含CD44 cDNA片段细胞系的构建及在肝癌中的应用*
作者：肖承志1 戴益民1 余宏宇1 王建军1 倪灿荣1 徐冠南2/sup> 许炳华3
单位：第二军医大学 1病理学教研室; 2长征医院普通外科 上海市 200433; 3江苏省启东市肝癌防治研究所病理室 226200
关键词：肝肿瘤/诊断；癌，肝细胞/诊断；抗原，CD44/遗传学；DNA，互补； 细胞学
华人消化杂志980204.htm Construction of cell lines with CD44 cDNA and its application in hepatocellular carcinoma*
XIAO Cheng-Zhi, DAI Yi-Min, YU Hong-Yu, WANG Jian-Jun, NI Can-Rong, XU Guan-Nan and XU Bing-Hua
, http://www.100md.com
Department of Pathology, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Subject headings liver neoplasms/diagnosis; carcinoma, hepatocellular/diagnosis; antigens, CD44/genetics; DNA,complementary; cell line
Abstract
AIM To construct cell lines with CD44 cDNA and synthesize the CD44 cDNA probe was with these cells to demonstrate the CD44 mRNA expression in hepatocellular carcinoma(HCC).
, 百拇医药
METHODS The cell lines DH5.1 and DH5.2 were constructed by transforming the PGEX-2T and PAZ plasmid into DH5 bacteria. The CD44v6 cDNA probe was synthesized with PCR technique using the plasmids abstracted from these cells as the template. The expression of CD44v6 mRNA in hepatocellular carcinoma was tested by in situ hybridization.
RESULTS The plasmids abstracted from DH5.1 contained the CD44(2v-10v) cDNA(1.1kb) and the plasmids abstracted from DH5.2 contained the full length human CD44 cDNA (1.8kb). The CD44v6 cDNA probe had 140bp. In HCC, the positive rate of CD44v6 mRNA: 80.0%(8/10) in high-risk metastasis potential group, 21.7%(5/23) in low-risk metastasis potential group, with a significant difference between them (P<0.01).
, http://www.100md.com
CONCLUSION With the plasmids from the cell lines (DH5.1 and DH5.2) the special CD44 cDNA probes can be obtained by PCR. There is a positive correlation between the expression of CD44v6 mRNA and the metastasis potential of hepatocellular carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 构建含CD44 cDNA质粒PGEX-2T和PAZ的单克隆细胞系. 并利用此细胞系合成特异的CD44 cDNA探针，原位检测肝癌中CD44 mRNA的表达.
方法 应用常规的质粒转化方法将质粒PGEX-2T和PAZ转入DH5菌株中得到单克隆细胞系. 并以从此细胞系中提取的质粒为模板，应用PCR法合成CD44 cDNA探针. 应用原位杂交法检测肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达.
, 百拇医药
结果 从DH5.1菌株中提取的质粒含CD44(2v-10v)cDNA(1.1kb)，从DH5.2菌株中提取的质粒含全长的CD44 cDNA(1.8kb)，PCR合成的CD44v6 cDNA探针长140bp. CD44v6 mRNA的阳性检出率：转移高危组为80.0%(8/10)，转移低危组为21.7%(5/23)，两者相差非常显著(P<0.01).
结论 从单克隆细胞系DH5.1和DH5.2中提取的质粒，经PCR扩增可得到特异的CD44 cDNA探针. 肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达与肿瘤的转移倾向呈正相关.
0 引言
CD44是细胞表面的整合膜蛋白，属粘连分子家族. 主要负责细胞—细胞，细胞—基质之间的粘连. CD44基因定位于人染色体11p，至少有20个外显子，长约50kb. 其中至少有10个可选择性剪接(alternative splicing)的外显子(可变子). CD44蛋白按Mr可分为80 000～90 000，110 000～160 000， 180 000～215 000三类. 越来越多的研究表明，CD44基因尤其是它的可变子的高水平的表达与肿瘤的转移和浸润密切相关，CD44的可变子中CD44v6与肿瘤的转移关系更为密切，含有由CD44v6外显子编码的反应表位的拼接变异体能使癌细胞发生以淋巴系统为途径的扩散转移[1，2]. 但也有相反的报道[3，4]. 为进一步研究CD44在肿瘤转移中的确切作用，得到分子生物学研究中所需的模板和探针，我室构建了两株单克隆菌株：DH5.1(含PGEX-2T质粒)，DH5.2(含PAZ质粒).
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1 材料和方法
1.1 材料 ①CD44 cDNA：两株质粒均由瑞士Gunthert U博士惠赠，附有DNA测序图谱(与文献报道相符). 载体质粒PGEX-2T中CD44v2～v10 cDNA插于EcoRI酶切位点. 载体质粒PAZ中CD44全长cDNA插于EcoRI酶切位点. 两株质粒中均含有氨苄青霉素抗性基因(ampr). ②DH5菌株瑞士Gunthert U博士惠赠. ③EcoRI酶：Boehringer Mannheim. ④CD44引物：设计按文献[5]，由上海中科院植物生理所合成：5′TCCAGGCAACTCCTAGTAGT;和5′CAGCTGTCCCTGTTGTCGAA. ⑤Taq酶：Boehringer Mannheim. ⑥Bio-11-dUTP: Boehringer Mannheim. ⑦DNA扩增仪：Perkin Elmer公司，DNA thermal cycler 480.
1.2 质粒的转化
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1.2.1 感受态细胞的制备 无菌操作，从37℃培养12h的平板中用接种环挑取一个单菌落，转到含有3ml LB培养基的试管内，37℃ 200r/min培养过夜后取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基500ml烧瓶中，37℃ 300r/min振荡培养3h，将烧瓶取出立即置冰浴15min. 4℃ 4000r/min回收细菌. 弃净培养液，加用冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10ml重悬菌体，置冰浴30min. 4℃ 4000r/min回收细菌. 再加4ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体. 置4℃冰箱中备用.
1.2.2 细菌的转化 取上述制备的感受态细菌200μl置Eppendorf管中，加PGEX-2T或PAZ质粒100ng，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min. 42℃水浴中热休克30s. 每管中加LB培养基800μl, 37℃ 100r/min温和振荡培养45min. 取200μl培养液涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养12h.
, 百拇医药
1.3 质粒的制备与鉴定
1.3.1 细菌的培养 取灭菌的10ml试管，用无菌的吸管LB培养基3ml. 加入50g/L氨苄青霉素5μl. 用接种环从上述的琼脂平板上挑取单菌落，转入培养基中，封好管口. 37℃ 200r/min 摇床培养12h. 取500ml培养瓶内装有已灭菌的LB培养基100ml及相应氨苄青霉素. 以10g/L的浓度接种菌液，37℃ 200r/min摇床培养至A(OD值)0.6～0.8.
1.3.2 质粒的提取和纯化 用常规碱裂解法提取质粒，用等体积的平衡酚及氯仿：异戊醇(24∶1)各抽提纯化1次.
1.3.3 质粒鉴定 转化、扩增、抽提后得到的质粒用EcoRI酶切后经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定：电压80V，时间1h.
1.4 合成特异CD44 cDNA探针
, 百拇医药
1.4.1 PCR扩增 在0.5ml Eppendorf管中加入下列成分(按100μl反应体积计算)：二种引物各2μl(各约100pmol)；10×PCR反应缓冲液10μl；dNTPs 10μl(2mmol混合母液，pH 7.0)；模板1μl(PGEX-2T或PAZ质粒各约1μg)；加去离子水补至100μl(包括Taq酶积). 上述诸液混匀后，5000g离心15s，使液体沉至管底. 加石蜡油30μl～50μl于反应液表面，以防止加温过程中液体蒸发影响反应体积. 97℃变性5min，冰浴冷却，加Taq酶2μl(1MU/L)，短暂离心. 72℃ 2min. 开始循环： 变性94℃， 30s；退火60℃，30s， 延伸72℃,1min. 重复30个循环. 末次循环后，在延伸温度再延时5min. 反应结束后，短暂离心，吸取少量(5μl)电泳(后述)，余置4℃保存备用.
图1 纯化质粒及酶切产物琼脂糖凝胶电泳
, 百拇医药
A：PAZ质粒；B：PGEX-2T质粒经EcoRI消化；
C：λ DNA EcoRI/HindⅢ marker；D：PGEX-2T质粒
E：PAZ质粒经EcoRI消化.
图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
A：pBR322/HaeⅢ marker； B：未标记的PCR产物；
C：标记的PCR产物.
图3 肝细胞癌，CD44v6 mRNA原位杂交染色阳性.
1.4.2 CD44 cDNA探针的标记 在上述的反应混合物中，用Bio-11-dUTP以dTTP：dUTP为3∶1的比例替代dTTP部分进行PCR扩增，可得到标记的探针.
, 百拇医药
1.4.3 PCR产物的鉴定 40g/L琼脂糖凝胶电泳：电压80V，时间1.5h.
2 结果
2.1 质粒鉴定 转化、扩增、抽提后得到的质粒经EcoRI酶切后经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合质粒的背景资料. 即PGEX-2T中插入的CD44可变区cDNA片段长度为1.1kb，PAZ质粒中插入的CD44全长cDNA片段长度为1.8kb，图中：条带①示PAZ质粒；条带②示PGEX-2T质粒经EcoRI酶切后呈现4.9kb，1.1kb条带；条带③为λDNA HindⅢ/EcoRI marker；条带④示PGEX-2T质粒；条带⑤示PAZ质粒经EcoRI酶切后呈现2.1kb，1.8kb条带.
2.2 PCR产物鉴定 PCR扩增产物经40g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合CD44v6的背景资料. 图中：条带①为pBR322/HaeⅢ marker；条带②为长约140bp的未标记CD44v6片段；条带③为长约140bp的Bio-11-dUTP标记的CD44v6探针，泳动速率略慢于未标记者.
, 百拇医药
3 讨论
研究表明，CD44基因尤其是它的可变子的高水平表达与肿瘤的转移和浸润密切相关，有人甚至提议将CD44作为“转移基因”或其候选基因[2]. Seiter et al[1]在结直肠肿瘤，Harn et al[2]在肝细胞癌中发现CD44变异型的高表达与癌转移呈正相关. 但是，Fox et al[3]研究表明，在人的不同肿瘤中CD44v的表达有很大差异，其中的一些很少或不表达CD44v. Terpe et al[4]发现CD44的表达与肿瘤的预后存在负相关，认为CD44的表达与肿瘤细胞的分化程度相一致，而不是与临床进展相一致. 我们注意到，上述两种不同结果的研究中大部分均采用免疫组化法检测CD44蛋白的表达或用RT-PCR法检测CD44mRNA的表达，其核酸杂交均采用同位素标记. 为了进一步研究CD44在肿瘤转移和浸润中的确切作用，CD44蛋白表达和mRNA表达的一致性及CD44与其他肿瘤相关基因间的相互作用，需要有高特异、高敏感性、易获得、无放射性污染的CD44 cDNA片段以制备杂交中所需的探针及PCR扩增中的阳性对照. 为此，我们构建了DH5.1和DH5.2单克隆菌株.
, 百拇医药
3.1 作为PCR扩增的模板 由于CD44分子的可变性，不同组织、细胞中CD44分子的结构并不相同，而采用切口平移法、随机引物法、聚合酶体外转录法等方法合成的探针多由多个外显子组成，因而与不同组织或细胞的杂交能力也将有所不同，这将影响杂交的准确性. 而在采用 PCR 法合成 cDNA 探针时，可设计不同的引物来扩增所需的特异性的单个外显子组成的cDNA片段作为分子杂交中的探针，如利用不对称PCR技术尚可获得单链cDNA探针，可提高杂交的敏感性和稳定性，且可在扩增的同时进行非放射性标记物的标记. 这样，可省去制备RNA探针操作中为避免RNA酶污染所需的仪器和技术上的高要求. 由于PCR扩增的高效性，可在短时间内获得大量的探针，可满足大量检测所需.
3.2 利用质粒载体克隆CD44 cDNA 将重组于PGEX-2T中的CD44 cDNA片段经EcoRI酶切后采用粘端连接法与用EcoRI酶切的PGEM-4Z质粒重组. 利用PGEM-4Z质粒中的SP6和T7启动子来合成CD44的cRNA探针.
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我们利用以上方法制备了CD44v6 cDNA探针，原位检测了33例肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达. 结果显示：转移高危组标本10例中有8例(80.0%)有CD44v6 mRNA的表达，转移低组标本23例中有5例(21.7%)有CD44v6 mRNA的表达，两者相差非常显著(P<0.01)， 表明在肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达与肿瘤的转移倾向呈正相关. 以上实验表明，利用我们构建的细胞系采用PCR法可得到高特异性、高敏感性、无放射性污染的CD44 cDNA探针，应用于CD44的基础研究和临床检测工作.
肖承志，男，1970-05-14生，汉族. 1994年第二军医大学临床医学系毕业. 目前正在第二军医大学基础医学部病理学教研室攻读硕士学位. 主要从事肝脏肿瘤的病理学研究.
*国家自然科学基金资助项目，No. 39370294.
通讯作者 肖承志，200433，第二军医大学病理学教研室，上海市翔殷路800号.
, 百拇医药
*Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39370294.
Correspondence to: Dr. XIAO Cheng-Zhi, Department of Pathology, Second Military Medical University, 800 Xiangyin Road, Shanghai 200433, China
Tel. +86*21*65347018-71363
收稿日期 1997-09-20 修回日期 1997-12-02
4 参考文献
1 Seiter S, Arch R, Reber S, Komitowski D, Hofmann M, Ponta H et al. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J Exp Med, 1993;177(2):443-455
, 百拇医药
2 Harn HJ. The variant mRNA isoform of human metastasis gene (CD44) detected in the cell lines of human hepatocellular carcinoma. Biochem Mol Biol Int, 1994;32(2):233-238
3 Fox SB, Fancett J, Jackson DG, Collins I, Gatter KC, Harris Al et al. Normal human tissues, in addition to some tumors, express multiple different CD44 isoforms. Cancer Res, 1994;54(16):4539-4546
4 Terpe HJ, Christriansen H, Gonzales M, Berthold F, Lampert F. Differentiation and prognosis of neuroblastoma in correlation to the expression of CD44s. Eur J Cancer, 1995;31A(4):549-552
5 Friedrichs K, Franke F, Lisboa BW, Kugler G, Gille I, Terper HJ et al. CD44 isoforms correlate with cellular differentiation but nor with prognosis in human breast cancer. Cancer Res, 1995;55(22):5424-5433, 百拇医药(肖承志1 戴益民1 余宏宇1 王建军1 倪灿荣1 徐冠南2/sup> 许炳华3)
单位：第二军医大学 1病理学教研室; 2长征医院普通外科 上海市 200433; 3江苏省启东市肝癌防治研究所病理室 226200
关键词：肝肿瘤/诊断；癌，肝细胞/诊断；抗原，CD44/遗传学；DNA，互补； 细胞学
华人消化杂志980204.htm Construction of cell lines with CD44 cDNA and its application in hepatocellular carcinoma*
XIAO Cheng-Zhi, DAI Yi-Min, YU Hong-Yu, WANG Jian-Jun, NI Can-Rong, XU Guan-Nan and XU Bing-Hua
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Department of Pathology, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Subject headings liver neoplasms/diagnosis; carcinoma, hepatocellular/diagnosis; antigens, CD44/genetics; DNA,complementary; cell line
Abstract
AIM To construct cell lines with CD44 cDNA and synthesize the CD44 cDNA probe was with these cells to demonstrate the CD44 mRNA expression in hepatocellular carcinoma(HCC).
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METHODS The cell lines DH5.1 and DH5.2 were constructed by transforming the PGEX-2T and PAZ plasmid into DH5 bacteria. The CD44v6 cDNA probe was synthesized with PCR technique using the plasmids abstracted from these cells as the template. The expression of CD44v6 mRNA in hepatocellular carcinoma was tested by in situ hybridization.
RESULTS The plasmids abstracted from DH5.1 contained the CD44(2v-10v) cDNA(1.1kb) and the plasmids abstracted from DH5.2 contained the full length human CD44 cDNA (1.8kb). The CD44v6 cDNA probe had 140bp. In HCC, the positive rate of CD44v6 mRNA: 80.0%(8/10) in high-risk metastasis potential group, 21.7%(5/23) in low-risk metastasis potential group, with a significant difference between them (P<0.01).
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CONCLUSION With the plasmids from the cell lines (DH5.1 and DH5.2) the special CD44 cDNA probes can be obtained by PCR. There is a positive correlation between the expression of CD44v6 mRNA and the metastasis potential of hepatocellular carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 构建含CD44 cDNA质粒PGEX-2T和PAZ的单克隆细胞系. 并利用此细胞系合成特异的CD44 cDNA探针，原位检测肝癌中CD44 mRNA的表达.
方法 应用常规的质粒转化方法将质粒PGEX-2T和PAZ转入DH5菌株中得到单克隆细胞系. 并以从此细胞系中提取的质粒为模板，应用PCR法合成CD44 cDNA探针. 应用原位杂交法检测肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达.
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结果 从DH5.1菌株中提取的质粒含CD44(2v-10v)cDNA(1.1kb)，从DH5.2菌株中提取的质粒含全长的CD44 cDNA(1.8kb)，PCR合成的CD44v6 cDNA探针长140bp. CD44v6 mRNA的阳性检出率：转移高危组为80.0%(8/10)，转移低危组为21.7%(5/23)，两者相差非常显著(P<0.01).
结论 从单克隆细胞系DH5.1和DH5.2中提取的质粒，经PCR扩增可得到特异的CD44 cDNA探针. 肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达与肿瘤的转移倾向呈正相关.
0 引言
CD44是细胞表面的整合膜蛋白，属粘连分子家族. 主要负责细胞—细胞，细胞—基质之间的粘连. CD44基因定位于人染色体11p，至少有20个外显子，长约50kb. 其中至少有10个可选择性剪接(alternative splicing)的外显子(可变子). CD44蛋白按Mr可分为80 000～90 000，110 000～160 000， 180 000～215 000三类. 越来越多的研究表明，CD44基因尤其是它的可变子的高水平的表达与肿瘤的转移和浸润密切相关，CD44的可变子中CD44v6与肿瘤的转移关系更为密切，含有由CD44v6外显子编码的反应表位的拼接变异体能使癌细胞发生以淋巴系统为途径的扩散转移[1，2]. 但也有相反的报道[3，4]. 为进一步研究CD44在肿瘤转移中的确切作用，得到分子生物学研究中所需的模板和探针，我室构建了两株单克隆菌株：DH5.1(含PGEX-2T质粒)，DH5.2(含PAZ质粒).
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1 材料和方法
1.1 材料 ①CD44 cDNA：两株质粒均由瑞士Gunthert U博士惠赠，附有DNA测序图谱(与文献报道相符). 载体质粒PGEX-2T中CD44v2～v10 cDNA插于EcoRI酶切位点. 载体质粒PAZ中CD44全长cDNA插于EcoRI酶切位点. 两株质粒中均含有氨苄青霉素抗性基因(ampr). ②DH5菌株瑞士Gunthert U博士惠赠. ③EcoRI酶：Boehringer Mannheim. ④CD44引物：设计按文献[5]，由上海中科院植物生理所合成：5′TCCAGGCAACTCCTAGTAGT;和5′CAGCTGTCCCTGTTGTCGAA. ⑤Taq酶：Boehringer Mannheim. ⑥Bio-11-dUTP: Boehringer Mannheim. ⑦DNA扩增仪：Perkin Elmer公司，DNA thermal cycler 480.
1.2 质粒的转化
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1.2.1 感受态细胞的制备 无菌操作，从37℃培养12h的平板中用接种环挑取一个单菌落，转到含有3ml LB培养基的试管内，37℃ 200r/min培养过夜后取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基500ml烧瓶中，37℃ 300r/min振荡培养3h，将烧瓶取出立即置冰浴15min. 4℃ 4000r/min回收细菌. 弃净培养液，加用冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10ml重悬菌体，置冰浴30min. 4℃ 4000r/min回收细菌. 再加4ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体. 置4℃冰箱中备用.
1.2.2 细菌的转化 取上述制备的感受态细菌200μl置Eppendorf管中，加PGEX-2T或PAZ质粒100ng，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min. 42℃水浴中热休克30s. 每管中加LB培养基800μl, 37℃ 100r/min温和振荡培养45min. 取200μl培养液涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养12h.
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1.3 质粒的制备与鉴定
1.3.1 细菌的培养 取灭菌的10ml试管，用无菌的吸管LB培养基3ml. 加入50g/L氨苄青霉素5μl. 用接种环从上述的琼脂平板上挑取单菌落，转入培养基中，封好管口. 37℃ 200r/min 摇床培养12h. 取500ml培养瓶内装有已灭菌的LB培养基100ml及相应氨苄青霉素. 以10g/L的浓度接种菌液，37℃ 200r/min摇床培养至A(OD值)0.6～0.8.
1.3.2 质粒的提取和纯化 用常规碱裂解法提取质粒，用等体积的平衡酚及氯仿：异戊醇(24∶1)各抽提纯化1次.
1.3.3 质粒鉴定 转化、扩增、抽提后得到的质粒用EcoRI酶切后经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定：电压80V，时间1h.
1.4 合成特异CD44 cDNA探针
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1.4.1 PCR扩增 在0.5ml Eppendorf管中加入下列成分(按100μl反应体积计算)：二种引物各2μl(各约100pmol)；10×PCR反应缓冲液10μl；dNTPs 10μl(2mmol混合母液，pH 7.0)；模板1μl(PGEX-2T或PAZ质粒各约1μg)；加去离子水补至100μl(包括Taq酶积). 上述诸液混匀后，5000g离心15s，使液体沉至管底. 加石蜡油30μl～50μl于反应液表面，以防止加温过程中液体蒸发影响反应体积. 97℃变性5min，冰浴冷却，加Taq酶2μl(1MU/L)，短暂离心. 72℃ 2min. 开始循环： 变性94℃， 30s；退火60℃，30s， 延伸72℃,1min. 重复30个循环. 末次循环后，在延伸温度再延时5min. 反应结束后，短暂离心，吸取少量(5μl)电泳(后述)，余置4℃保存备用.
图1 纯化质粒及酶切产物琼脂糖凝胶电泳
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A：PAZ质粒；B：PGEX-2T质粒经EcoRI消化；
C：λ DNA EcoRI/HindⅢ marker；D：PGEX-2T质粒
E：PAZ质粒经EcoRI消化.
图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
A：pBR322/HaeⅢ marker； B：未标记的PCR产物；
C：标记的PCR产物.
图3 肝细胞癌，CD44v6 mRNA原位杂交染色阳性.
1.4.2 CD44 cDNA探针的标记 在上述的反应混合物中，用Bio-11-dUTP以dTTP：dUTP为3∶1的比例替代dTTP部分进行PCR扩增，可得到标记的探针.
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1.4.3 PCR产物的鉴定 40g/L琼脂糖凝胶电泳：电压80V，时间1.5h.
2 结果
2.1 质粒鉴定 转化、扩增、抽提后得到的质粒经EcoRI酶切后经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合质粒的背景资料. 即PGEX-2T中插入的CD44可变区cDNA片段长度为1.1kb，PAZ质粒中插入的CD44全长cDNA片段长度为1.8kb，图中：条带①示PAZ质粒；条带②示PGEX-2T质粒经EcoRI酶切后呈现4.9kb，1.1kb条带；条带③为λDNA HindⅢ/EcoRI marker；条带④示PGEX-2T质粒；条带⑤示PAZ质粒经EcoRI酶切后呈现2.1kb，1.8kb条带.
2.2 PCR产物鉴定 PCR扩增产物经40g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合CD44v6的背景资料. 图中：条带①为pBR322/HaeⅢ marker；条带②为长约140bp的未标记CD44v6片段；条带③为长约140bp的Bio-11-dUTP标记的CD44v6探针，泳动速率略慢于未标记者.
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3 讨论
研究表明，CD44基因尤其是它的可变子的高水平表达与肿瘤的转移和浸润密切相关，有人甚至提议将CD44作为“转移基因”或其候选基因[2]. Seiter et al[1]在结直肠肿瘤，Harn et al[2]在肝细胞癌中发现CD44变异型的高表达与癌转移呈正相关. 但是，Fox et al[3]研究表明，在人的不同肿瘤中CD44v的表达有很大差异，其中的一些很少或不表达CD44v. Terpe et al[4]发现CD44的表达与肿瘤的预后存在负相关，认为CD44的表达与肿瘤细胞的分化程度相一致，而不是与临床进展相一致. 我们注意到，上述两种不同结果的研究中大部分均采用免疫组化法检测CD44蛋白的表达或用RT-PCR法检测CD44mRNA的表达，其核酸杂交均采用同位素标记. 为了进一步研究CD44在肿瘤转移和浸润中的确切作用，CD44蛋白表达和mRNA表达的一致性及CD44与其他肿瘤相关基因间的相互作用，需要有高特异、高敏感性、易获得、无放射性污染的CD44 cDNA片段以制备杂交中所需的探针及PCR扩增中的阳性对照. 为此，我们构建了DH5.1和DH5.2单克隆菌株.
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3.1 作为PCR扩增的模板 由于CD44分子的可变性，不同组织、细胞中CD44分子的结构并不相同，而采用切口平移法、随机引物法、聚合酶体外转录法等方法合成的探针多由多个外显子组成，因而与不同组织或细胞的杂交能力也将有所不同，这将影响杂交的准确性. 而在采用 PCR 法合成 cDNA 探针时，可设计不同的引物来扩增所需的特异性的单个外显子组成的cDNA片段作为分子杂交中的探针，如利用不对称PCR技术尚可获得单链cDNA探针，可提高杂交的敏感性和稳定性，且可在扩增的同时进行非放射性标记物的标记. 这样，可省去制备RNA探针操作中为避免RNA酶污染所需的仪器和技术上的高要求. 由于PCR扩增的高效性，可在短时间内获得大量的探针，可满足大量检测所需.
3.2 利用质粒载体克隆CD44 cDNA 将重组于PGEX-2T中的CD44 cDNA片段经EcoRI酶切后采用粘端连接法与用EcoRI酶切的PGEM-4Z质粒重组. 利用PGEM-4Z质粒中的SP6和T7启动子来合成CD44的cRNA探针.
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我们利用以上方法制备了CD44v6 cDNA探针，原位检测了33例肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达. 结果显示：转移高危组标本10例中有8例(80.0%)有CD44v6 mRNA的表达，转移低组标本23例中有5例(21.7%)有CD44v6 mRNA的表达，两者相差非常显著(P<0.01)， 表明在肝细胞癌中CD44v6 mRNA的表达与肿瘤的转移倾向呈正相关. 以上实验表明，利用我们构建的细胞系采用PCR法可得到高特异性、高敏感性、无放射性污染的CD44 cDNA探针，应用于CD44的基础研究和临床检测工作.
肖承志，男，1970-05-14生，汉族. 1994年第二军医大学临床医学系毕业. 目前正在第二军医大学基础医学部病理学教研室攻读硕士学位. 主要从事肝脏肿瘤的病理学研究.
*国家自然科学基金资助项目，No. 39370294.
通讯作者 肖承志，200433，第二军医大学病理学教研室，上海市翔殷路800号.
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*Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39370294.
Correspondence to: Dr. XIAO Cheng-Zhi, Department of Pathology, Second Military Medical University, 800 Xiangyin Road, Shanghai 200433, China
Tel. +86*21*65347018-71363
收稿日期 1997-09-20 修回日期 1997-12-02
4 参考文献
1 Seiter S, Arch R, Reber S, Komitowski D, Hofmann M, Ponta H et al. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J Exp Med, 1993;177(2):443-455
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2 Harn HJ. The variant mRNA isoform of human metastasis gene (CD44) detected in the cell lines of human hepatocellular carcinoma. Biochem Mol Biol Int, 1994;32(2):233-238
3 Fox SB, Fancett J, Jackson DG, Collins I, Gatter KC, Harris Al et al. Normal human tissues, in addition to some tumors, express multiple different CD44 isoforms. Cancer Res, 1994;54(16):4539-4546
4 Terpe HJ, Christriansen H, Gonzales M, Berthold F, Lampert F. Differentiation and prognosis of neuroblastoma in correlation to the expression of CD44s. Eur J Cancer, 1995;31A(4):549-552
5 Friedrichs K, Franke F, Lisboa BW, Kugler G, Gille I, Terper HJ et al. CD44 isoforms correlate with cellular differentiation but nor with prognosis in human breast cancer. Cancer Res, 1995;55(22):5424-5433, 百拇医药(肖承志1 戴益民1 余宏宇1 王建军1 倪灿荣1 徐冠南2/sup> 许炳华3)