培养乳猪肝细胞型生物反应器的药物转化作用
作者：张允平 王英杰 王荣升 梁瑞廉 郁晓明 陆道琅 刘光汉
单位：张允平 王荣升 梁瑞廉 郁晓明 陆道琅 刘光汉 上海市第六人民医院(200233)；王英杰 第三军医大学西南医院全军传染病中心
关键词：
中国急救医学990647 生物反应器是生物人工肝的核心部分，借助反应器，生物材料肝细胞与流经反应器的血液相互作用，可对肝衰竭患者进行辅助支持与治疗[1]。为构建理想的体外生物人工肝支持系统，我们用乳猪肝细胞和中空纤维管组成生物反应器，用药物转化试验对其性能进行了初步评价。
1 资料与方法
1.1 乳猪肝细胞分离 新生1周的乳猪购自本地专业养殖场，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，消毒皮肤，开腹游离肝脏并完整取出。采用体外两步灌注法分离肝细胞，前灌流液为37℃、无Ca2+/Mg2+的Hanks液，沿肝组织血管进行第一步灌流，待肝组织含血显著减少后，改用37℃含EDTA的0.05%胶原酶液进行第二步灌流，待肝组织完全软后钝性撕碎，剔除大块纤维结缔组织，置胶原酶液37℃水浴振荡消化20分钟，200目钢网过滤，3分钟反复离心3次获取肝细胞，用台盼兰染色判断细胞活力，大于95%以上者用于制备生物反应器。
, 百拇医药
1.2 生物反应器的组成 选用进口多孔质中空纤维管作为反应器，其纤维数共225根，内径约为600 μm，纤维壁滤过孔径0.2 μm，反应器内外腔分别为560 cm2和670 cm2。将5×108个乳猪肝细胞加入反应器的内腔(纤维内)，二者共同组成生物反应器，外腔通过高弥散性硅胶管连接循环培养液池，置37℃、95%O2、5%CO2和100%湿度条件下，对反应器内肝细胞进行循环培养液法培养48小时后用于转化实验。
1.3 生物反应器的药物转化 使用安定和利多卡因做为实验药品，分别按50 mg/L和100 mg/L加入与反应器相连的液体循环池内，池内循环液为F12细胞培养液。使用蠕动泵以50 ml/min的速度循环含安定和利多卡因的F12培养液，定时从循环池内取样，使用Abbot TDX自动莹光偏振分析仪检测两种药物的浓度变化。实验后再用台盼兰拒染试验检测细胞活力，同时留取实验前后循环培养液，送检乳酸脱氢酶浓度。
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2 结果
生物反应器对安定有良好的转化代谢作用，实验结束时安定残余量不足所加总量的生物反应器对安定有良好的转化代谢作用，实验结束时安定残余量不足所加总量的2%，重复实验效果基本相同。
生物反应器对利多卡因也具有良好的转化代谢作用，总转化率两次试验平均为92.8%。
两次实验结束时台盼兰拒染试验显示平均为93.2%，与实验前的平均94.8%变化不显著。乳酸脱氢酶的检测结果也未发现明显的差异，实验前后的平均浓度分别为12.3IU/L和129.7 IU/L。
3 讨论
众所周知，肝脏的众所周知，肝脏的P450系统是正常肝脏功能的重要组成部分。该系统直接完成肝脏转化功能和代谢功能。因此，生物人工肝脏是否具有P450系统的作用，成为评价其人工肝脏性能的可靠与实用的指标[2]。而其中最能反映P450系统作用的当属于安定和利多卡因等药物的转化清除试验。本研究亦选用该方法与原理对自制乳猪肝细胞型中空纤维式生物反应器进行了测试，结果显示所建生物反应器具备良好的药物转化能力。两种药物的转化代谢率分别达到98%和92%以上，说明反应器内肝细胞具有很高的生物活性，能够完成P450系统的转化代谢功能，提示该生物反应器用于体外生物人工肝支持系统将对药物中毒性急性肝功能衰竭可能有较好的治疗作用，同时对急性中毒的治疗提供了新的途径。
, 百拇医药
目前国外多数研究均使用中空纤维材料制作反应器，所用空心纤维具有优良的通透性能，并可提供较大的表面积，有利于肝细胞与肝衰竭患者血液的互相作用，发挥细胞解毒的转化代谢作用[3]。但仅有反应器尚不能构建理想的生物人工肝脏，肝细胞的活性保存与保持对反应器而言更为重要。本研究采用循环培养液法对置于反应器内的肝细胞加上有效的培养，使之不仅最终能完成高效率的药物转化实验，而且于实验结束后仍保持较好的活力，提示肝细胞从分离到反应器内的培养是制备生物人工肝脏的重要环节。
本课题获国家自然科学基金资助(课题号：39370189)及九五攻关项目资助(课题号：96-920-12-02)
参考文献
1 Uchino J,Matsushita M.Artificial Liver:strategies for the rescue of patients with liver failure.ASAIO J,1994，40：74.
, 百拇医药
2 Velde A A,Ladiges NCJJ,Flendrig LM,et al.Functional activity of isolated pig hepatocytes attached to different extracellular matrix substrates.Implication for application of pig hepatocytes in a bioartificial liver.J Hepatology,1995，23：184.
3 Jauregui H O,Mullon C J P,Trenkler D,et al.Ill vivo evaluation of a hollow fiber liver assist device.Hepatplogy,1995，5，21：460.
收稿：1999-03-15, 百拇医药
单位：张允平 王荣升 梁瑞廉 郁晓明 陆道琅 刘光汉 上海市第六人民医院(200233)；王英杰 第三军医大学西南医院全军传染病中心
关键词：
中国急救医学990647 生物反应器是生物人工肝的核心部分，借助反应器，生物材料肝细胞与流经反应器的血液相互作用，可对肝衰竭患者进行辅助支持与治疗[1]。为构建理想的体外生物人工肝支持系统，我们用乳猪肝细胞和中空纤维管组成生物反应器，用药物转化试验对其性能进行了初步评价。
1 资料与方法
1.1 乳猪肝细胞分离 新生1周的乳猪购自本地专业养殖场，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，消毒皮肤，开腹游离肝脏并完整取出。采用体外两步灌注法分离肝细胞，前灌流液为37℃、无Ca2+/Mg2+的Hanks液，沿肝组织血管进行第一步灌流，待肝组织含血显著减少后，改用37℃含EDTA的0.05%胶原酶液进行第二步灌流，待肝组织完全软后钝性撕碎，剔除大块纤维结缔组织，置胶原酶液37℃水浴振荡消化20分钟，200目钢网过滤，3分钟反复离心3次获取肝细胞，用台盼兰染色判断细胞活力，大于95%以上者用于制备生物反应器。
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1.2 生物反应器的组成 选用进口多孔质中空纤维管作为反应器，其纤维数共225根，内径约为600 μm，纤维壁滤过孔径0.2 μm，反应器内外腔分别为560 cm2和670 cm2。将5×108个乳猪肝细胞加入反应器的内腔(纤维内)，二者共同组成生物反应器，外腔通过高弥散性硅胶管连接循环培养液池，置37℃、95%O2、5%CO2和100%湿度条件下，对反应器内肝细胞进行循环培养液法培养48小时后用于转化实验。
1.3 生物反应器的药物转化 使用安定和利多卡因做为实验药品，分别按50 mg/L和100 mg/L加入与反应器相连的液体循环池内，池内循环液为F12细胞培养液。使用蠕动泵以50 ml/min的速度循环含安定和利多卡因的F12培养液，定时从循环池内取样，使用Abbot TDX自动莹光偏振分析仪检测两种药物的浓度变化。实验后再用台盼兰拒染试验检测细胞活力，同时留取实验前后循环培养液，送检乳酸脱氢酶浓度。
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2 结果
生物反应器对安定有良好的转化代谢作用，实验结束时安定残余量不足所加总量的生物反应器对安定有良好的转化代谢作用，实验结束时安定残余量不足所加总量的2%，重复实验效果基本相同。
生物反应器对利多卡因也具有良好的转化代谢作用，总转化率两次试验平均为92.8%。
两次实验结束时台盼兰拒染试验显示平均为93.2%，与实验前的平均94.8%变化不显著。乳酸脱氢酶的检测结果也未发现明显的差异，实验前后的平均浓度分别为12.3IU/L和129.7 IU/L。
3 讨论
众所周知，肝脏的众所周知，肝脏的P450系统是正常肝脏功能的重要组成部分。该系统直接完成肝脏转化功能和代谢功能。因此，生物人工肝脏是否具有P450系统的作用，成为评价其人工肝脏性能的可靠与实用的指标[2]。而其中最能反映P450系统作用的当属于安定和利多卡因等药物的转化清除试验。本研究亦选用该方法与原理对自制乳猪肝细胞型中空纤维式生物反应器进行了测试，结果显示所建生物反应器具备良好的药物转化能力。两种药物的转化代谢率分别达到98%和92%以上，说明反应器内肝细胞具有很高的生物活性，能够完成P450系统的转化代谢功能，提示该生物反应器用于体外生物人工肝支持系统将对药物中毒性急性肝功能衰竭可能有较好的治疗作用，同时对急性中毒的治疗提供了新的途径。
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目前国外多数研究均使用中空纤维材料制作反应器，所用空心纤维具有优良的通透性能，并可提供较大的表面积，有利于肝细胞与肝衰竭患者血液的互相作用，发挥细胞解毒的转化代谢作用[3]。但仅有反应器尚不能构建理想的生物人工肝脏，肝细胞的活性保存与保持对反应器而言更为重要。本研究采用循环培养液法对置于反应器内的肝细胞加上有效的培养，使之不仅最终能完成高效率的药物转化实验，而且于实验结束后仍保持较好的活力，提示肝细胞从分离到反应器内的培养是制备生物人工肝脏的重要环节。
本课题获国家自然科学基金资助(课题号：39370189)及九五攻关项目资助(课题号：96-920-12-02)
参考文献
1 Uchino J,Matsushita M.Artificial Liver:strategies for the rescue of patients with liver failure.ASAIO J,1994，40：74.
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2 Velde A A,Ladiges NCJJ,Flendrig LM,et al.Functional activity of isolated pig hepatocytes attached to different extracellular matrix substrates.Implication for application of pig hepatocytes in a bioartificial liver.J Hepatology,1995，23：184.
3 Jauregui H O,Mullon C J P,Trenkler D,et al.Ill vivo evaluation of a hollow fiber liver assist device.Hepatplogy,1995，5，21：460.
收稿：1999-03-15, 百拇医药