一种快速实用的人心房肌细胞分离方法
作者：梁延春 张荣庆 周更须 贾国良 蔡振杰
单位：梁延春 张荣庆 贾国良 蔡振杰(第四军医大学西京医院:心脏内科)；周更须(心脏外科, 陕西 西安 710032)
关键词：人；心房；细胞；分离；方法
心脏杂志000434中图分类号：R33-33 文献标识码：B 文章编号：1005-3271(2000)04-0319-02
加拿大学者Bustamante等于1982年首次报道了人心房肌单个细胞的分离方法[1]，以后，许多外国学者采用改良的Bustamante法成功分离人心房肌单个细胞。目前，国内人心房肌单个细胞分离方法报道极少见[2]。作者参考国外的方法，经过改良，成功地分离出100例患者的心房肌细胞，建立起适合中国人种的心房肌细胞分离方法。在此基础上,作者在消化过程中加用磁力搅拌,使得细胞分离过程缩短至20～25 min,变得快速实用。为直接研究中国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学性状的改变提供了物质基础，对于心房疾病(如心房纤颤)发病机制和治疗方法的研究，可以在不用动物模型的条件下，在细胞乃至分子水平直接进行。
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1 材料和方法
1.1 试剂和溶液的配制 胶原酶(日本YAKULT公司，500 U/mg)，蛋白酶XXIV(美国SIGMA公司，4 U/mg)。 无钙液(mmol/L)：NaCl 126,KCl 5.4,MgCl2 1.0,NaH2PO4 0.33, 葡萄糖10.0,HEPES(SIGMA公司) 10.0,用NaOH调pH至7.4。细胞保护液(KB液, mmol/L)：KCl 20.0,KH2PO4 10.0, 葡萄糖10.0,谷氨酸70.0,牛磺酸10.0,EGTA (SIGMA公司)10.0,牛血清白蛋白(美国Amerco)10 g/L,用KOH调pH至7.4。有钙液(mmol/L)：NaCl 126, KCl 5.4, MgCl2 0.8,CaCl2 1.0, NaH2PO4 0.33, HEPES(SIGMA公司) 10.0, 葡萄糖5.5, 用NaOH调pH至7.4。未注明试剂均为国产试剂。试剂配制见参考文献[3,4]。
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1.2 标本采集 心房标本取材于行心外科手术患者的右心耳。用10 ml氧饱和的无钙液在37℃保温下，于5～10 min内送到实验室。
1.3 人心房肌单个细胞的分离保存 标本在氧饱和无钙液中剪成1 mm3小块，用无钙液在磁力搅拌(2 Hz)下洗涤3次，洗除标本中的血液和钙离子。在磁力搅拌(2 Hz)并充氧条件下，用含有胶原酶(200 U/ml)、蛋白酶(2 U/ml)的无钙液中消化15 min后，换成含有胶原酶(200 U/ml)的无钙液进行第二步消化；5～10 min后，将组织块在KB液中轻轻吹打，使细胞松散脱离组织块；细胞悬液用200目滤网过滤，分离出的人心房单个细胞用KB液保存。实验过程温度始终保持在37℃。
1.4 复钙及显微镜观察 分离出的心房肌细胞，在KB液中保存30～60 min后，吹匀，经200目滤网过滤，1000 r/min离心5 min，弃上清，加有钙液5 ml吹匀后加入培养皿中，于倒置显微镜下观察。
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1.5 膜片钳技术记录钾电流 应用仪器为美国AXON公司生产的Axopatch 200B放大器，参照文献[2]方法进行。
1.6 活性鉴定 用4 g/L的台盼蓝1份、细胞悬液9份进行染色，3 min后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，算出活细胞百分比。参照文献[5]。
2 结果
采用两步酶消化分离法，分离出杆状、横纹清晰、细胞膜完整的具有典型特征的人心房肌细胞(图1)。经KB液保护30～60 min，复钙后，显微镜下观察一些细胞有收缩，完全贴壁后收缩消失，形态无明显变化。膜片钳记录到的钾电流如图2所示。在有钙液中保存24 h，细胞仍平滑、清洁度好、细胞膜完整(图3)。经台盼蓝染色，死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染(图4)，细胞成活率为30%～70%。
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图 1 分离出的典型人心房肌细胞
图 2 人心房肌细胞钾电流
图 3 有钙液保存24 h的活细胞
图 4 台盼蓝染色后的活细胞
3 讨论
对于心房肌整体 及单个细胞在生理及病理情况下生物学性状及改变的研究，以往多靠动物模型来完成[6,7] ，但动物心脏与人的心脏在大小、质量、生理学性状及病理学改变上存在差异,所以动物模型研究的结果不能直接应用到人体。直接在人的心房肌细胞上对某些疾病(如心房纤颤)发病机制及治疗方法的研究，其结果较可靠。国外学者采用改良的Bustamante方法成功分离人心房肌单个细胞。作者曾采用国外学者的分离方法，摸索分离50余例中国人心房肌单个细胞，均未取得成功。以后反复试验，将胶原酶及蛋白酶的浓度调整至国外文献方法的一半，并且缩短了消化时间，成功地分离出100余例患者的心房肌细胞。在此基础上,在消化过程中加用磁力搅拌,使得细胞分离过程缩短至20～25 min之间,使本方法更加快速实用。分离的单个人心房肌细胞经台盼蓝染色，细胞包膜完整，显微镜观察，细胞具有收缩功能，膜片钳试验证实了细胞的电生理活性。本方法的建立，为直接研究中国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学性状的改变提供了物质基础。
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参考文献：
[1] Bustamante JO, Watanbe T, Murphy DA， et al. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart[J]. Can Med Assoc,1982,126(7): 791.
[2] Xu WH, Li W, Wang XL, et al. Characteristics of transient outward K+ current in human atrial cardiomyocytes[J]. Acta Phamacologica Sinica, 1998, 19(5): 481.
[3] Escand D, Coulombe A, Danziger RS, et al. Two types of transient outward currents in adult human atrial cells[J]. Am J Physiol, 1987, 252(21): H142.
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[4] Feng JL, Wible B, Li GR, et al. Antisense oligodeoxynucleotides directed against Kv1.5 mRNA specifically inhibit ultrarapid delayed rectifier K+ current in cultured adult human atrial myocytes[J]. Circ Res,1997， 80(4): 572.
[5] 司徒镇强. 细胞培养[M]. 陕西：世界图书出版公司，1996.181～183.
[6] Wiffels MCEF, Kirchhof CJHJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats[J]. Circulation, 1995, 92(7): 1954.
[7] Lixia Y, Jianlin F, Rania G, et al. Ionic remodeling underlying action potential changes in a canine model of atrial fibrillation [J]. Circ Res,1997, 81(3): 512.
(收稿 1999-11-22 修回 2000-04-04), http://www.100md.com
单位：梁延春 张荣庆 贾国良 蔡振杰(第四军医大学西京医院:心脏内科)；周更须(心脏外科, 陕西 西安 710032)
关键词：人；心房；细胞；分离；方法
心脏杂志000434中图分类号：R33-33 文献标识码：B 文章编号：1005-3271(2000)04-0319-02
加拿大学者Bustamante等于1982年首次报道了人心房肌单个细胞的分离方法[1]，以后，许多外国学者采用改良的Bustamante法成功分离人心房肌单个细胞。目前，国内人心房肌单个细胞分离方法报道极少见[2]。作者参考国外的方法，经过改良，成功地分离出100例患者的心房肌细胞，建立起适合中国人种的心房肌细胞分离方法。在此基础上,作者在消化过程中加用磁力搅拌,使得细胞分离过程缩短至20～25 min,变得快速实用。为直接研究中国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学性状的改变提供了物质基础，对于心房疾病(如心房纤颤)发病机制和治疗方法的研究，可以在不用动物模型的条件下，在细胞乃至分子水平直接进行。
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1 材料和方法
1.1 试剂和溶液的配制 胶原酶(日本YAKULT公司，500 U/mg)，蛋白酶XXIV(美国SIGMA公司，4 U/mg)。 无钙液(mmol/L)：NaCl 126,KCl 5.4,MgCl2 1.0,NaH2PO4 0.33, 葡萄糖10.0,HEPES(SIGMA公司) 10.0,用NaOH调pH至7.4。细胞保护液(KB液, mmol/L)：KCl 20.0,KH2PO4 10.0, 葡萄糖10.0,谷氨酸70.0,牛磺酸10.0,EGTA (SIGMA公司)10.0,牛血清白蛋白(美国Amerco)10 g/L,用KOH调pH至7.4。有钙液(mmol/L)：NaCl 126, KCl 5.4, MgCl2 0.8,CaCl2 1.0, NaH2PO4 0.33, HEPES(SIGMA公司) 10.0, 葡萄糖5.5, 用NaOH调pH至7.4。未注明试剂均为国产试剂。试剂配制见参考文献[3,4]。
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1.2 标本采集 心房标本取材于行心外科手术患者的右心耳。用10 ml氧饱和的无钙液在37℃保温下，于5～10 min内送到实验室。
1.3 人心房肌单个细胞的分离保存 标本在氧饱和无钙液中剪成1 mm3小块，用无钙液在磁力搅拌(2 Hz)下洗涤3次，洗除标本中的血液和钙离子。在磁力搅拌(2 Hz)并充氧条件下，用含有胶原酶(200 U/ml)、蛋白酶(2 U/ml)的无钙液中消化15 min后，换成含有胶原酶(200 U/ml)的无钙液进行第二步消化；5～10 min后，将组织块在KB液中轻轻吹打，使细胞松散脱离组织块；细胞悬液用200目滤网过滤，分离出的人心房单个细胞用KB液保存。实验过程温度始终保持在37℃。
1.4 复钙及显微镜观察 分离出的心房肌细胞，在KB液中保存30～60 min后，吹匀，经200目滤网过滤，1000 r/min离心5 min，弃上清，加有钙液5 ml吹匀后加入培养皿中，于倒置显微镜下观察。
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1.5 膜片钳技术记录钾电流 应用仪器为美国AXON公司生产的Axopatch 200B放大器，参照文献[2]方法进行。
1.6 活性鉴定 用4 g/L的台盼蓝1份、细胞悬液9份进行染色，3 min后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，算出活细胞百分比。参照文献[5]。
2 结果
采用两步酶消化分离法，分离出杆状、横纹清晰、细胞膜完整的具有典型特征的人心房肌细胞(图1)。经KB液保护30～60 min，复钙后，显微镜下观察一些细胞有收缩，完全贴壁后收缩消失，形态无明显变化。膜片钳记录到的钾电流如图2所示。在有钙液中保存24 h，细胞仍平滑、清洁度好、细胞膜完整(图3)。经台盼蓝染色，死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染(图4)，细胞成活率为30%～70%。
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图 1 分离出的典型人心房肌细胞
图 2 人心房肌细胞钾电流
图 3 有钙液保存24 h的活细胞
图 4 台盼蓝染色后的活细胞
3 讨论
对于心房肌整体 及单个细胞在生理及病理情况下生物学性状及改变的研究，以往多靠动物模型来完成[6,7] ，但动物心脏与人的心脏在大小、质量、生理学性状及病理学改变上存在差异,所以动物模型研究的结果不能直接应用到人体。直接在人的心房肌细胞上对某些疾病(如心房纤颤)发病机制及治疗方法的研究，其结果较可靠。国外学者采用改良的Bustamante方法成功分离人心房肌单个细胞。作者曾采用国外学者的分离方法，摸索分离50余例中国人心房肌单个细胞，均未取得成功。以后反复试验，将胶原酶及蛋白酶的浓度调整至国外文献方法的一半，并且缩短了消化时间，成功地分离出100余例患者的心房肌细胞。在此基础上,在消化过程中加用磁力搅拌,使得细胞分离过程缩短至20～25 min之间,使本方法更加快速实用。分离的单个人心房肌细胞经台盼蓝染色，细胞包膜完整，显微镜观察，细胞具有收缩功能，膜片钳试验证实了细胞的电生理活性。本方法的建立，为直接研究中国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学性状的改变提供了物质基础。
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参考文献：
[1] Bustamante JO, Watanbe T, Murphy DA， et al. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart[J]. Can Med Assoc,1982,126(7): 791.
[2] Xu WH, Li W, Wang XL, et al. Characteristics of transient outward K+ current in human atrial cardiomyocytes[J]. Acta Phamacologica Sinica, 1998, 19(5): 481.
[3] Escand D, Coulombe A, Danziger RS, et al. Two types of transient outward currents in adult human atrial cells[J]. Am J Physiol, 1987, 252(21): H142.
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[4] Feng JL, Wible B, Li GR, et al. Antisense oligodeoxynucleotides directed against Kv1.5 mRNA specifically inhibit ultrarapid delayed rectifier K+ current in cultured adult human atrial myocytes[J]. Circ Res,1997， 80(4): 572.
[5] 司徒镇强. 细胞培养[M]. 陕西：世界图书出版公司，1996.181～183.
[6] Wiffels MCEF, Kirchhof CJHJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats[J]. Circulation, 1995, 92(7): 1954.
[7] Lixia Y, Jianlin F, Rania G, et al. Ionic remodeling underlying action potential changes in a canine model of atrial fibrillation [J]. Circ Res,1997, 81(3): 512.
(收稿 1999-11-22 修回 2000-04-04), http://www.100md.com