影响
在实验中选择6号标本观察不同时间加入IL-4对LPS刺激的PBMCs IL-1α表达的影响。结果显示，IL-4的作用呈时间依赖方式，随着IL-4作用时间的缩短，其对IL-1α的抑制作用逐渐减弱，如果后期加入IL-4仅表现较弱的抑制作用。
四、淋巴细胞对IL-4诱导的抑制作用的影响
为了观察PBMCs中的淋巴细胞是否对IL-4抑制单核细胞IL-1α表达的作用产生影响，我们比较了在IL-4的作用下单核细胞单独培养和单核细胞与淋巴细胞混合培养时单核细胞内IL-1α的阳性率。单核细胞单独培养时IL-1α的阳性率为18.50%，而单核细胞与淋巴细胞混合培养时的阳性率为19.50%。结果表明，在培养中加入淋巴细胞对单核细胞IL-1α的阳性率无显著影响(P>0.05)。此外，我们还观察到细胞因子阳性染色仅见于单核细胞，而淋巴细胞染色均为阴性。
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五、IL-4对亚急性重型肝炎和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
上述结果表明，IL-4的最佳工作浓度为1 000U/ml，故我们以该剂量处理PBMCs，观察IL-4对这两型肝炎IL-1α的抑制作用。附表结果显示，IL-4对亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α蛋白质和mRNA的表达均有明显的抑制作用；进一步比较发现，IL-4对慢性重型肝炎的抑制作用(P<0.05)略低于亚急性重型肝炎(P<0.01～0.001)。
讨 论
本实验在体外观察了IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响，结果发现，IL-4以剂量和时间依赖的方式在mRNA和蛋白质水平明显抑制LPS诱导的亚急性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的表达。IL-4于100U/ml时开始出现抑制效应，于1 000U/ml时抑制作用接近最大。如缩短IL-4的作用时间，其抑制作用逐渐减弱，这表明早期加入IL-4是其发挥抑制效应的关键。IL-4对慢性重型
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附表 IL-4对重型肝炎PBMCs IL-1α表达的影响 检测对象
病例数
单核细胞阳性率(%)
mRNA(与β-actin比值)
LPS
LPS+IL-4
LPS
LPS+IL-4
亚急重肝
8
29.40±3.34
17.27±2.57***
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2.25±0.58
1.22±0.48**
慢重肝
6
22.67±8.16
13.23±3.69*
1.28±0.74
0.69±0.36*
注：LPS组与LPS+IL-4组比较，*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001
, 百拇医药 肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用虽然略弱，但与未经IL-4处理的PBMCs相比较，IL-1α的表达仍显著降低，提示IL-4对亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的表达均有明显的抑制作用。
单核/巨噬细胞是IL-1α的主要来源。本实验免疫组化观察也发现，这种细胞因子的阳性染色仅见于单核细胞内，因此，在抑制IL-1α表达方面，IL-4的作用对象主要是单核/巨噬细胞。虽有报道，IL-4可通过抑制TH1细胞分泌IFN-γ和IL-2而下调单核/巨噬细胞表达IL-1[6]。然而，本实验在单核细胞培养中，加入淋巴细胞后对单核细胞IL-1α的阳性率并无明显影响，与Hart等[7]的结果相一致。因此，IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的抑制主要通过对单核细胞的直接作用，而通过抑制T细胞产生IFN-γ和IL-2的间接作用可能是次要的。IL-4抑制IL-1α产生的作用机制目前尚未完全阐明。最近研究发现，下调单核/巨噬细胞IL-1(包括α和β)基因的表达是IL-4的作用机制之一[7，8]。IL-4一方面可明显缩短经LPS刺激的单核细胞IL-1 mRNA的半衰期，另一方面可降低基因的转录水平，提示IL-4可在转录和转录后水平抑制单核/巨噬细胞IL-1 mRNA的表达[8，9]。本实验结果也显示，IL-4于1 000U/ml时抑制亚急性重型肝炎患者PBMCs IL-1α mRNA表达达46.09%，支持IL-4抑制IL-1基因表达的观点。
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IL-4除抑制单核/巨噬细胞分泌IL-1外，还能抑制多种炎症介质的形成，如TNF-α、IL-6、IL-8和自由氧基等。此外，IL-4可促进IL-1受体拮抗剂的产生，进一步阻断已分泌的IL-1对靶细胞的作用。IL-4的这些特性显示，其具有明显的抗炎症作用。Fukuda等[10]检测肝组织内IL-4 mRNA表达情况曾观察到，在慢性活动性肝炎缓解期常伴IL-4 mRNA水平的增高，提示IL-4与肝脏炎症的缓解有密切的关系。本实验也证实，IL-4可抑制重型肝炎患者PBMCs IL-1α的产生，这些结果都表明，IL-4在重型肝炎的治疗中可能具有潜在的应用价值。然而，本研究仅反映体外的情况，体内尚存在着复杂的细胞因子调节网络的影响，因此，体内情况是否与之相似，尚有待进一步做动物实验加以验证。
本课题为国家自然科学基金、浙江省自然科学基金资助
参考文献
1 Muto Y,Nouri-Aria KT,Meager A,et al.Enhanced tumor necrosis factor and interleukin-l in fulminant hepatic failure.Lancet,1988,2：72-74.
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2 Beck G,Habicht GS,Benach JL,et al.Interleukin 1:a common endogenous mediator of inflammation and the local schwartzman reaction.J Immunol,1986，136：3025-3031.
3 刘佩，周子文，李智伟，等.IL-1增强TNF所致小白鼠肝损伤的活性研究.中华消化杂志，1993，13：253-255.
4 Dinarello C,Dickler H,McSweegan E,et al.IL-4:the next septic shock treatment?Biotechnology News,1992，12：5-6.
5 Chomezynski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987，162：156-160.
, 百拇医药
6 Gautam S,Tebo JM,Hamilton TA.IL-4 suppresses cytokine gene expression induced by IFN-γ and/or IL-2 in murine peritoneal macrophages. J Immunol,1992，148：1725-1730.
7 Harr PH,Vitti GF,Burgess DR,et al.Potential antiinflammatory effects of interleukin 4:suppression of human monocyte tumor necrosis factor α,interleukin 1,and prostaglandin E2.Pro Natl Acad Sci USA,1989,86:3803-3807.
8 Essner R,Rhoades K,McBride WH,et al.IL-4 down-regulates IL-1 and TNF gene expression in human monocytes.J Immunol,1989,142:3857-3861.
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9 Donnelly RP,Fenton MJ,Kaufman JD,et al.IL-1 expression in human monocytes is transcriptionally and posttranscriptionally regulated by IL-4.J Immunol,1991,146:3431-3436.
10 Fukuda R,Ishimura N,Nguyen TX,et al.The expression of IL-2,IL-4 and interferon-gama (IFN-γ) mRNA using liver biopsies at different phase of acute exacerbation of chronic hepatitis B.Clin Exp Immunol,1995,100:446-451., 百拇医药
单位：310031 杭州，激，浙江 医科大学传染病研究所(石裕明，现在广州市第八人民医院传染病研究所工作)
关键词：亚急性重型肝炎；慢性重型肝炎；白细胞介素-4；白细胞介素-1α外周血单个核细胞
中华传染病杂志980306 【摘要】 目的 评价IL-4在重型肝炎治疗中的潜在应用价值。方法 应用免疫组化法和半定量RT-PCR系统地观察IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响。结果 IL-4在蛋白质和mRNA水平明显抑制LPS诱导的亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的产生，这种抑制作用呈剂量和时间依赖的方式。IL-4于100U/ml时开始出现抑制效应，于1 000U/ml时抑制作用接近最大。虽然IL-4对慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用略低，但与未经IL-4处理的PBMCs相比较，IL-1α的表达水平仍明显下降。结论 IL-4对亚急性和慢性重型肝炎PBMCs IL-1α的表达均具有较强的下向调节作用，在重型肝炎的治疗上可能具有潜在的应用价值，值得进一步研究。
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Study on regulation of IL-4 on expression of IL-1α in PBMCs from patients with subacute and chronic severe hepatitis Shi Yuming, Zhang Lihuang, Fang Hailin, et al. Institute of Infectious Diseases,Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031
【Abstract】 Objective To estimate the potential clinical value of IL-4 in the treatment of severe hepatitis. Methods In the present study, we observed the effect of IL-4 on expression of IL-1α in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with severe hepatitis at cellular and molecular levels using immunohistochemical assay and the technique of semiquantitative reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR).The isolated PBMCs were cultured in the presence of increasing concentration of IL-4 or IL-4 was added to cultures at different time courses after the challenge of LPS. Results It was found that IL-4 in dose-and time-dependent manner down-regulated the LPS-induced production of IL-1α in PBMCs from patients with severe hepatitis at the level of protein and mRNA. The inhibitory effect of IL-4 could be observed at the concentration of 100U/ml and nearly got to the climax at 1 000U/ml.Although the suppression of IL-4 on the production of IL-1α in PBMCs from chronic severe hepatitis was slightly weaker than on that from subacute severe hepatitis,there existed significant difference when compared with the control PBMCs untreated with IL-4. Conclusion These findings showed that IL-4 was a potent down-regulator of IL-1α and might play a potential role in the treatment of severe hepatitis.The further clinical study on IL-4 remained to be done.
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【Key words】 Subacute severe hepatitis Chronic severe hepatitis Interleukin-4
Interleukin-1α Peripheral blood mononuclear cells
研究表明，IL-1的过度表达是重型病毒性肝炎发病机制的重要因素之一[1]，IL-1一方面参与机体的炎症反应，引起肝脏Schwartzman反应[2]，另一方面可明显增强肝细胞对TNF-α的敏感性，加重TNF-α介导的肝损伤[3]，因此，控制重型肝炎患者IL-1的异常表达，对于重型肝炎的治疗可能具有重要的意义。IL-4是一种由TH2细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子，体内、外实验已证明，IL-4可抑制单核/巨噬细胞分泌IL-1和TNF-α，而且，促进IL-1受体拮抗剂的表达。Dinarello等[4]已将IL-4试用于败血症休克的治疗，发现其疗效较单用IL-1受体拮抗剂为佳，这表明IL-4是一种有效的抗炎症因子。为了评价IL-4在重型肝炎的治疗中是否具有潜在的应用价值，本研究在体外观察了IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响。
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材料与方法
一、病例来源
本组病例为浙江医科大学附属第一医院和嘉兴市第一人民医院1994年9月至1996年2月间的住院患者，诊断符合北京1995年全国传染病和寄生虫病学术会议修订的标准。亚急性重型肝炎8例(男4例，女4例，年龄28～50岁)，慢性重型肝炎6例(男4例，女2例，年龄26～58岁)。
二、主要实验材料与试剂
重组人IL-4、内毒素(LPS)和RPMI 1640培养液均为Sigma产品。兔抗人IL-1α多克隆抗体和DNA分子量标准为GIBCOBRL产品。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为PE/Cetus产品。ABC免疫组化试剂盒为Vector产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。兔抗人IL-4多克隆抗体为Genzyme产品。IL-1α引物：正义链GCCAATGACTCAGAGGAAGA，反义链TCTCAGGCATCTCCTTCAGC，扩增产物为328bp，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成；β-actin引物：正义链TTCCAGCCTTCCTTCCTGG，反义链TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT，扩增产物为225bp，由本所陈智博士合成并惠赠。PCR仪：TC-1型，PE/Cetus产品。
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三、PBMCs的分离
抽取患者外周静脉血10～15ml，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离PBMCs,进行细胞计数后，用无血清RPMI 1640培养液将细胞数调整至1×106/ml。
四、单核细胞内IL-1α的诱生和检测
于24孔培养板每孔加入细胞悬液1ml，置37℃、5% CO2条件下培养2小时后，用D-Hank's液洗去悬浮细胞，再加无血清RPMI 1640培养液1ml，对照孔加LPS(1μg/ml)，处理孔同时加LPS和IL-4，继续培养8小时。用细胞涂片装置制片，冷丙酮固定后用塑料薄膜密封，置-80℃保存待用。细胞内IL-1α的检测采用ABC免疫组化法，参照试剂盒说明书进行操作，在高倍境下观察结果，计算200个单核细胞中IL-1α阳性细胞数，求其百分率。
五、IL-1α mRNA的诱生及总RNA的抽提
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于24孔培养板每孔加入细胞悬液1ml,对照孔加LPS(1μg/ml)，处理孔同时加LPS和IL-4，置37℃、5% CO2条件下培养4小时。参照Chomezynski等[5]的方法抽提总RNA。
六、半定量RT-PCR
RT-PCR参照试剂盒说明书进行。在同一反应管内加入15μmol/L IL-1α及β-actin正义链和反义链引物各1μl。扩增条件为：变性94℃、复性56℃、延伸72℃，时间均为1分钟，循环数为30个。取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙啶染色，在紫外检测仪上观察结果并照相，用Pharmacia ultrascan LK光密度扫描仪对底片产物条带进行扫描，计算IL-1α产物与β-actin产物的比值，以此比值来反映IL-1α mRNA量的变化。
七、统计学处理
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组间均数比较采用双侧t检验。
结 果
一、IL-4的阻断试验
在预试验中，为了确定IL-4作用的特异性，我们预先应用兔抗人IL-4多克隆抗体200μl(1mg/ml)与1 000U重组人IL-4处理过夜后再进行试验，结果表明，兔抗人IL-4多克隆抗体可完全阻断IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用。
二、不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
为了选择IL-4作用的最佳浓度，我们选择3例重型肝炎标本(2、4、7号)，观察不同浓度IL-4对LPS刺激的PBMCs IL-1α表达的影响。图1和2显示，IL-4对重型肝炎PBMCs的作用呈剂量依赖方式，IL-4于100U/ml时对PBMCs IL-1α的表达开始出现抑制效应，随着IL-4浓度的增加，对IL-1α的抑制作用逐渐增强，于1 000U/ml时接近最大，故以1 000U/ml作为IL-4的工作浓度。
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三、IL-4加入时间对重型肝炎患者PBMCsIL-1α表达的影响
图1 不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
1：DNA分子量标准(100bp DNA ladder); 2:0U/ml; 3：10U/ml; 4:100U/ml; 5:500U/ml; 6:1 000U/ml; 7:2 000U/ml
图2 不同浓度IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α mRNA
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表达的影响
在实验中选择6号标本观察不同时间加入IL-4对LPS刺激的PBMCs IL-1α表达的影响。结果显示，IL-4的作用呈时间依赖方式，随着IL-4作用时间的缩短，其对IL-1α的抑制作用逐渐减弱，如果后期加入IL-4仅表现较弱的抑制作用。
四、淋巴细胞对IL-4诱导的抑制作用的影响
为了观察PBMCs中的淋巴细胞是否对IL-4抑制单核细胞IL-1α表达的作用产生影响，我们比较了在IL-4的作用下单核细胞单独培养和单核细胞与淋巴细胞混合培养时单核细胞内IL-1α的阳性率。单核细胞单独培养时IL-1α的阳性率为18.50%，而单核细胞与淋巴细胞混合培养时的阳性率为19.50%。结果表明，在培养中加入淋巴细胞对单核细胞IL-1α的阳性率无显著影响(P>0.05)。此外，我们还观察到细胞因子阳性染色仅见于单核细胞，而淋巴细胞染色均为阴性。
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五、IL-4对亚急性重型肝炎和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响
上述结果表明，IL-4的最佳工作浓度为1 000U/ml，故我们以该剂量处理PBMCs，观察IL-4对这两型肝炎IL-1α的抑制作用。附表结果显示，IL-4对亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α蛋白质和mRNA的表达均有明显的抑制作用；进一步比较发现，IL-4对慢性重型肝炎的抑制作用(P<0.05)略低于亚急性重型肝炎(P<0.01～0.001)。
讨 论
本实验在体外观察了IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的影响，结果发现，IL-4以剂量和时间依赖的方式在mRNA和蛋白质水平明显抑制LPS诱导的亚急性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的表达。IL-4于100U/ml时开始出现抑制效应，于1 000U/ml时抑制作用接近最大。如缩短IL-4的作用时间，其抑制作用逐渐减弱，这表明早期加入IL-4是其发挥抑制效应的关键。IL-4对慢性重型
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附表 IL-4对重型肝炎PBMCs IL-1α表达的影响 检测对象
病例数
单核细胞阳性率(%)
mRNA(与β-actin比值)
LPS
LPS+IL-4
LPS
LPS+IL-4
亚急重肝
8
29.40±3.34
17.27±2.57***
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2.25±0.58
1.22±0.48**
慢重肝
6
22.67±8.16
13.23±3.69*
1.28±0.74
0.69±0.36*
注：LPS组与LPS+IL-4组比较，*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001
, 百拇医药 肝炎患者PBMCs IL-1α的抑制作用虽然略弱，但与未经IL-4处理的PBMCs相比较，IL-1α的表达仍显著降低，提示IL-4对亚急性和慢性重型肝炎患者PBMCs IL-1α的表达均有明显的抑制作用。
单核/巨噬细胞是IL-1α的主要来源。本实验免疫组化观察也发现，这种细胞因子的阳性染色仅见于单核细胞内，因此，在抑制IL-1α表达方面，IL-4的作用对象主要是单核/巨噬细胞。虽有报道，IL-4可通过抑制TH1细胞分泌IFN-γ和IL-2而下调单核/巨噬细胞表达IL-1[6]。然而，本实验在单核细胞培养中，加入淋巴细胞后对单核细胞IL-1α的阳性率并无明显影响，与Hart等[7]的结果相一致。因此，IL-4对重型肝炎患者PBMCs IL-1α表达的抑制主要通过对单核细胞的直接作用，而通过抑制T细胞产生IFN-γ和IL-2的间接作用可能是次要的。IL-4抑制IL-1α产生的作用机制目前尚未完全阐明。最近研究发现，下调单核/巨噬细胞IL-1(包括α和β)基因的表达是IL-4的作用机制之一[7，8]。IL-4一方面可明显缩短经LPS刺激的单核细胞IL-1 mRNA的半衰期，另一方面可降低基因的转录水平，提示IL-4可在转录和转录后水平抑制单核/巨噬细胞IL-1 mRNA的表达[8，9]。本实验结果也显示，IL-4于1 000U/ml时抑制亚急性重型肝炎患者PBMCs IL-1α mRNA表达达46.09%，支持IL-4抑制IL-1基因表达的观点。
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IL-4除抑制单核/巨噬细胞分泌IL-1外，还能抑制多种炎症介质的形成，如TNF-α、IL-6、IL-8和自由氧基等。此外，IL-4可促进IL-1受体拮抗剂的产生，进一步阻断已分泌的IL-1对靶细胞的作用。IL-4的这些特性显示，其具有明显的抗炎症作用。Fukuda等[10]检测肝组织内IL-4 mRNA表达情况曾观察到，在慢性活动性肝炎缓解期常伴IL-4 mRNA水平的增高，提示IL-4与肝脏炎症的缓解有密切的关系。本实验也证实，IL-4可抑制重型肝炎患者PBMCs IL-1α的产生，这些结果都表明，IL-4在重型肝炎的治疗中可能具有潜在的应用价值。然而，本研究仅反映体外的情况，体内尚存在着复杂的细胞因子调节网络的影响，因此，体内情况是否与之相似，尚有待进一步做动物实验加以验证。
本课题为国家自然科学基金、浙江省自然科学基金资助
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