大鼠细小动脉平滑肌细胞分离培养的新方法
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单位：
关键词：
中国临床解剖学杂志000338 【摘 要】 目的：探讨大鼠细小动脉平滑肌细胞分离培养的新方法。方法：取大鼠肺分支动脉，先切成小块进行胶原酶的消化，约8 h，而后用含20%小牛血清的DEME培养基贴块培养。结果：培养24 h，可见有大量细胞游出贴瓶底生长，72 h已融合成片，呈典型的“谷峰”样长势。尚有少量内皮细胞，通过消化传代除去。取传第三代细胞进行抗α-actin免疫组织化学染色，大量饮泡，基膜下有密斑，密体。免疫组化鉴定培养细胞纯度为96%。结论：应用消化贴块法培养的大鼠平滑肌细胞，方法简单，结果可靠，具有应用价值。
A new method to cultivate the smooth muscle cell of rat arteriole
, http://www.100md.com
Wang Guansong,Qian Guisheng,Li Shuping,et al.
Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400037
Objective:To investigate a new method to cultivate the smooth muscle cell of rat arteriole.Methods:The rat intra-pulmonary artery(RIPA)was separated carefully and cut into small pieces.After being treated by collagenase Ⅰ(0.2%) about 8 hours,those tissue pieces were cultivated in DEME culture medium with 20% calf serum.Results:It can be observed that great amount of cells had grown on the bottom after being cultivated 24 hours,and had developed into groups after cultivated 72 hours.The remained endoderm cells have been removed by digestion.After being stained by means of anti-α-actin immunohistochemistry,great amount of bubbles,dense dots and dense bodies can be observed beneath the cell membrane of the third generation cell.Identified by method of immunohistology,the purity of the cultivated cells is 96%.Conclusion:It is a simple and reliable method to cultivate rat muscle cells by digestion and adhesive cultivation.
, 百拇医药
Key words Smooth muscle cell Cell culture Rat
慢性缺氧肺动脉高压经多年研究，其机制已经探明，主要是肺细小动脉的中膜增厚，肌化。发生中膜增厚的原因尚不明确，系目前研究的重点。由于细小动脉平滑肌细胞难以培养，故国内外均以肺大动脉为对象进行研究[1，2]，有一定的局限和不足。本实验探讨大鼠肺细小动脉平滑肌细胞分离培养的方法。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 M199培养基(Gibco USA)，胶原酶Ⅰ型(sigma)，胰蛋白酶(进口分装)，其它试剂为国产AR级。
1.2 主要方法及操作步骤
1.2.1 取心肺组织 购自第三军医大学实验动物中心的Wistar大鼠6只(雌雄各半，体重200±18.25g)0.4%戊巴比妥钠麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织放入预先装 有无血清培养基的小培养皿内。
, http://www.100md.com
1.2.2 取肺细小动脉 小培养皿移入超净工作台，在手术显微镜或解剖显微镜直视下分离出肺动脉。用头小摄小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层，保留二、三级肺内动脉，在Hank′s液中浮洗3次。
1.2.3 消化 先用钟表镊撕成的小条，放入预先盛有2～3 mg 0.2%的胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃，振摆8 h (25次/min)。
1.2.4 贴块 待小块周边组织溶解后，1000rpm离心7 min。弃上清液，加入新鲜配制的20%M199培养液轻贴小块于培养瓶底，干涸1 h后再补加培养液放入37℃孵箱里静置培养。
1.2.5 传代 静置3 d后，贴壁的细胞呈伸展，部分区域已融合生长，培养基的颜色变黄，换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的纤维， 6～7 d后， 细胞长成单层和多层交错的致密细胞层， 即可传代。倾去原有液体，加入0.1%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合消化液浸泡30 s，镜下见细胞成片地收缩时，立即倾去消化液。最后加入10%M199培养液，用滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种，5 d后可再传代。
, 百拇医药
1.2.6 鉴定 采用鼠抗人α-actin免疫组织化学染色，进行透射电镜和倒置显微镜观察，并利用台盼蓝检查细胞活性。
2 结果
2.1 台盼蓝染色结果
共计1016个细胞，其中325个为阳性，约有96%以上的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。
2.2 细胞的光镜及电镜观察结果
光镜观察：未贴壁前细胞在光镜下呈长形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁。加入培养液后24h左右细胞开始贴壁生长。贴壁生长的细胞胞质透明，彼此融合在一起。细胞呈长梭形、放射性生长、成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重叠，部分区域呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的“峰”、“谷”状生长。
, http://www.100md.com
电镜观察：细胞呈不规则形态，胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝，大量饮泡，基膜下有密斑、胞内有密体，沿胞呈不规则形态，胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝，大量饮泡，基膜下有密斑、胞内有密体，沿胞核呈束集分布的微丝管、缺乏高尔基体(见图1)。
图1 电镜照片显示VSMC的肌丝、密斑、密体(×12，000)
2.3 肌动蛋白免疫组化染色
运用S-P法对动脉平滑肌细胞行肌动蛋白免疫组化染色，结果98%的细胞染色阳性。倒置显微镜下可见胞核外周呈棕黄色，胞质中有较多的条丝状物，即为肌动蛋白。表明培养细胞2～3次消化传代后细胞纯度较高(见图2)。
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图2 抗α-actin免疫组化染色显示VSMC中肌丝为棕黄色(S-P×400)
3 讨论
临床上长期慢性阻塞性肺病患者，由长期慢性缺氧，可造成肺细小动脉中层增厚，管腔狭窄以及肌型化，导致肺血管结构重组和改建。产生的肺循环阻力进行性而持久的增高，可形成肺动脉高压。国内外有人[2，3]对兔肺内小动脉的平滑肌细胞进行了培养，采用离心沉淀的方法，操作繁；而且由于细小动脉三层难分，仅采用沉淀的方法，也难以保证细胞的纯度，造成对操作技术要求较高；本文的实验对象是大鼠，技术难度增加，利用切碎，沉淀方法恐难以除去纤维层和内皮细胞。
消化贴块法的优点在于：①首先刮除了脂肪纤维层，采用胶原酶消化了组织块，对外膜和内膜的成纤维细胞及内皮细胞均可损害，有利于保证平滑肌细胞纯度；②由于酶的存在，松动了平滑肌细胞，使其游出贴壁的时间缩短，比单纯贴块法节约7～10 d；③操作简便，技术难度低。但取材要求较高，不十分经济(购置胶原酶)是其不足之处。此外，最后少量内皮细胞还要通过消化传代除去，才能保证平滑肌细胞较高的纯度。该方法可为肺、心、脑、肾的血管性疾病的发病机制的研究提供实验材料，有较好的实用价值[4]。
, 百拇医药
参考文献
1，Sarkar R,Gordon D,Stanley JC,et al.Cell cycle effects of nitric oxide on vascular smooth muscle cells.Am J Physiol,1997,272(4pt2):1810
2，胡德辉，刘惠君，马传桃.兔肺内小动脉平滑肌细胞培养.中国应用生理学杂志，1997，13(1)：80
3，Fischer-Dzogak.Ultrastractural and immunohistochemical studies of primary culture of arotic media cells.Exp mol Pathol,1973,18(1):162
4，王关嵩，杨晓静，钱桂生，等.血管舒依因子对缺氧时鼠平滑肌细胞增生的效应.中国病理生理杂志，1997，13(5)：542
(收稿：1999-06-28), 百拇医药
单位：
关键词：
中国临床解剖学杂志000338 【摘 要】 目的：探讨大鼠细小动脉平滑肌细胞分离培养的新方法。方法：取大鼠肺分支动脉，先切成小块进行胶原酶的消化，约8 h，而后用含20%小牛血清的DEME培养基贴块培养。结果：培养24 h，可见有大量细胞游出贴瓶底生长，72 h已融合成片，呈典型的“谷峰”样长势。尚有少量内皮细胞，通过消化传代除去。取传第三代细胞进行抗α-actin免疫组织化学染色，大量饮泡，基膜下有密斑，密体。免疫组化鉴定培养细胞纯度为96%。结论：应用消化贴块法培养的大鼠平滑肌细胞，方法简单，结果可靠，具有应用价值。
A new method to cultivate the smooth muscle cell of rat arteriole
, http://www.100md.com
Wang Guansong,Qian Guisheng,Li Shuping,et al.
Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400037
Objective:To investigate a new method to cultivate the smooth muscle cell of rat arteriole.Methods:The rat intra-pulmonary artery(RIPA)was separated carefully and cut into small pieces.After being treated by collagenase Ⅰ(0.2%) about 8 hours,those tissue pieces were cultivated in DEME culture medium with 20% calf serum.Results:It can be observed that great amount of cells had grown on the bottom after being cultivated 24 hours,and had developed into groups after cultivated 72 hours.The remained endoderm cells have been removed by digestion.After being stained by means of anti-α-actin immunohistochemistry,great amount of bubbles,dense dots and dense bodies can be observed beneath the cell membrane of the third generation cell.Identified by method of immunohistology,the purity of the cultivated cells is 96%.Conclusion:It is a simple and reliable method to cultivate rat muscle cells by digestion and adhesive cultivation.
, 百拇医药
Key words Smooth muscle cell Cell culture Rat
慢性缺氧肺动脉高压经多年研究，其机制已经探明，主要是肺细小动脉的中膜增厚，肌化。发生中膜增厚的原因尚不明确，系目前研究的重点。由于细小动脉平滑肌细胞难以培养，故国内外均以肺大动脉为对象进行研究[1，2]，有一定的局限和不足。本实验探讨大鼠肺细小动脉平滑肌细胞分离培养的方法。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 M199培养基(Gibco USA)，胶原酶Ⅰ型(sigma)，胰蛋白酶(进口分装)，其它试剂为国产AR级。
1.2 主要方法及操作步骤
1.2.1 取心肺组织 购自第三军医大学实验动物中心的Wistar大鼠6只(雌雄各半，体重200±18.25g)0.4%戊巴比妥钠麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织放入预先装 有无血清培养基的小培养皿内。
, http://www.100md.com
1.2.2 取肺细小动脉 小培养皿移入超净工作台，在手术显微镜或解剖显微镜直视下分离出肺动脉。用头小摄小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层，保留二、三级肺内动脉，在Hank′s液中浮洗3次。
1.2.3 消化 先用钟表镊撕成的小条，放入预先盛有2～3 mg 0.2%的胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃，振摆8 h (25次/min)。
1.2.4 贴块 待小块周边组织溶解后，1000rpm离心7 min。弃上清液，加入新鲜配制的20%M199培养液轻贴小块于培养瓶底，干涸1 h后再补加培养液放入37℃孵箱里静置培养。
1.2.5 传代 静置3 d后，贴壁的细胞呈伸展，部分区域已融合生长，培养基的颜色变黄，换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的纤维， 6～7 d后， 细胞长成单层和多层交错的致密细胞层， 即可传代。倾去原有液体，加入0.1%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合消化液浸泡30 s，镜下见细胞成片地收缩时，立即倾去消化液。最后加入10%M199培养液，用滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种，5 d后可再传代。
, 百拇医药
1.2.6 鉴定 采用鼠抗人α-actin免疫组织化学染色，进行透射电镜和倒置显微镜观察，并利用台盼蓝检查细胞活性。
2 结果
2.1 台盼蓝染色结果
共计1016个细胞，其中325个为阳性，约有96%以上的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。
2.2 细胞的光镜及电镜观察结果
光镜观察：未贴壁前细胞在光镜下呈长形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁。加入培养液后24h左右细胞开始贴壁生长。贴壁生长的细胞胞质透明，彼此融合在一起。细胞呈长梭形、放射性生长、成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重叠，部分区域呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的“峰”、“谷”状生长。
, http://www.100md.com
电镜观察：细胞呈不规则形态，胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝，大量饮泡，基膜下有密斑、胞内有密体，沿胞呈不规则形态，胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝，大量饮泡，基膜下有密斑、胞内有密体，沿胞核呈束集分布的微丝管、缺乏高尔基体(见图1)。
图1 电镜照片显示VSMC的肌丝、密斑、密体(×12，000)
2.3 肌动蛋白免疫组化染色
运用S-P法对动脉平滑肌细胞行肌动蛋白免疫组化染色，结果98%的细胞染色阳性。倒置显微镜下可见胞核外周呈棕黄色，胞质中有较多的条丝状物，即为肌动蛋白。表明培养细胞2～3次消化传代后细胞纯度较高(见图2)。
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图2 抗α-actin免疫组化染色显示VSMC中肌丝为棕黄色(S-P×400)
3 讨论
临床上长期慢性阻塞性肺病患者，由长期慢性缺氧，可造成肺细小动脉中层增厚，管腔狭窄以及肌型化，导致肺血管结构重组和改建。产生的肺循环阻力进行性而持久的增高，可形成肺动脉高压。国内外有人[2，3]对兔肺内小动脉的平滑肌细胞进行了培养，采用离心沉淀的方法，操作繁；而且由于细小动脉三层难分，仅采用沉淀的方法，也难以保证细胞的纯度，造成对操作技术要求较高；本文的实验对象是大鼠，技术难度增加，利用切碎，沉淀方法恐难以除去纤维层和内皮细胞。
消化贴块法的优点在于：①首先刮除了脂肪纤维层，采用胶原酶消化了组织块，对外膜和内膜的成纤维细胞及内皮细胞均可损害，有利于保证平滑肌细胞纯度；②由于酶的存在，松动了平滑肌细胞，使其游出贴壁的时间缩短，比单纯贴块法节约7～10 d；③操作简便，技术难度低。但取材要求较高，不十分经济(购置胶原酶)是其不足之处。此外，最后少量内皮细胞还要通过消化传代除去，才能保证平滑肌细胞较高的纯度。该方法可为肺、心、脑、肾的血管性疾病的发病机制的研究提供实验材料，有较好的实用价值[4]。
, 百拇医药
参考文献
1，Sarkar R,Gordon D,Stanley JC,et al.Cell cycle effects of nitric oxide on vascular smooth muscle cells.Am J Physiol,1997,272(4pt2):1810
2，胡德辉，刘惠君，马传桃.兔肺内小动脉平滑肌细胞培养.中国应用生理学杂志，1997，13(1)：80
3，Fischer-Dzogak.Ultrastractural and immunohistochemical studies of primary culture of arotic media cells.Exp mol Pathol,1973,18(1):162
4，王关嵩，杨晓静，钱桂生，等.血管舒依因子对缺氧时鼠平滑肌细胞增生的效应.中国病理生理杂志，1997，13(5)：542
(收稿：1999-06-28), 百拇医药