迷走神经刺激对红藻氨酸致癫痫大鼠海马及齿状回NMDAR1的影响
作者：田国红 黄远桂
单位：第四军医大学西京医院神经内科(710032)
关键词：迷走神经刺激；N-甲基-D-门冬氨酸受体；红藻氨酸；癫痫
中国临床神经科学/990105摘要 目的：利用红藻氨酸(kainate,KA)致大鼠复杂部分性发作模型，观察海马及齿状回等易损脑区N-甲基-D-门冬氨酸受体1亚单位(NMDAR1)的变化，以期进一步探明迷走神经刺激治疗癫的作用机制。方法：免疫细胞化学法。结果：正常大鼠NMDAR1阳性结构可见于海马各区及齿状回；KA给药后1h海马CA1、CA3、齿状回NMDAR1的密度开始增高；3h达高峰，以后逐渐下降，24h后基本恢复正常；预先给予左侧迷走神经电刺激治疗的大鼠相应脑区NMDAR1密度较KA致组明显降低，具有统计学差异。结论：迷走神经刺激抑制癫发作可能是通过降低易损脑区神经元NMDAR1活性而发挥作用的。
, 百拇医药
The Effect of Vagus Nerve Stimulation on NMDAR1
in Hippocampus of the Kainate Induced Epileptic Rat
Tian Guohong,Huang Yuangui
Department of Neurology,Xijing Hospital,The fourth Military Medical University,Xi′an 710032
Objective:Using the rat complex partial seizure model induced by kainate,we evaluated the distribution and density of N-methy1-D-aspartate receptor type Ⅰ(NMDAR1) in the vulnerable brain areas including hippocampus and dentate gyrus, and aimed to find out the antiepileptic mechanisms of vagus nerve stimulation (VNS).Methods:Using immunohistochemistry technique.Results:In normal rats,NMDAR11 immunoreactivity positive structures couldbe seen in hippocampla CA1、CA3 and dentate gyrus;1 h after KA injection,the density of NMDAR1 began to increase and got its maximun after 3h, then decreased gradually and after 24 h returned to the normal level.In the pre-stimulation group,the density of NMDAR1 in relevant brain regions decreased significantly.Conclusion:The antiepileptic function of VNS might be to reduce the NMDAR1 activity of neurons in vulnerable region.
, 百拇医药
Key Words Vagus nerve stimulation N-methyl-D-aspartate receptor Kainate epilepsy
癫痫是一类长期困扰着人们的神经系统常见病，因为发病机制不明，给临床治疗带来了许多不便。迷走神经刺激(vagus nerve stimulation,VNS)是近年来发展起来的一种新的非药物抗治疗，给许多患者，尤其是对抗癫药物有不良反应和临床上的难治性癫患者带来了新的希望，其疗效业已为临床医生所公认[1，2]。但是VNS作用的确切途径及机制尚不甚清楚，人们仅猜测VNS的抗是通过神经元网络系统介导对大脑皮层神经元活动起调节作用。以往诸多研究表明，兴奋性氨基酸(EAA)在癫痫的发作中起着非常重要的作用[3]。故本实验采用免疫细胞化学的方法，观察了VNS前后KA大鼠海马及齿状回区域兴奋性氨基酸受体的一种亚型NMDAR1的变化，以期为VNS抗理论机制的研究提供依据。
, 百拇医药
材料和方法
动物及分组：实验用成年雄性SD大鼠42只，体重200～250g，按实验目的随机分为3组，依次为KA注射组，VNS+KA组和对照组。每组14只大鼠，选取注射后30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，12 h，24 h共8个时间点，每个时间点各2只动物。
动物处理及材料制备：KA组动物ip KA(10 mg/kg)，制成癫
发作模型。VNS+KA组动物在乌拉坦(800 mg/kg,ip)麻醉下，手术分离暴露左侧迷走神经，用JL-B电生理刺激仪刺激，刺激条件：0.25 mA，50 Hz，每次30 s，间隔5 min，重复10次，然后ip KA,剂量同前。对照组大鼠ip等量生理盐水代替KA。
癫痫的发作以行为变化为主要指征，部分动物记录脑电图。
, 百拇医药
各组动物经存活时间后于不同时点，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，ip)麻醉，经升主动脉灌入100 ml生理盐水，并用500 ml含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液灌注固定。取脑后，置于上述固定液中固定4 h，然后移入30%蔗糖溶液4 ℃过夜。冰冻切片机冠状冻切，片厚40 μm，收集的切片分成两组，一组行NMDAR1免疫组化染色，另一组作为阴性对照。
免疫组化染色：切片首先人兔抗NMDAR1血清(1∶500，Sigma)室温孵育12～16 h；再入生物素化的羊抗兔IgG(1∶200,Vector)，室温孵育4 h；然后入ABC液(1∶100，Vector),室温2 h。最后行DAB呈色。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS彻底漂洗。切片经脱水透明，封片后，观察。
空白对照试验：用正常兔血清代替兔抗NMDAR1血清孵育切片，结果为阴性。
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结果处理与分析：每个时间点每只动物选取6张切片，利用Leica Q-500图像分析仪对海马各区及齿状回内NMDAR1阳性结构的密度进行测定，所得结果进行统计学处理。
结果
动物行为变化：KA ip的动物，给药后2 min出现点头、烦躁，20 min左右达高峰，继之站立肢体抽搐，湿水样摇动，跌倒，失平衡。1 h左右出现强直-阵挛抽搐。2 h以后症状减轻。预先给予VNS再注射KA组动物，表现相对安静，无明显肢体抽搐发生。
免疫组化结果：正常对照大鼠NMDAR1阳性结构可见于海马各区及齿状回，以CA1尤为明显。KA注射后1 h，海马CA1、CA3区及齿状回内NMDAR1的密度开始增高，3 h达高峰，以后逐渐降低，24 h时已基本恢复正常水平(见图1)。CA2区NMDAR1的密度在KA注射后各时间点未发现明显变化。VNS预先刺激组大鼠海马及齿状回内NMDAR1的密度与KA相应时间组相比明显降低(见图2)。
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图1 KA注射后不同时点海马CA1，CA3及齿状回NMDAR1密度
图2 VNS后注射KA3h与同时点单纯KA注射组NMDAR1密度的比较
讨论
早在本世纪30年代，就有文献报道VNS能够调节癫状态时大脑异常电活动。直到1988年Kiffin Penry首次将VNS用于临床，并取得了令人惊异的效果[4]。目前体内植入的电刺激仪已商品化，国内近期亦有文献报道关于VNS治疗顽固性癫的临床随访研究[5]，但其作用机制仍不甚清楚。有研究表明VNS能够增加刺激局部和全脑抑制性递质水平，从而抑制发作。我们也做了许多动物实验，特别是利用c-fos即刻早期基因的表达，对VNS的功能传导通路进行了研究，发现刺激大鼠左侧迷走神经在双侧的孤束核，外侧缰核，臂旁核等部位出现大量FOS标记阳性细胞，因此推测外周VNS抑通路可能为迷走神经→孤束核→海马或迷走神经→孤束核→外侧缰核→海马及齿状回。
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在本实验中我们采用KA致大鼠复杂部分性发作(CPS)的模型，观察到海马CA1，CA3及齿状回NMDAR1密度显著增高，而CA2区不明显，这些与以往形态学研究所证实的结果相吻合，经迷走神经刺激，上述易损脑区NMDAR1的活性明显降低，表明VNS对CPS发作具有抑制作用，而且这种抑制效应极有可能是通过下调NMDAR1活性发挥作用的。
许多研究已经证实EEA受体，特别是谷氨酸NMDA型受体与诸多神经系统疾病，尤其是癫关系极为密切，NMDAR的活性和调控紊乱是癫发作的病理生理基础[16]。NMDAR1是NMDAR最主要的亚单位，代表着NMDAR的活性，其过度兴奋可诱发大的兴奋性突触后电位，造成同步放电，最后致惊厥发作。局部注射兴奋性氨基酸亦通过激活NMDAR产生类似癫的脑部急慢性形态学改变。在颞叶癫患者海马切片中发现NMDAR活性是增高的。NMDAR的拮抗剂MK-801可明显抑制大鼠电点燃和后放电，以上表明NMDAR参与了癫灶的形成。
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NMDAR介导惊厥的细胞内机制主要是离子通道开放，Ca2+内流。Ca2+内流可产生一系列广泛的生物学效应，包括激活第二信使系统；作用于c-fos、c-jun等即刻早期基因；激活脑内NOS引起NO合成增加[7，8]。因此NMDAR的作用是复杂多样的，在迷走神经刺激抑制癫痫发作研究中，NMDAR活性降低发挥的抗作用并不排除抑制性递质释放增多和抑制性受体活性增强，也许是许多因素综合作用的结果，其具体的分子生物学机制尚待深入研究。
参考文献
[1].Uthman BM.Treatment of Epilepy by stimulation of the vague nerve.Neurology,1993,43:1338.
[2].Salinsky M.A randomized controlled trial of chronic vagus nerve stimulation for treatment of medically intractable seizures.Neurology,1995,45:224.
, 百拇医药
[3].Dingledine R.Mcbain CJ,Mcnamara JO.Excitatory amino acid receptors in epilepsy.TIPS,1990,11:334.
[4].Penry JK,Dean JC.Prevention of intractable partial seizures by intermitteut vagal stimulation in human:Prediminary results.Epilepsia,1990,32(S2):40.
[5].刘玉玺，李正中，鲍民生等.迷走神经刺激术治疗五例顽固癫及其随访研究.中华神经科学杂志，1997，30(2)：96.
[6].Mcdonald JW,Johnston MV.Physiological and Pathophysiological role of excitatory amino acid during central nervous system development.Brain Res Rev,1990,15:40.
, 百拇医药
[7].Przegalinski E,BaranL,SiwanowiczJ. The role of nitric oxide in the kainateinduced seizures in mice.Neurosci Lett,1994,170:74.
[8].Morgan JI,Curran T.Stimulus-transsciption coupling in the nervous system:involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Ann Rev Neurosci,1991,14:421.
(1998年7月16日收稿), http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院神经内科(710032)
关键词：迷走神经刺激；N-甲基-D-门冬氨酸受体；红藻氨酸；癫痫
中国临床神经科学/990105摘要 目的：利用红藻氨酸(kainate,KA)致大鼠复杂部分性发作模型，观察海马及齿状回等易损脑区N-甲基-D-门冬氨酸受体1亚单位(NMDAR1)的变化，以期进一步探明迷走神经刺激治疗癫的作用机制。方法：免疫细胞化学法。结果：正常大鼠NMDAR1阳性结构可见于海马各区及齿状回；KA给药后1h海马CA1、CA3、齿状回NMDAR1的密度开始增高；3h达高峰，以后逐渐下降，24h后基本恢复正常；预先给予左侧迷走神经电刺激治疗的大鼠相应脑区NMDAR1密度较KA致组明显降低，具有统计学差异。结论：迷走神经刺激抑制癫发作可能是通过降低易损脑区神经元NMDAR1活性而发挥作用的。
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The Effect of Vagus Nerve Stimulation on NMDAR1
in Hippocampus of the Kainate Induced Epileptic Rat
Tian Guohong,Huang Yuangui
Department of Neurology,Xijing Hospital,The fourth Military Medical University,Xi′an 710032
Objective:Using the rat complex partial seizure model induced by kainate,we evaluated the distribution and density of N-methy1-D-aspartate receptor type Ⅰ(NMDAR1) in the vulnerable brain areas including hippocampus and dentate gyrus, and aimed to find out the antiepileptic mechanisms of vagus nerve stimulation (VNS).Methods:Using immunohistochemistry technique.Results:In normal rats,NMDAR11 immunoreactivity positive structures couldbe seen in hippocampla CA1、CA3 and dentate gyrus;1 h after KA injection,the density of NMDAR1 began to increase and got its maximun after 3h, then decreased gradually and after 24 h returned to the normal level.In the pre-stimulation group,the density of NMDAR1 in relevant brain regions decreased significantly.Conclusion:The antiepileptic function of VNS might be to reduce the NMDAR1 activity of neurons in vulnerable region.
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Key Words Vagus nerve stimulation N-methyl-D-aspartate receptor Kainate epilepsy
癫痫是一类长期困扰着人们的神经系统常见病，因为发病机制不明，给临床治疗带来了许多不便。迷走神经刺激(vagus nerve stimulation,VNS)是近年来发展起来的一种新的非药物抗治疗，给许多患者，尤其是对抗癫药物有不良反应和临床上的难治性癫患者带来了新的希望，其疗效业已为临床医生所公认[1，2]。但是VNS作用的确切途径及机制尚不甚清楚，人们仅猜测VNS的抗是通过神经元网络系统介导对大脑皮层神经元活动起调节作用。以往诸多研究表明，兴奋性氨基酸(EAA)在癫痫的发作中起着非常重要的作用[3]。故本实验采用免疫细胞化学的方法，观察了VNS前后KA大鼠海马及齿状回区域兴奋性氨基酸受体的一种亚型NMDAR1的变化，以期为VNS抗理论机制的研究提供依据。
, 百拇医药
材料和方法
动物及分组：实验用成年雄性SD大鼠42只，体重200～250g，按实验目的随机分为3组，依次为KA注射组，VNS+KA组和对照组。每组14只大鼠，选取注射后30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，12 h，24 h共8个时间点，每个时间点各2只动物。
动物处理及材料制备：KA组动物ip KA(10 mg/kg)，制成癫
发作模型。VNS+KA组动物在乌拉坦(800 mg/kg,ip)麻醉下，手术分离暴露左侧迷走神经，用JL-B电生理刺激仪刺激，刺激条件：0.25 mA，50 Hz，每次30 s，间隔5 min，重复10次，然后ip KA,剂量同前。对照组大鼠ip等量生理盐水代替KA。癫痫的发作以行为变化为主要指征，部分动物记录脑电图。
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各组动物经存活时间后于不同时点，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，ip)麻醉，经升主动脉灌入100 ml生理盐水，并用500 ml含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液灌注固定。取脑后，置于上述固定液中固定4 h，然后移入30%蔗糖溶液4 ℃过夜。冰冻切片机冠状冻切，片厚40 μm，收集的切片分成两组，一组行NMDAR1免疫组化染色，另一组作为阴性对照。
免疫组化染色：切片首先人兔抗NMDAR1血清(1∶500，Sigma)室温孵育12～16 h；再入生物素化的羊抗兔IgG(1∶200,Vector)，室温孵育4 h；然后入ABC液(1∶100，Vector),室温2 h。最后行DAB呈色。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS彻底漂洗。切片经脱水透明，封片后，观察。
空白对照试验：用正常兔血清代替兔抗NMDAR1血清孵育切片，结果为阴性。
, 百拇医药
结果处理与分析：每个时间点每只动物选取6张切片，利用Leica Q-500图像分析仪对海马各区及齿状回内NMDAR1阳性结构的密度进行测定，所得结果进行统计学处理。
结果
动物行为变化：KA ip的动物，给药后2 min出现点头、烦躁，20 min左右达高峰，继之站立肢体抽搐，湿水样摇动，跌倒，失平衡。1 h左右出现强直-阵挛抽搐。2 h以后症状减轻。预先给予VNS再注射KA组动物，表现相对安静，无明显肢体抽搐发生。
免疫组化结果：正常对照大鼠NMDAR1阳性结构可见于海马各区及齿状回，以CA1尤为明显。KA注射后1 h，海马CA1、CA3区及齿状回内NMDAR1的密度开始增高，3 h达高峰，以后逐渐降低，24 h时已基本恢复正常水平(见图1)。CA2区NMDAR1的密度在KA注射后各时间点未发现明显变化。VNS预先刺激组大鼠海马及齿状回内NMDAR1的密度与KA相应时间组相比明显降低(见图2)。
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图1 KA注射后不同时点海马CA1，CA3及齿状回NMDAR1密度
图2 VNS后注射KA3h与同时点单纯KA注射组NMDAR1密度的比较
讨论
早在本世纪30年代，就有文献报道VNS能够调节癫状态时大脑异常电活动。直到1988年Kiffin Penry首次将VNS用于临床，并取得了令人惊异的效果[4]。目前体内植入的电刺激仪已商品化，国内近期亦有文献报道关于VNS治疗顽固性癫
的临床随访研究[5]，但其作用机制仍不甚清楚。有研究表明VNS能够增加刺激局部和全脑抑制性递质水平，从而抑制发作。我们也做了许多动物实验，特别是利用c-fos即刻早期基因的表达，对VNS的功能传导通路进行了研究，发现刺激大鼠左侧迷走神经在双侧的孤束核，外侧缰核，臂旁核等部位出现大量FOS标记阳性细胞，因此推测外周VNS抑通路可能为迷走神经→孤束核→海马或迷走神经→孤束核→外侧缰核→海马及齿状回。, 百拇医药
在本实验中我们采用KA致大鼠复杂部分性发作(CPS)的模型，观察到海马CA1，CA3及齿状回NMDAR1密度显著增高，而CA2区不明显，这些与以往形态学研究所证实的结果相吻合，经迷走神经刺激，上述易损脑区NMDAR1的活性明显降低，表明VNS对CPS发作具有抑制作用，而且这种抑制效应极有可能是通过下调NMDAR1活性发挥作用的。
许多研究已经证实EEA受体，特别是谷氨酸NMDA型受体与诸多神经系统疾病，尤其是癫关系极为密切，NMDAR的活性和调控紊乱是癫发作的病理生理基础[16]。NMDAR1是NMDAR最主要的亚单位，代表着NMDAR的活性，其过度兴奋可诱发大的兴奋性突触后电位，造成同步放电，最后致惊厥发作。局部注射兴奋性氨基酸亦通过激活NMDAR产生类似癫的脑部急慢性形态学改变。在颞叶癫患者海马切片中发现NMDAR活性是增高的。NMDAR的拮抗剂MK-801可明显抑制大鼠电点燃和后放电，以上表明NMDAR参与了癫灶的形成。
, 百拇医药
NMDAR介导惊厥的细胞内机制主要是离子通道开放，Ca2+内流。Ca2+内流可产生一系列广泛的生物学效应，包括激活第二信使系统；作用于c-fos、c-jun等即刻早期基因；激活脑内NOS引起NO合成增加[7，8]。因此NMDAR的作用是复杂多样的，在迷走神经刺激抑制癫痫发作研究中，NMDAR活性降低发挥的抗作用并不排除抑制性递质释放增多和抑制性受体活性增强，也许是许多因素综合作用的结果，其具体的分子生物学机制尚待深入研究。
参考文献
[1].Uthman BM.Treatment of Epilepy by stimulation of the vague nerve.Neurology,1993,43:1338.
[2].Salinsky M.A randomized controlled trial of chronic vagus nerve stimulation for treatment of medically intractable seizures.Neurology,1995,45:224.
, 百拇医药
[3].Dingledine R.Mcbain CJ,Mcnamara JO.Excitatory amino acid receptors in epilepsy.TIPS,1990,11:334.
[4].Penry JK,Dean JC.Prevention of intractable partial seizures by intermitteut vagal stimulation in human:Prediminary results.Epilepsia,1990,32(S2):40.
[5].刘玉玺，李正中，鲍民生等.迷走神经刺激术治疗五例顽固癫及其随访研究.中华神经科学杂志，1997，30(2)：96.
[6].Mcdonald JW,Johnston MV.Physiological and Pathophysiological role of excitatory amino acid during central nervous system development.Brain Res Rev,1990,15:40.
, 百拇医药
[7].Przegalinski E,BaranL,SiwanowiczJ. The role of nitric oxide in the kainateinduced seizures in mice.Neurosci Lett,1994,170:74.
[8].Morgan JI,Curran T.Stimulus-transsciption coupling in the nervous system:involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Ann Rev Neurosci,1991,14:421.
(1998年7月16日收稿), http://www.100md.com