放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞的变化及其对粒系祖细胞增殖的影响
作者：曾昭铸 罗成基 郭朝华 周燕虹
单位：(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000214 放烧复合伤是战时核爆炸与平时核事故所致的主要伤类之一。放烧复合伤时造血组织损伤明显。它不仅累及造血实质细胞，支持造血的微环境也发生了明显的改变。本文研究放射损伤复合烧伤后骨髓基质祖细胞的改变及骨髓基质细胞对粒系祖细胞增殖的影响。
一、材料和方法
1.实验动物、致伤方法和分组
昆明品系健康小鼠，体重20～24 g。单放组：60Coγ射线一次全身照射6 Gy，距离1.5 m，剂量率0.4 Gy/min；单烧组：3%凝固汽油烧7 s，致成15%Ⅲ度烧伤；放烧组：按以上条件先照射后烧伤；对照组：正常动物。所有动物致伤后腹腔注射生理盐水2 ml。每组动物不少于5只。
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2.粒系祖细胞培养(CFU-GM)：常规培养方法[1]。
3.骨髓基质细胞贴壁培养：参考Dexter培养体系[2]。
(1)基质祖细胞(CFU-F)集落计数：培养2周终止培养，生理盐水洗涤，干燥、染色，计数50个非圆形细胞组成的细胞团。
(2)贴壁基质细胞层上双层琼脂粒系培养：吸去贴壁细胞上清液，洗2次，加入培养液(含25%马血清，0.5%琼脂)1 ml，凝固后加入CFU-GM培养体系1.0 ml。
二、结果
1.不同伤类小鼠骨髓基质细胞贴壁层对正常小鼠CFU-GM产率的影响
各组伤后不同时间，骨髓基质细胞均表现出抑制正常鼠CFU-GM集落的产率。琼脂隔开各基质细胞贴壁层与其上种植的靶细胞，抑制作用减弱以至消失(表1)。
, 百拇医药
表1 损伤鼠基质细胞粘壁层对正常鼠CFU-GM产率的影响 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(
±s)
直接孵育
加琼脂层
伤后3 d
伤后7 d
伤后3 d
伤后7 d
单放
56.0±8.7
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45.0±2.7#
91.8±13.8*
94.4±8.5**
单烧
21.8±6.4
50.8±5.4##
72.8±12.3**
105.6±6.0**##
放烧
37.6±2.8
, 百拇医药
53.0±4.9##
57.8±2.5**
110.5±11.6**##
对照
46.8±8.1
53.8±0.9#
82.8±5.3**
84.5±13.7*
注：与同组同天直接孵育组比；*P<0.05；**P<0.01；与同组伤后3 d比；#P<0.05；##P<0.01
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2.正常小鼠骨髓基质细胞贴壁层对损伤鼠CFU-GM产率的影响
各种伤类伤后不同时间，有基质细胞贴壁层的集落产率均显著低于无贴壁层者 (表2)。
表2 正常鼠基质细胞粘壁层对不同组(有或无粘壁层)CFU-GM产率的影响 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(±s)
无粘壁层
有粘壁层
伤后3 d
伤后7 d
伤后3 d
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伤后7 d
单放
6.8±0.9
62.4±3.1##
2.0±0.7**
45.0±5.6*##
单烧
73.5±3.5
106.3±7.0##
8.5±0.6**
51.0±10.2**##
, 百拇医药
放烧
13.6±1.7
101.6±4.3##
6.0±0.7**
41.8±20.7**##
对照
91.6±3.9
94.2±5.9
30.4±10.9**
36.0±11.0**
注：与同组同天无粘壁层比，*P<0.05；**P<0.01；与同组伤后3 d比，#P<0.05；##P<0.01
, 百拇医药
3.损伤鼠骨髓基质细胞贴壁层对损伤鼠CFU-GM产率的影响
伤后14 d，各组贴壁层形成后，分别接种14 d各组CFU-GM，有贴壁层集落产率均显著低于无贴壁层。有贴壁层各损伤组均低于正常组(表3)。
表3 损伤鼠基质细胞粘壁层对损伤鼠(有或无粘壁层)CFU-GM产率的影响(伤后14 d) 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(±s)
无粘壁层
有粘壁层
单放
111.2±7.8
, 百拇医药
20.6±1.8**
单烧
126.8±6.2
18.0±7.8**
放烧
109.6±8.2
20.0±7.8**
对照
107.6±5.2
47.0±3.8**
注：与同组同天无粘壁层比，*P<0.05；**P<0.01
, 百拇医药
三、讨论
Chukhlovin证明大剂量照射可损伤骨髓空间结构，细胞与细胞间相互作用紊乱，基质细胞产生细胞因子减少。因此，影响了照后血液系统的恢复[3]。最近，Ulianova提出，以7 Gy γ射线复合热烧伤后，骨髓细胞无明显改变，但表现出全血细胞减少，这是复合伤死亡率增高的原因[4]。本文结果证明，放射损伤和放烧复合伤对小鼠骨髓基质细胞均有损伤，而复合伤基质细胞损伤持久，恢复缓慢，这将加重射线所致的造血功能损伤，并延缓其恢复重建。
小鼠骨髓基质细胞层能抑制接种的CFU-GM的产率。以薄层琼脂分隔基质细胞贴壁层与其上的靶细胞，此种抑制作用明显减弱。说明抑制作用主要是通过细胞间近距离相互作用来实现的。Zipori用骨髓细胞孵育2周形成贴壁层，移去培养基质后，也见到粒系集落形成受抑[5]。同时，还见到骨髓基质细胞层仍具有诱导CFU-GM生长的功能[6]。Bentley也认为，基质细胞贴壁层对CFU-GM的增殖主要是细胞间的相互作用。同时，也存在体液性因子的作用[7]。
, 百拇医药
当粒系培养体系中不加外源性集落刺激液(CSF)时，无基质细胞贴壁层的空白对照皿内，未见CFU-GM生长，靶细胞下有正常的3种损伤鼠的基质细胞贴壁层时，可有少量CFU-GM集落生长；正常及三个损伤组小鼠骨髓基质细胞上清液也能刺激少量CFU-GM集落生长，且单烧组上清液的刺激活性显著高于单放组。这些结果表明，贴壁层能分泌CSF样物质作用于粒系祖细胞而发挥其刺激作用。Toksoz证明，在长期培养后的早期，可从条件液中分离出刺激因子，刺激造血干细胞的DNA合成[8]。
作者认为，基质细胞对粒系祖细胞的增殖具有双向调节作用。细胞间近距离相互作用表现为负调控，而基质细胞分泌的体液因素则有利于粒系祖细胞增殖。因此，在促进放射损伤、复合伤后造血功能恢复的过程中，如何去除抑制因素，促进基质细胞CSF样物质加速分泌，以利于造血重建。
参考文献
1，罗成基，郑景熙，冉新泽.放射损伤复合烧伤对大鼠粒系造血的影响.第三军医大学学报，1983，5：119-121.
, 百拇医药
2，Dexter TM.Conditions controlling the proliferation of hamopoietic stem cells in vitro.J Cell Physiol,1977,91:335-338.
3，Chukhlovin AB,Mikhailova NB,Afanas BV.Intracellular interactions in the hematopoietic system after massive radiation exposure.Radiat Biol Radioecol,1994,34:537-541.
4，Ulianova LP,Budagov RS.Changes in the hematopoietic system and in the concentrations of blood regulatory cytokines after acute irradiation and a combined radiation-thermal lesion.Radiat Biol Radioecol,1997,37:182-185.
, http://www.100md.com
5，Zipori D,Sasson T.Adherent cells from mouse bond marrow inhibit the formation of colony stimulating factor(CSF)induced myeloid colonies.Exp Hematol,1980,8:816-821.
6，Zipori D,Sasson T,Friedman S.Bone marrow resident colony-stimulating factor activity(CSA)produced by stromal cells.Exp Hematol Today,1982,10:19-22.
7，Bentley SA.Close range cell:cell interaction required for stem cell maintenance in continuous bone marrow culture.Exp Hematol,1981,9:308-312.
8，Toksoz D,Dexter TM,Lord BL.The regulation of hemopoiesis in long term bone marrow cultures Ⅱ.Stimulation and inhibition of stem cell proliferation.Blood,1980,55:931-936.
(收稿日期:1999-03-23), 百拇医药
单位：(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000214 放烧复合伤是战时核爆炸与平时核事故所致的主要伤类之一。放烧复合伤时造血组织损伤明显。它不仅累及造血实质细胞，支持造血的微环境也发生了明显的改变。本文研究放射损伤复合烧伤后骨髓基质祖细胞的改变及骨髓基质细胞对粒系祖细胞增殖的影响。
一、材料和方法
1.实验动物、致伤方法和分组
昆明品系健康小鼠，体重20～24 g。单放组：60Coγ射线一次全身照射6 Gy，距离1.5 m，剂量率0.4 Gy/min；单烧组：3%凝固汽油烧7 s，致成15%Ⅲ度烧伤；放烧组：按以上条件先照射后烧伤；对照组：正常动物。所有动物致伤后腹腔注射生理盐水2 ml。每组动物不少于5只。
, http://www.100md.com
2.粒系祖细胞培养(CFU-GM)：常规培养方法[1]。
3.骨髓基质细胞贴壁培养：参考Dexter培养体系[2]。
(1)基质祖细胞(CFU-F)集落计数：培养2周终止培养，生理盐水洗涤，干燥、染色，计数50个非圆形细胞组成的细胞团。
(2)贴壁基质细胞层上双层琼脂粒系培养：吸去贴壁细胞上清液，洗2次，加入培养液(含25%马血清，0.5%琼脂)1 ml，凝固后加入CFU-GM培养体系1.0 ml。
二、结果
1.不同伤类小鼠骨髓基质细胞贴壁层对正常小鼠CFU-GM产率的影响
各组伤后不同时间，骨髓基质细胞均表现出抑制正常鼠CFU-GM集落的产率。琼脂隔开各基质细胞贴壁层与其上种植的靶细胞，抑制作用减弱以至消失(表1)。
, 百拇医药
表1 损伤鼠基质细胞粘壁层对正常鼠CFU-GM产率的影响 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(
±s)直接孵育
加琼脂层
伤后3 d
伤后7 d
伤后3 d
伤后7 d
单放
56.0±8.7
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45.0±2.7#
91.8±13.8*
94.4±8.5**
单烧
21.8±6.4
50.8±5.4##
72.8±12.3**
105.6±6.0**##
放烧
37.6±2.8
, 百拇医药
53.0±4.9##
57.8±2.5**
110.5±11.6**##
对照
46.8±8.1
53.8±0.9#
82.8±5.3**
84.5±13.7*
注：与同组同天直接孵育组比；*P<0.05；**P<0.01；与同组伤后3 d比；#P<0.05；##P<0.01
, http://www.100md.com
2.正常小鼠骨髓基质细胞贴壁层对损伤鼠CFU-GM产率的影响
各种伤类伤后不同时间，有基质细胞贴壁层的集落产率均显著低于无贴壁层者 (表2)。
表2 正常鼠基质细胞粘壁层对不同组(有或无粘壁层)CFU-GM产率的影响 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(
±s)无粘壁层
有粘壁层
伤后3 d
伤后7 d
伤后3 d
, http://www.100md.com
伤后7 d
单放
6.8±0.9
62.4±3.1##
2.0±0.7**
45.0±5.6*##
单烧
73.5±3.5
106.3±7.0##
8.5±0.6**
51.0±10.2**##
, 百拇医药
放烧
13.6±1.7
101.6±4.3##
6.0±0.7**
41.8±20.7**##
对照
91.6±3.9
94.2±5.9
30.4±10.9**
36.0±11.0**
注：与同组同天无粘壁层比，*P<0.05；**P<0.01；与同组伤后3 d比，#P<0.05；##P<0.01
, 百拇医药
3.损伤鼠骨髓基质细胞贴壁层对损伤鼠CFU-GM产率的影响
伤后14 d，各组贴壁层形成后，分别接种14 d各组CFU-GM，有贴壁层集落产率均显著低于无贴壁层。有贴壁层各损伤组均低于正常组(表3)。
表3 损伤鼠基质细胞粘壁层对损伤鼠(有或无粘壁层)CFU-GM产率的影响(伤后14 d) 组别
CFU-GM/105骨髓有核细胞(
±s)无粘壁层
有粘壁层
单放
111.2±7.8
, 百拇医药
20.6±1.8**
单烧
126.8±6.2
18.0±7.8**
放烧
109.6±8.2
20.0±7.8**
对照
107.6±5.2
47.0±3.8**
注：与同组同天无粘壁层比，*P<0.05；**P<0.01
, 百拇医药
三、讨论
Chukhlovin证明大剂量照射可损伤骨髓空间结构，细胞与细胞间相互作用紊乱，基质细胞产生细胞因子减少。因此，影响了照后血液系统的恢复[3]。最近，Ulianova提出，以7 Gy γ射线复合热烧伤后，骨髓细胞无明显改变，但表现出全血细胞减少，这是复合伤死亡率增高的原因[4]。本文结果证明，放射损伤和放烧复合伤对小鼠骨髓基质细胞均有损伤，而复合伤基质细胞损伤持久，恢复缓慢，这将加重射线所致的造血功能损伤，并延缓其恢复重建。
小鼠骨髓基质细胞层能抑制接种的CFU-GM的产率。以薄层琼脂分隔基质细胞贴壁层与其上的靶细胞，此种抑制作用明显减弱。说明抑制作用主要是通过细胞间近距离相互作用来实现的。Zipori用骨髓细胞孵育2周形成贴壁层，移去培养基质后，也见到粒系集落形成受抑[5]。同时，还见到骨髓基质细胞层仍具有诱导CFU-GM生长的功能[6]。Bentley也认为，基质细胞贴壁层对CFU-GM的增殖主要是细胞间的相互作用。同时，也存在体液性因子的作用[7]。
, 百拇医药
当粒系培养体系中不加外源性集落刺激液(CSF)时，无基质细胞贴壁层的空白对照皿内，未见CFU-GM生长，靶细胞下有正常的3种损伤鼠的基质细胞贴壁层时，可有少量CFU-GM集落生长；正常及三个损伤组小鼠骨髓基质细胞上清液也能刺激少量CFU-GM集落生长，且单烧组上清液的刺激活性显著高于单放组。这些结果表明，贴壁层能分泌CSF样物质作用于粒系祖细胞而发挥其刺激作用。Toksoz证明，在长期培养后的早期，可从条件液中分离出刺激因子，刺激造血干细胞的DNA合成[8]。
作者认为，基质细胞对粒系祖细胞的增殖具有双向调节作用。细胞间近距离相互作用表现为负调控，而基质细胞分泌的体液因素则有利于粒系祖细胞增殖。因此，在促进放射损伤、复合伤后造血功能恢复的过程中，如何去除抑制因素，促进基质细胞CSF样物质加速分泌，以利于造血重建。
参考文献
1，罗成基，郑景熙，冉新泽.放射损伤复合烧伤对大鼠粒系造血的影响.第三军医大学学报，1983，5：119-121.
, 百拇医药
2，Dexter TM.Conditions controlling the proliferation of hamopoietic stem cells in vitro.J Cell Physiol,1977,91:335-338.
3，Chukhlovin AB,Mikhailova NB,Afanas BV.Intracellular interactions in the hematopoietic system after massive radiation exposure.Radiat Biol Radioecol,1994,34:537-541.
4，Ulianova LP,Budagov RS.Changes in the hematopoietic system and in the concentrations of blood regulatory cytokines after acute irradiation and a combined radiation-thermal lesion.Radiat Biol Radioecol,1997,37:182-185.
, http://www.100md.com
5，Zipori D,Sasson T.Adherent cells from mouse bond marrow inhibit the formation of colony stimulating factor(CSF)induced myeloid colonies.Exp Hematol,1980,8:816-821.
6，Zipori D,Sasson T,Friedman S.Bone marrow resident colony-stimulating factor activity(CSA)produced by stromal cells.Exp Hematol Today,1982,10:19-22.
7，Bentley SA.Close range cell:cell interaction required for stem cell maintenance in continuous bone marrow culture.Exp Hematol,1981,9:308-312.
8，Toksoz D,Dexter TM,Lord BL.The regulation of hemopoiesis in long term bone marrow cultures Ⅱ.Stimulation and inhibition of stem cell proliferation.Blood,1980,55:931-936.
(收稿日期:1999-03-23), 百拇医药