正常原代猪肝细胞方瓶微载体静止培养*
作者：陈 柯 高 毅 潘玉先 杨继震
单位：第一军医大学附属珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
关键词：人工肝；肝细胞；细胞，培养的；微载体
世界化人消化杂志990307
中国图书资料分类号 R318.14
摘 要
目的 初步探讨微载体培养方法作为人工肝中生物材料培养方法的可能性.
方法 将5×107的肝细胞及2g/L cytodex-3微载体连同50mL含100mL/L猪门静脉血清及其他附助因子的DMEM培养基加入100mL的培养方瓶中培养. 光镜及电镜下观察细胞生长情况，检测培养上清中Albumin, Urea浓度.
, 百拇医药
结果 接种的肝细胞在接种时即呈明显的朝Cytodex-3聚集，二者极易相粘贴. 在培养后24h～48h，可见典型的多细胞聚集球形成，该形态特点及Albumin,Urea合成能力可保持8wk左右.
结论 使用微载体培养猪肝细胞具有多种优点. 微载体培养的肝细胞可望作为生物人工肝的生物材料.
Cultivation of porcine hypatocytes on microcarriers at standstill*
CHEN Ke, GAO Yi, PAN Yu-Xian and YANG Ji-Zhen
Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings artificial liver; hepatocytes; cell, cultured; microcarriers
Abstract
AIM To explore a method of culturing porcine hypatocytes on microcarriers and the possibility to use those cultured cells in bioartificial liver.
METHODS Hepatocytes were isolated from 1-2 month old local pig by the two-step collagenase perfusion technique. 5×107 hepatocytes, 2g/L cytodex-3 microcarriers and 50mL DMEM including 100mL/L serum from porcine portal vein were inoculated into a 100mL flask. The morphology of cultured hepatocytes and concentrations of albumin and urea in the supernatant were dynamically examined.
, 百拇医药
RESULTS Most hepatocytes got together with microcarriers, and some of them attached on microcarriers. After about 24h-48h of culture the multicellular aggregate spheroids were formed. The morphologic characteristics and the synthesis function of albumin and urea were maintained for 7-8 weeks.
CONCLUSION The cultivation of porcine hepatocytes on microcarriers has many advantages, and it is suitable for extracorporeal liver support systems.
, 百拇医药
0 引言
目前生物人工肝所面临的主要问题是肝细胞来源、数量、肝细胞密度能否达到应用于临床的要求[1，2]. 这一问题的关键是BAL体系中培养的肝细胞必须满足两个条件：一是培养的肝细胞应具有肝脏某些特异性代谢功能；二是提供的生物功能可以满足FHF患者的生理需求. 针对上述问题，我们采用改良Seglen法分离猪肝细胞，并对其进行微载体培养，以达到生物人工肝的需求. 目前用于细胞培养的微载体类型众多，如葡聚糖类的cytodex, MC-1等微载体及聚苯乙烯类的SH-2微载体等. 由于每种微载体的基质成分不同，对细胞培养的影响作用也有很大差异. 我们实验室的前期工作已对多种微载体进行了筛选，结果表明：cytodex-3无论在对细胞的粘附以及细胞在其表面生长的效果都较其他种类的微载体优越[3]. 所以本实验采用cytodex-3型微载体作为粘附载体对原代猪肝细胞进行方瓶静止培养.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 ♂本地小猪，体重15.6kg，1.5月龄. 中山医科大学实验动物中心提供. 主要试剂：胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、Ⅰ型胶原酶、cytodex-3微载体、苔盼蓝等购于Sigma生物公司. 自配50g/L甲基硅树脂乙酸乙酯溶液. 10g/L锇酸、20g/L戊二醛、梯度丙酮溶液由第一军医大学电镜室提供. S450扫描电镜(日本).
1.2 方法
1.2.1 猪肝细胞的分离培养 用30g/L的戊巴比妥钠按50mg/kg ip麻醉实验小猪，腹部备皮消毒，打开腹腔，暴露门静脉及下腔静脉，于下腔静脉内注射0.25mg(125IU)肝素. 分离门、下腔静脉，分别用经37℃水浴预热的前灌注液、胶原酶灌注液经门腔静脉循环灌注，灌注流速为50mL/min～60mL/min至肝脏变为苍白或黄白色，灌注时间约20min左右. 取下消化成熟的肝脏，切开肝包膜，将消化分离的肝细胞刷入经37℃水浴预热的Hanks液中. 分别经150，100，80μm滤网过滤，制备成粗制肝细胞悬液. 后以1000r/min的离心速度离心3min～5min，共离心3次. 把沉淀的肝细胞加入定量的DMEM培养基中制备成肝细胞悬液备用. 苔盼蓝拒染法测定肝细胞活力并进行计数. 培养瓶硅化：取5个100mL 培养方瓶，向每个方瓶中加入2mL～3mL 50g/L甲基硅树脂乙酸乙脂溶液，轻轻摇匀，吸出多余的溶液. 置60℃电烤箱烘干备用. 微载体预处理：称取20mg的cytodex-3加入已硅化的方瓶中，用40mL无Ca2+，Mg2+ PBS洗涤3次，并用PBS浸泡过夜. 经15磅30min高压消毒. 消毒后再用含100mL/L猪门静脉血清的DMEM基础培养基无菌状态下浸泡10h以上，备用. 猪肝细胞微载体培养：将经过预处理的cytodex-3微载体按2g/L的浓度加入经过50g/L甲基硅树脂乙酸乙脂溶液硅化的100mL的培养瓶中. 肝细胞按5×1010/L接种于含 微载体的培养瓶中，同时加入含100mL/L猪门静脉血清、100μg/L胰高血糖素、100μg/L转铁蛋白、200μg/L氢化可的松、100μg/L胰岛素、200μg/L头孢他定的DMEM培养基至50mL，置培养瓶于37℃，50mL/L CO2，100%湿度的二氧化碳培养箱中，前4h每15min～30min旋转摇晃1次. 4h后每2h旋转摇晃1次. 8h后停止摇晃，置于培养箱中静止培养. 培养24h后换液. 以后每2d换液1次. 每次换去10mL培养上清. 收取培养上清，以1000r/min的离心速度离心，去除细胞碎片. 测定上清中清蛋白、尿素浓度.
, http://www.100md.com
1.2.2 肝细胞功能和形态学检查 光镜观察：Olympus倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对肝细胞微载体培养进行动态观察并摄影. 微载体粘附培养的细胞计数方法：于培养的d18，取1mL均匀的样品，离心(1000r/min，5min)后，去上清液，加入等量的1g/L结晶紫-柠檬酸溶液，然后置于37℃温箱内保温1h以上，剧烈振荡并用吸管反复吹打，待微载体沉到管底时，迅速吸取上清液，在血球计数板上计算细胞核数. 扫描电镜观察：于微载体肝细胞培养的d7，在均匀的状态下取细胞培养样品，尽量去除培养基，平衡液冲洗3次. 常规30g/L戊二醛固定4h，1%锇酸固定30min，丙酮酸梯度脱水各10min，乙酸异戊酯置换4h以上，HITACHI HCP-2CO2(日本)临界干燥器干燥后，真空喷溅铂金离子，S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影. 清蛋白及尿素合成功能检测：分别收取不同培养时间的细胞培养上清液，用Beckman全自动生化分析仪测定上清中清蛋白及尿素含量.
2 结果
, 百拇医药
本实验成功地采用了改良Seglen二步胶原酶灌注法分离猪肝细胞，猪肝重434g，共获取肝细胞2.18×1010个，活力为94.6%，每克猪肝平均能获取肝细胞5.0×107个. 培养18d，微载体上已基本铺满肝细胞. 分离计算肝细胞数约为接种时的5倍左右，肝细胞数为(2.35±0.73)×108.
2.1 肝细胞形态学 倒置显微镜下观察结果：培养后4h可见有的微载体上开始有肝细胞附壁生长，其后微载体表面粘附生长的肝细胞逐渐增多. 部分微载体由于肝细胞相互作用而出现“桥联”现象(图1)，形成成片状或串珠葡萄状联合体(图2)，部分微载体与肝细胞产生“滚雪球”效应. 培养后24h可见1/3以上的微载体表面都有肝细胞粘附，肝细胞粘附贴壁后的形态为不规则多边形的上皮样细胞形态，随后见肝细胞铺展生长. 培养48h后活性肝细胞大多直接或间接地牢固粘着于微载体. 肝细胞在微载体表面粘附生长类似于肝细胞在培养瓶中单层培养生长. 培养54d后开始见肝细胞脱离微载体，至培养56d后时肝细胞基本脱落，仅有少量微载体上粘有肝细胞. 电镜显微镜观察结果：于培养18d时，取样在扫描电镜下观察，见肝细胞呈半球状紧密贴附于微载体上，细胞表面的微绒毛清晰可见，有如“仙人球”状，粘附于微载体上的肝细胞数量多少不一、分布不均，且可见两个或数个微载体借“细胞桥”相互聚集(图3).
, http://www.100md.com
图1 培养4h可见微载体间的细胞“桥联” ×200
图2 由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠” ×400
图3 电镜下串在一起的肝细胞微载体 ×730
2.2 肝细胞生化功能检测 采用Beckman全自动生化分析仪检测不同培养时间培养上清液中的清蛋白及尿素合成功能(见表1). 数据上分析，肝细胞生物合成功能在培养后7d～14d内较高，培养11d～12d时上清液中清蛋白、尿素浓度最高. 培养50d后肝细胞仍具有生物活性.
表1 培养上清液中清蛋白及尿素浓度 时间(d)
, 百拇医药
清蛋白(g/L)
尿素(mmol/L)
1
1.60±0.13
0.81±0.21
3
1.91±0.82
1.03±0.06
5
2.43±0.55
1.15±0.15
7
, http://www.100md.com
2.88±0.34
1.96±0.18
9
3.82±0.02
2.47±0.18
11
4.32±0.34
3.19±0.067
12
4.43±0.09
3.20±0.26
13
, 百拇医药
4.04±0.61
2.91±0.33
14
3.70±0.52
2.43±0.06
16
3.47±0.41
1.85±0.01
23
3.29±0.05
1.78±0.28
30
, http://www.100md.com
2.92±0.07
1.49±0.26
50
2.84±0.61
0.93±0.83
3 讨论
微载体细胞培养方法自1967年Ven Wezel首先介绍以来，就被迅速推广应用于相关的各个研究领域，其主要魅力在于微载体作为细胞培养的载体具有以下两个方面的优越性：①在单位体积内提供给细胞贴壁生长的表面积大. 人及其他哺乳类动物的细胞，绝大多数的细胞生长类型是固着生长. 对固着生长类型的细胞来说，大规模培养的一个重要的影响因素就是生长面积/体积的比率，比率越大细胞赖以生存的空间就越充分，培养的细胞密度就越高；②微载体的准悬浮状态. 这一特点不仅能充分的利用培养体系中的营养成分，更主要的是为细胞生长提供了三维的立体空间， 为悬浮的游离细胞粘附贴壁提供了充分的时间和空间. 特别是用于混合肝细胞培养时，肝细胞间容易形成类似肝脏结构的显微结构，有利于肝细胞的生长和功能的维持.
, 百拇医药
已成为商品化的微载体主要由葡聚糖、聚丙烯酰胺、交联明胶、聚苯乙烯、颗粒状纤维素和中空玻璃等六大类型. 目前常用的微载体是表面包被薄层胶原基质的葡聚糖凝胶类微载体cytodex系列产品. 主要是由于cytodex系列具有以下优点：①表面性质适合于细胞的附着、伸展和增殖；②质量密度在1030g/L～1045g/L，使载体在低速搅拌时就可悬浮于培养液中. 而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获. ③大小直径在100μm-230μm，并且比较均匀，这样有利于细胞均匀地分布于各微载体表面；④透明，在倒置显微镜下容易观察细胞到细胞在载体上的生长情况；⑤无细胞毒性作用. cytodex系列常被选用于粘附困难细胞的培养，特别是对于上皮形态细胞的贴壁培养. 在cytodex系列产品中cytodex-3是肝细胞培养较常用的微载体. 我们前期工作已证实cytodex-3型微载体是细胞培养较为理想的载体.
基于以上原因，本实验采用cytodex-3型作为原代猪肝细胞培养的载体基质，在含有100mL/L猪门静脉血清的培养体系中进行细胞培养，结果表明：原代猪肝细胞能粘附于微载体上生长，肝细胞产量可达108水平，并长期维持其生物功能活性. 本实验为本人工肝研究课题的后继工作提供了一条成功的体外肝细胞培养方法.
, 百拇医药
作者简介：
陈柯，男，1966-06-23生.江西瑞昌人，汉族.1990年江西医学院医疗系本科毕业.肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆疾病的外科治疗和研究.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570212，广东省“五个一”重点课题.
通讯作者 陈柯，510282，第一军医大学附属珠江医院普通外科，广东省广州市工业大道中253号.
*Project supported by National Natural Science Fundation of China,No.39570212.Correspondence to:CHEN Ke, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical College Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86.20.87377881 ext 2306
4 参考文献
[1] Suzuki T. Application of porous bioceramics for a hybrid type artificial liver system. Nippon Rinsho, 1997;55:2140-2147
[2] Flendrig LM, te Velde AA. Semipermeable hollow fiber membranes in hepatocyte bioreators: a prerequisite for a successful bioartificial liver Artif Organs, 1997;21:1177-1181
[3] 徐小平. 微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究.[硕士毕业论文]. 广州：第一军医大学珠江医院，1997
收稿日期 1998-06-06 修回日期 1998-12-12, 百拇医药
单位：第一军医大学附属珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
关键词：人工肝；肝细胞；细胞，培养的；微载体
世界化人消化杂志990307
中国图书资料分类号 R318.14
摘 要
目的 初步探讨微载体培养方法作为人工肝中生物材料培养方法的可能性.
方法 将5×107的肝细胞及2g/L cytodex-3微载体连同50mL含100mL/L猪门静脉血清及其他附助因子的DMEM培养基加入100mL的培养方瓶中培养. 光镜及电镜下观察细胞生长情况，检测培养上清中Albumin, Urea浓度.
, 百拇医药
结果 接种的肝细胞在接种时即呈明显的朝Cytodex-3聚集，二者极易相粘贴. 在培养后24h～48h，可见典型的多细胞聚集球形成，该形态特点及Albumin,Urea合成能力可保持8wk左右.
结论 使用微载体培养猪肝细胞具有多种优点. 微载体培养的肝细胞可望作为生物人工肝的生物材料.
Cultivation of porcine hypatocytes on microcarriers at standstill*
CHEN Ke, GAO Yi, PAN Yu-Xian and YANG Ji-Zhen
Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings artificial liver; hepatocytes; cell, cultured; microcarriers
Abstract
AIM To explore a method of culturing porcine hypatocytes on microcarriers and the possibility to use those cultured cells in bioartificial liver.
METHODS Hepatocytes were isolated from 1-2 month old local pig by the two-step collagenase perfusion technique. 5×107 hepatocytes, 2g/L cytodex-3 microcarriers and 50mL DMEM including 100mL/L serum from porcine portal vein were inoculated into a 100mL flask. The morphology of cultured hepatocytes and concentrations of albumin and urea in the supernatant were dynamically examined.
, 百拇医药
RESULTS Most hepatocytes got together with microcarriers, and some of them attached on microcarriers. After about 24h-48h of culture the multicellular aggregate spheroids were formed. The morphologic characteristics and the synthesis function of albumin and urea were maintained for 7-8 weeks.
CONCLUSION The cultivation of porcine hepatocytes on microcarriers has many advantages, and it is suitable for extracorporeal liver support systems.
, 百拇医药
0 引言
目前生物人工肝所面临的主要问题是肝细胞来源、数量、肝细胞密度能否达到应用于临床的要求[1，2]. 这一问题的关键是BAL体系中培养的肝细胞必须满足两个条件：一是培养的肝细胞应具有肝脏某些特异性代谢功能；二是提供的生物功能可以满足FHF患者的生理需求. 针对上述问题，我们采用改良Seglen法分离猪肝细胞，并对其进行微载体培养，以达到生物人工肝的需求. 目前用于细胞培养的微载体类型众多，如葡聚糖类的cytodex, MC-1等微载体及聚苯乙烯类的SH-2微载体等. 由于每种微载体的基质成分不同，对细胞培养的影响作用也有很大差异. 我们实验室的前期工作已对多种微载体进行了筛选，结果表明：cytodex-3无论在对细胞的粘附以及细胞在其表面生长的效果都较其他种类的微载体优越[3]. 所以本实验采用cytodex-3型微载体作为粘附载体对原代猪肝细胞进行方瓶静止培养.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 ♂本地小猪，体重15.6kg，1.5月龄. 中山医科大学实验动物中心提供. 主要试剂：胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、Ⅰ型胶原酶、cytodex-3微载体、苔盼蓝等购于Sigma生物公司. 自配50g/L甲基硅树脂乙酸乙酯溶液. 10g/L锇酸、20g/L戊二醛、梯度丙酮溶液由第一军医大学电镜室提供. S450扫描电镜(日本).
1.2 方法
1.2.1 猪肝细胞的分离培养 用30g/L的戊巴比妥钠按50mg/kg ip麻醉实验小猪，腹部备皮消毒，打开腹腔，暴露门静脉及下腔静脉，于下腔静脉内注射0.25mg(125IU)肝素. 分离门、下腔静脉，分别用经37℃水浴预热的前灌注液、胶原酶灌注液经门腔静脉循环灌注，灌注流速为50mL/min～60mL/min至肝脏变为苍白或黄白色，灌注时间约20min左右. 取下消化成熟的肝脏，切开肝包膜，将消化分离的肝细胞刷入经37℃水浴预热的Hanks液中. 分别经150，100，80μm滤网过滤，制备成粗制肝细胞悬液. 后以1000r/min的离心速度离心3min～5min，共离心3次. 把沉淀的肝细胞加入定量的DMEM培养基中制备成肝细胞悬液备用. 苔盼蓝拒染法测定肝细胞活力并进行计数. 培养瓶硅化：取5个100mL 培养方瓶，向每个方瓶中加入2mL～3mL 50g/L甲基硅树脂乙酸乙脂溶液，轻轻摇匀，吸出多余的溶液. 置60℃电烤箱烘干备用. 微载体预处理：称取20mg的cytodex-3加入已硅化的方瓶中，用40mL无Ca2+，Mg2+ PBS洗涤3次，并用PBS浸泡过夜. 经15磅30min高压消毒. 消毒后再用含100mL/L猪门静脉血清的DMEM基础培养基无菌状态下浸泡10h以上，备用. 猪肝细胞微载体培养：将经过预处理的cytodex-3微载体按2g/L的浓度加入经过50g/L甲基硅树脂乙酸乙脂溶液硅化的100mL的培养瓶中. 肝细胞按5×1010/L接种于含 微载体的培养瓶中，同时加入含100mL/L猪门静脉血清、100μg/L胰高血糖素、100μg/L转铁蛋白、200μg/L氢化可的松、100μg/L胰岛素、200μg/L头孢他定的DMEM培养基至50mL，置培养瓶于37℃，50mL/L CO2，100%湿度的二氧化碳培养箱中，前4h每15min～30min旋转摇晃1次. 4h后每2h旋转摇晃1次. 8h后停止摇晃，置于培养箱中静止培养. 培养24h后换液. 以后每2d换液1次. 每次换去10mL培养上清. 收取培养上清，以1000r/min的离心速度离心，去除细胞碎片. 测定上清中清蛋白、尿素浓度.
, http://www.100md.com
1.2.2 肝细胞功能和形态学检查 光镜观察：Olympus倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对肝细胞微载体培养进行动态观察并摄影. 微载体粘附培养的细胞计数方法：于培养的d18，取1mL均匀的样品，离心(1000r/min，5min)后，去上清液，加入等量的1g/L结晶紫-柠檬酸溶液，然后置于37℃温箱内保温1h以上，剧烈振荡并用吸管反复吹打，待微载体沉到管底时，迅速吸取上清液，在血球计数板上计算细胞核数. 扫描电镜观察：于微载体肝细胞培养的d7，在均匀的状态下取细胞培养样品，尽量去除培养基，平衡液冲洗3次. 常规30g/L戊二醛固定4h，1%锇酸固定30min，丙酮酸梯度脱水各10min，乙酸异戊酯置换4h以上，HITACHI HCP-2CO2(日本)临界干燥器干燥后，真空喷溅铂金离子，S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影. 清蛋白及尿素合成功能检测：分别收取不同培养时间的细胞培养上清液，用Beckman全自动生化分析仪测定上清中清蛋白及尿素含量.
2 结果
, 百拇医药
本实验成功地采用了改良Seglen二步胶原酶灌注法分离猪肝细胞，猪肝重434g，共获取肝细胞2.18×1010个，活力为94.6%，每克猪肝平均能获取肝细胞5.0×107个. 培养18d，微载体上已基本铺满肝细胞. 分离计算肝细胞数约为接种时的5倍左右，肝细胞数为(2.35±0.73)×108.
2.1 肝细胞形态学 倒置显微镜下观察结果：培养后4h可见有的微载体上开始有肝细胞附壁生长，其后微载体表面粘附生长的肝细胞逐渐增多. 部分微载体由于肝细胞相互作用而出现“桥联”现象(图1)，形成成片状或串珠葡萄状联合体(图2)，部分微载体与肝细胞产生“滚雪球”效应. 培养后24h可见1/3以上的微载体表面都有肝细胞粘附，肝细胞粘附贴壁后的形态为不规则多边形的上皮样细胞形态，随后见肝细胞铺展生长. 培养48h后活性肝细胞大多直接或间接地牢固粘着于微载体. 肝细胞在微载体表面粘附生长类似于肝细胞在培养瓶中单层培养生长. 培养54d后开始见肝细胞脱离微载体，至培养56d后时肝细胞基本脱落，仅有少量微载体上粘有肝细胞. 电镜显微镜观察结果：于培养18d时，取样在扫描电镜下观察，见肝细胞呈半球状紧密贴附于微载体上，细胞表面的微绒毛清晰可见，有如“仙人球”状，粘附于微载体上的肝细胞数量多少不一、分布不均，且可见两个或数个微载体借“细胞桥”相互聚集(图3).
, http://www.100md.com
图1 培养4h可见微载体间的细胞“桥联” ×200
图2 由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠” ×400
图3 电镜下串在一起的肝细胞微载体 ×730
2.2 肝细胞生化功能检测 采用Beckman全自动生化分析仪检测不同培养时间培养上清液中的清蛋白及尿素合成功能(见表1). 数据上分析，肝细胞生物合成功能在培养后7d～14d内较高，培养11d～12d时上清液中清蛋白、尿素浓度最高. 培养50d后肝细胞仍具有生物活性.
表1 培养上清液中清蛋白及尿素浓度 时间(d)
, 百拇医药
清蛋白(g/L)
尿素(mmol/L)
1
1.60±0.13
0.81±0.21
3
1.91±0.82
1.03±0.06
5
2.43±0.55
1.15±0.15
7
, http://www.100md.com
2.88±0.34
1.96±0.18
9
3.82±0.02
2.47±0.18
11
4.32±0.34
3.19±0.067
12
4.43±0.09
3.20±0.26
13
, 百拇医药
4.04±0.61
2.91±0.33
14
3.70±0.52
2.43±0.06
16
3.47±0.41
1.85±0.01
23
3.29±0.05
1.78±0.28
30
, http://www.100md.com
2.92±0.07
1.49±0.26
50
2.84±0.61
0.93±0.83
3 讨论
微载体细胞培养方法自1967年Ven Wezel首先介绍以来，就被迅速推广应用于相关的各个研究领域，其主要魅力在于微载体作为细胞培养的载体具有以下两个方面的优越性：①在单位体积内提供给细胞贴壁生长的表面积大. 人及其他哺乳类动物的细胞，绝大多数的细胞生长类型是固着生长. 对固着生长类型的细胞来说，大规模培养的一个重要的影响因素就是生长面积/体积的比率，比率越大细胞赖以生存的空间就越充分，培养的细胞密度就越高；②微载体的准悬浮状态. 这一特点不仅能充分的利用培养体系中的营养成分，更主要的是为细胞生长提供了三维的立体空间， 为悬浮的游离细胞粘附贴壁提供了充分的时间和空间. 特别是用于混合肝细胞培养时，肝细胞间容易形成类似肝脏结构的显微结构，有利于肝细胞的生长和功能的维持.
, 百拇医药
已成为商品化的微载体主要由葡聚糖、聚丙烯酰胺、交联明胶、聚苯乙烯、颗粒状纤维素和中空玻璃等六大类型. 目前常用的微载体是表面包被薄层胶原基质的葡聚糖凝胶类微载体cytodex系列产品. 主要是由于cytodex系列具有以下优点：①表面性质适合于细胞的附着、伸展和增殖；②质量密度在1030g/L～1045g/L，使载体在低速搅拌时就可悬浮于培养液中. 而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获. ③大小直径在100μm-230μm，并且比较均匀，这样有利于细胞均匀地分布于各微载体表面；④透明，在倒置显微镜下容易观察细胞到细胞在载体上的生长情况；⑤无细胞毒性作用. cytodex系列常被选用于粘附困难细胞的培养，特别是对于上皮形态细胞的贴壁培养. 在cytodex系列产品中cytodex-3是肝细胞培养较常用的微载体. 我们前期工作已证实cytodex-3型微载体是细胞培养较为理想的载体.
基于以上原因，本实验采用cytodex-3型作为原代猪肝细胞培养的载体基质，在含有100mL/L猪门静脉血清的培养体系中进行细胞培养，结果表明：原代猪肝细胞能粘附于微载体上生长，肝细胞产量可达108水平，并长期维持其生物功能活性. 本实验为本人工肝研究课题的后继工作提供了一条成功的体外肝细胞培养方法.
, 百拇医药
作者简介：
陈柯，男，1966-06-23生.江西瑞昌人，汉族.1990年江西医学院医疗系本科毕业.肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆疾病的外科治疗和研究.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570212，广东省“五个一”重点课题.
通讯作者 陈柯，510282，第一军医大学附属珠江医院普通外科，广东省广州市工业大道中253号.
*Project supported by National Natural Science Fundation of China,No.39570212.Correspondence to:CHEN Ke, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical College Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86.20.87377881 ext 2306
4 参考文献
[1] Suzuki T. Application of porous bioceramics for a hybrid type artificial liver system. Nippon Rinsho, 1997;55:2140-2147
[2] Flendrig LM, te Velde AA. Semipermeable hollow fiber membranes in hepatocyte bioreators: a prerequisite for a successful bioartificial liver Artif Organs, 1997;21:1177-1181
[3] 徐小平. 微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究.[硕士毕业论文]. 广州：第一军医大学珠江医院，1997
收稿日期 1998-06-06 修回日期 1998-12-12, 百拇医药