犬腺病毒Ⅰ型流行毒株的分离与鉴定
作者：李秦 金昌德 李六金 张海 师长宏 赵世君
单位：李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；赵世君(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬腺病毒Ⅰ型；分离；鉴定
第四军医大学学报000628 摘要: 目的 分离、鉴定犬腺病毒Ⅰ型流行毒株. 方法 将处理过的病犬肝组织悬液，感染原代犬胎肾细胞. 用血凝试验、中和试验、回归试验以及电镜观察等方法，分离、鉴定. 结果 分离出一株犬腺病毒Ⅰ型流行毒株，命名为CAV1-XN3株. 结论 该毒株与标准毒株的生物学特性一致.
, 百拇医药
中图号：S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0734-02
Isolation and identification of canine adenovirus Ⅰ
LI Qin JIN Chang-De LI Liu-Jin ZHANG Hai SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun
(Laboratory Animal Research Center,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To isolate and to identify canine adenovirus Ⅰ. METHODS To isolate adenovirus Ⅰ form canine liver tissue suspension disposed by alcohol and chlorofrom,we used synchronous inoculation to infect canine embryo kidney cells and identified the virus through blood coagulation test,neutralization test,animal experiment,and electron microscopic observation. RESULTS CAV1 was isolated from sick canine liver named CAV1-XN3. CONCLUSION Canine adenovirus Ⅰ has similar biological properties to the standard virus oservation.
, 百拇医药
Keywords:canine adenovirus Ⅰ;isolation; identification
0 引言
犬传染性肝炎是由犬腺病毒Ⅰ型(Canine adenovirus I，CAV1)引起的一种急性、败血性传染病. 自1947年发现了犬传染性肝炎后，1959年又成功分离获得犬传染性肝炎病毒. 1984年，在我国首次分离到该病毒，证实了我国犬中也有犬腺病毒Ⅰ型的感染[1]. 1993-10，我们从小型狮子犬群中分离出一株犬腺病毒，经鉴定为犬腺病毒Ⅰ型，命名为CAV1-XN3株. 并对该毒株的理化特性、血凝性、抗原性、培养与增殖特性等进行了鉴定分析.
1 材料和方法
1.1 材料 病毒CAV1疫苗株和标准抗血清由国外友人馈赠；标准毒株CAV1-N1株由南京警犬研究所提供；病犬肝组织样品由临床病犬获得；豚鼠抗血清和兔抗血清自制.
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1.2 方法 采用血凝范围试验 、细胞感染范围试验、理化特性鉴定、动物感染范围试验 、交叉中和试验等方法对病毒进行分离、鉴定[2,3].
2 结果
2.1 病毒分离及感染细胞范围 CAV1-XN3毒株在MDCK细胞上增殖和适应过程中，CPE不明显，培养后期偶尔看到蜘蛛网状病变，1～6代细胞毒的HA不稳定，传至12代时，HA稳定，CAV1-XN3株TCID50为10-1.6～10-6.0.mL-1. CAV1-XN3毒株可在多种动物的细胞单层上增殖，以原代犬胎肾和原代地鼠肾细胞最为敏感.
2.2 红细胞凝集试验 对动物红细胞的凝集作用CAV1-XN3株在4℃和37℃对猴、豚鼠、大鼠和人“0”型红细胞具有较好的凝集作用.
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2.3 电镜观察 对CAV1-XN3株接种第4日细胞单层的超薄切片作电镜观察发现，病毒粒子多存在于细胞核内，呈六角型或圆型，大小65 nm，通常不呈结晶排列. 负染样品，看到直径为70 nm，呈六角型或球型粒子，该粒子分为中空和实心两种. 病毒衣壳呈二十面体对称，无囊膜. 在衣壳的顶端有时可看到纤维突(Fig 1).
2.4 病毒理化特性鉴定 CAV1-XN3经胰酶处理后，其TCID50与对照组的对数差均未超过1.0，表明CAV1-XN3株没有囊膜，并对乙醚、酸具有耐受力.
图 1 犬腺病毒Ⅰ型(CAV1-XN3)病毒流行株的结构
, 百拇医药
Fig 1 Structure of canine adenovirus Ⅰ-XN3 strain
2.5 生长抑制试验及对胰酶依赖性试验 CAV1-XN3在5-碘脱氧尿嘧啶环境中增殖力受到了抑制，证明该病毒系DNA病毒类的成员，经胰酶处理后，该病毒的增殖力未受到影响，其TCID50值与对照组相差无几，进一步证明其不具有囊膜结构.
2.6 康复犬血清中和抗体效价测定 中和指数为149.62，证明人工感染后犬血清具有较高的中和效价.
2.7 新生犬的人工感染 在P3级实验条件下，用CAV1-XN3株对4只母源抗体阴性犬作人工感染，4/4只发病，3/4只死亡. 病理解剖可见病犬肝组织损伤严重，腹水增加，肝呈红色，肝脏肿大1.5倍，胆囊水肿. 取病犬第3日的尿液10倍稀释接种地鼠肾细胞，亦回收到CAV. 但以同样的病毒感染的2只仔犬，却未出现腹泻临床症状，且均健康成活，证明CAV1-XN3株对其有母源抗体的新生犬不再具有致病性.
, 百拇医药
2.8 血清中和试验结果 CAV1-XN1阳性血清能显著(P<0.01)抑制CAV1-XN3毒株，CAV1-XN3抗血清亦可抑制CAV1-N1毒株.
3 讨论
细胞培养法分离和增殖腺病毒，比较容易[4]. 水解蛋白酶或胰蛋白酶处理病毒样品，或在培养液中加入适量胰酶，则更有利于病毒在细胞单层上适应和增殖[5]. 我们应用同步接毒方法，并在吹打胰酶消化细胞块时对残留胰酶不作彻底洗涤，并获成功. 微量胰酶残留，是否是病毒分离成功的主要因素，有待进一步试验证明.
用0.3% 人“0”型和大鼠红细胞作血凝检测，均为阴性，但电镜观察则可看到典型病毒粒子，并可在敏感细胞上产生细胞病变. 血凝检测不能作为该毒检测的有效方法.
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基金项目：陕西省自然科学基金资助课题(93018)
作者简介：李 秦(1968-),男(汉族),陕西省西安市人. 讲师. Tel.(029)3373908 Email.Liujin@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京:科学出版社,1997:204-437.
[2] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所. 兽医微生物学[M]. 北京:中国农业出版社,1998:519.
[3] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M]. 北京:高等教育出版社,1993:313.
[4] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安:世界图书出版社公司,1996:5.
[5] 田克恭. 实验动物病毒性疾病[M]. 北京:中国农业出版社,1991：283.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药
单位：李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；赵世君(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬腺病毒Ⅰ型；分离；鉴定
第四军医大学学报000628 摘要: 目的 分离、鉴定犬腺病毒Ⅰ型流行毒株. 方法 将处理过的病犬肝组织悬液，感染原代犬胎肾细胞. 用血凝试验、中和试验、回归试验以及电镜观察等方法，分离、鉴定. 结果 分离出一株犬腺病毒Ⅰ型流行毒株，命名为CAV1-XN3株. 结论 该毒株与标准毒株的生物学特性一致.
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中图号：S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0734-02
Isolation and identification of canine adenovirus Ⅰ
LI Qin JIN Chang-De LI Liu-Jin ZHANG Hai SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun
(Laboratory Animal Research Center,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To isolate and to identify canine adenovirus Ⅰ. METHODS To isolate adenovirus Ⅰ form canine liver tissue suspension disposed by alcohol and chlorofrom,we used synchronous inoculation to infect canine embryo kidney cells and identified the virus through blood coagulation test,neutralization test,animal experiment,and electron microscopic observation. RESULTS CAV1 was isolated from sick canine liver named CAV1-XN3. CONCLUSION Canine adenovirus Ⅰ has similar biological properties to the standard virus oservation.
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Keywords:canine adenovirus Ⅰ;isolation; identification
0 引言
犬传染性肝炎是由犬腺病毒Ⅰ型(Canine adenovirus I，CAV1)引起的一种急性、败血性传染病. 自1947年发现了犬传染性肝炎后，1959年又成功分离获得犬传染性肝炎病毒. 1984年，在我国首次分离到该病毒，证实了我国犬中也有犬腺病毒Ⅰ型的感染[1]. 1993-10，我们从小型狮子犬群中分离出一株犬腺病毒，经鉴定为犬腺病毒Ⅰ型，命名为CAV1-XN3株. 并对该毒株的理化特性、血凝性、抗原性、培养与增殖特性等进行了鉴定分析.
1 材料和方法
1.1 材料 病毒CAV1疫苗株和标准抗血清由国外友人馈赠；标准毒株CAV1-N1株由南京警犬研究所提供；病犬肝组织样品由临床病犬获得；豚鼠抗血清和兔抗血清自制.
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1.2 方法 采用血凝范围试验 、细胞感染范围试验、理化特性鉴定、动物感染范围试验 、交叉中和试验等方法对病毒进行分离、鉴定[2,3].
2 结果
2.1 病毒分离及感染细胞范围 CAV1-XN3毒株在MDCK细胞上增殖和适应过程中，CPE不明显，培养后期偶尔看到蜘蛛网状病变，1～6代细胞毒的HA不稳定，传至12代时，HA稳定，CAV1-XN3株TCID50为10-1.6～10-6.0.mL-1. CAV1-XN3毒株可在多种动物的细胞单层上增殖，以原代犬胎肾和原代地鼠肾细胞最为敏感.
2.2 红细胞凝集试验 对动物红细胞的凝集作用CAV1-XN3株在4℃和37℃对猴、豚鼠、大鼠和人“0”型红细胞具有较好的凝集作用.
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2.3 电镜观察 对CAV1-XN3株接种第4日细胞单层的超薄切片作电镜观察发现，病毒粒子多存在于细胞核内，呈六角型或圆型，大小65 nm，通常不呈结晶排列. 负染样品，看到直径为70 nm，呈六角型或球型粒子，该粒子分为中空和实心两种. 病毒衣壳呈二十面体对称，无囊膜. 在衣壳的顶端有时可看到纤维突(Fig 1).
2.4 病毒理化特性鉴定 CAV1-XN3经胰酶处理后，其TCID50与对照组的对数差均未超过1.0，表明CAV1-XN3株没有囊膜，并对乙醚、酸具有耐受力.
图 1 犬腺病毒Ⅰ型(CAV1-XN3)病毒流行株的结构
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Fig 1 Structure of canine adenovirus Ⅰ-XN3 strain
2.5 生长抑制试验及对胰酶依赖性试验 CAV1-XN3在5-碘脱氧尿嘧啶环境中增殖力受到了抑制，证明该病毒系DNA病毒类的成员，经胰酶处理后，该病毒的增殖力未受到影响，其TCID50值与对照组相差无几，进一步证明其不具有囊膜结构.
2.6 康复犬血清中和抗体效价测定 中和指数为149.62，证明人工感染后犬血清具有较高的中和效价.
2.7 新生犬的人工感染 在P3级实验条件下，用CAV1-XN3株对4只母源抗体阴性犬作人工感染，4/4只发病，3/4只死亡. 病理解剖可见病犬肝组织损伤严重，腹水增加，肝呈红色，肝脏肿大1.5倍，胆囊水肿. 取病犬第3日的尿液10倍稀释接种地鼠肾细胞，亦回收到CAV. 但以同样的病毒感染的2只仔犬，却未出现腹泻临床症状，且均健康成活，证明CAV1-XN3株对其有母源抗体的新生犬不再具有致病性.
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2.8 血清中和试验结果 CAV1-XN1阳性血清能显著(P<0.01)抑制CAV1-XN3毒株，CAV1-XN3抗血清亦可抑制CAV1-N1毒株.
3 讨论
细胞培养法分离和增殖腺病毒，比较容易[4]. 水解蛋白酶或胰蛋白酶处理病毒样品，或在培养液中加入适量胰酶，则更有利于病毒在细胞单层上适应和增殖[5]. 我们应用同步接毒方法，并在吹打胰酶消化细胞块时对残留胰酶不作彻底洗涤，并获成功. 微量胰酶残留，是否是病毒分离成功的主要因素，有待进一步试验证明.
用0.3% 人“0”型和大鼠红细胞作血凝检测，均为阴性，但电镜观察则可看到典型病毒粒子，并可在敏感细胞上产生细胞病变. 血凝检测不能作为该毒检测的有效方法.
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基金项目：陕西省自然科学基金资助课题(93018)
作者简介：李 秦(1968-),男(汉族),陕西省西安市人. 讲师. Tel.(029)3373908 Email.Liujin@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京:科学出版社,1997:204-437.
[2] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所. 兽医微生物学[M]. 北京:中国农业出版社,1998:519.
[3] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M]. 北京:高等教育出版社,1993:313.
[4] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安:世界图书出版社公司,1996:5.
[5] 田克恭. 实验动物病毒性疾病[M]. 北京:中国农业出版社,1991：283.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药