百日咳菌液对大鼠培养脑切片兴奋性氨基酸释放的影响①
作者：尹 飞 杨于嘉 虞佩兰 毛定安
单位：(附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
关键词：百日咳杆菌；氨基酸；脑；切片；细胞；培养的；MK-801*；大鼠
湖南医科大学学报990605
提要 目的：了解百日咳菌液对培养的大鼠脑切片兴奋性氨基酸(EAAs)释放的影响及11双氢-5H-二苯(a,d)-环庚烯亚胺(MK-801)对脑切片有无保护作用。方法：SD大鼠随机分成正常脑切片培养组(NC组)，10%百日咳菌液脑切片培养组(PBC组)和MK-801预处理后10%百日咳菌液脑切片培养组(MPBC组)。用高效液相色谱法测脑切片培养上清液中的EAAs释放量。结果：PBC组的谷氨酸(Glu)、门冬氨酸(Asp)及乳酸脱氢酶(LDH)的释放量明显高于MPBC组及NC组。结论：百日咳菌液可使培养的脑切片组织EAAs和LDH的释放量增多；MK-801预处理可降低脑切片组织EAAs及LDH的释放量。提示MK-801对离体脑组织有保护作用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R725.1 R728.9 R73.351
Effect of pertussis bacilli on the release of excitatory amino
acids in brain slice of rats
Yin Fei Yang Yujia Yu Peilan, et al
(Department of Pediatrics, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Objective: To investigate the effect of pertussis bacilli on the release of excitatory amino acids(EAAs) in rat-brain slice and to know whether MK-801(dizocipine) protects brain tissue from excitotoxicity. Methods: SD rats were randomly divided into 3 groups: ①Normal slice cultured group(NC); ②10% pertussis bacilli(PB) slice cultured group(PBC); ③10% PB slice cultured group af ter pretreatment with MK-801. The release of EAAs from brain slices was measured by high performance liquid chromatography. Results: The concentrations of glut amate(Glu 29.53±8.00), aspartate(Asp 23.74±5.79) and LDH(38.03±8.45) were sig nificantly higher in PBC group than those(Glu 16.46±4.00, Asp 15.2 7±5.31, LDH 2 3.10±5.11) in MPBC group and (Glu 16.09±3.74, Asp 11.47±2.51, LDH 25.82±4.50) NC group. Conclusion: Pertussis bacilli may elicit a large increase of extrace llular EAAs and LDH in vitro, while MK-801 protects brain tissue from excitotoxicity.
, 百拇医药
Key words pertussis bacilli； amino acids; brain; slice; ce lls,cultured; MK-801*; rats
兴奋性氨基酸(EAAs)主要包括谷氨酸(Glu)和门冬氨酸(Asp)。目前EAAs与脑损伤关系的研究主要集中在缺血或创伤性脑损伤。EAAs与感染性脑水肿的关系研究较少。本研究室已证明大鼠百日咳菌液脑水肿时N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体活性上调，突触体内钙离子显著增高，11双氢-5H-二苯(a,d)-环庚烯亚胺(MK-801)能阻断NMDA受体调控的钙离子内流，减轻百日咳菌液所致脑水肿及迟发性脑损伤[1]。因此，笔者推测百日咳菌液可促使脑组织神经细胞释放大量的EAAs，通过激活NMDA受体而导致神经细胞损伤或死亡。本实验应用脑切片培养方法，了解百日咳菌液对脑切片EAAs释放的影响，并探讨MK-801预处理后对百日咳菌液导致的离体神经细胞损伤有无保护作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 SD大鼠脑切片培养随机分为3组，每组8只：①正常脑切片培养组(NC组)；②10%百日咳菌液脑切片培养组(PBC组)；③MK-801预处理后10%百日咳菌液脑切片培养组(MPBC组)。
1.2 正常脑切片标本的制备及培养 参照文献方法[2]稍加修改。实验动物采用10%水合氯醛麻醉后，冰台上断头处死大鼠后迅速取出其大脑，剥除脑膜，用0～4℃pH为7.4的Kreb's液洗二遍，双刃刀片将大脑组织切成厚约1mm的脑切片。将脑切片置于盛有Kreb’s液的培养皿内洗一次，然后将一片脑组织切片置入含用氧预先饱和了的2mlKreb's液的培养管内。37℃恒温水浴箱培养20min后，弃去Kreb's液，再加2mlKreb's液培养30min,以1000r*min-1速率离心2～3min。收集上清测EAAs和LDH。同时检测脑切片组织蛋白质的含量。培养全过程中，培养瓶内均通有95%O2和5%CO2的混合气体。
, 百拇医药
1.3 10%百日咳菌液脑切片培养 脑切片制作及培养方法同上。37℃培养20min，去Kreb's液，加含pH值为7.4的10%百日咳菌液(V/V)2ml的Kreb's液，培养30min；离心收集上清测LDH和EAAs含量。脑切片组织作蛋白质定量检测。
1.4 MK-801预处理后脑切片培养 脑切片37℃培养10min；去Kreb's液后，将其放入含MK-801100μmol的Kreb's液继续培养10min；去上清，再加2ml含10%百日咳菌液的Kreb's液培养30min，收集上清测LDH和EAAs。切片组织作蛋白质定量检测。
1.5 EAAs与LDH含量测定 高效液相色谱法测EAAs,7170型全自动生化仪上测定LDH含量。
1.6 统计学处理 全部测定数据均用
±s表示，统计学使用Excel5.0软件进行单因素方差分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 百日咳菌液及MK-801预处理后脑切片培养上清液中EAAs含量 于培养液中加入10%百日咳菌液后，PBC组脑切片培养上清液中EAAs含量显著高于NC组，其差异有高度显著性(P<0.01)；而经MK-801预处理后，MPBC组的EAAs含量明显低于PBC组，差异亦有高度显著性(P<0.01)。结果见附表。
2.2 各组脑切片培养上清液中LDH含量 培养液中加入10%百日咳菌液后，PBC组LDH释放量明显升高，与NC组相比差异有高度显著性(P<0.01)；MK-801预处理后，MPBC组培养液中的LDH释放量明显降低，与PBC组比 较差异亦有高度显著性(P<0.01)。结果见附表。
附表 脑切片培养上清液中EAAs(μmol.g-1)和LDH(U.g-1)含量① 分组
, 百拇医药
n
Glu(±s)
ASP(±s)
LDH(±s)
NC
8
16.09±3.74
11.47±2.51
25.82±4.50
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PBC
8
29.53±8.00②
23.74±5.79②
38.03±8.54 ②
MPBC
8
16.46±4.00③
15.27±5.31③
23.10±5.11③
, http://www.100md.com ①单位为大鼠脑切片组织中每克蛋白所含的EAAs和LDH含量；②与NC组比较 P<0.01；③与PBC组比较P<0.01
3 讨 论
自Lucas和Olney发现Glu可作为内源性兴奋性毒素损伤中枢神经细胞以来[3]，EAAs的神经毒性作用受到广泛重视。生理条件下，它们主要是作为兴奋性突触的神经递质。脑损伤或脑缺血后，神经细胞去极化，神经细胞和胶质细胞摄取EAAs机能下降或受损，使细胞外EAAs含量明显增高，通过与NMDA受体或非NMDA受体结合，造成神经元细胞损伤或坏死。目前认为兴奋性毒性机制可能有两方面：EAAs大量释放，导致神经细胞渗透性改变，同时激活相应受体，使K+外流，Cl-1，Na+及水内流，引起神经细胞急性肿胀；另一方面，EAAs可介导受体依赖性钙离子大量内流，使细胞内钙超载，从而引起一系列改变，导致神经细胞迟发性损害。目前，国内外主要利用脑缺血或脑创伤模型研究EAAs的神经毒性作用，发现EAAs与缺血性和创伤性脑损伤关系密切[4，5]。但EAAs与感染性脑损伤的关系报道较少。百日咳菌液能否使脑组织细胞EAAs释放增加未见报道。
, 百拇医药
本实验将百日咳菌液直接加入脑切片培养上清液中，然后检测其EAAs含量。结果显示，在培养液中加入10%百日咳菌液后，Glu和Asp含 量均较正常脑切片培养组明显增高(P<0.01 )。说明百日咳菌液可使脑组织释放大量的EAAs。LDH的检测快速、准确，故已被广泛用于评价兴奋性毒素对神经细胞的影响[6，7]。笔者利用LDH评价离体脑组织细胞的损伤程度，显示加入10%百日咳菌液后，脑切片培养液中的LDH释放量较正常对照组显著增多(P<0.01)。表明百日咳菌液可导致离体的脑组织细胞受损。在用百日咳菌液直接注入大鼠颈内动脉制成感染性脑水肿模型后，同样以高效液相色谱法测大鼠脑组织匀浆中的EAAs，发现在注菌后5minGlu和Asp开始增高，30min达高峰，与空白对照组和相应时间的 生理盐水组比较差异有高度显著性 (P<0.01)。提示百日咳菌液在体内外可促使脑组织细胞释放大量EAAs而损害神经细胞；EAAs的大量释放是感染性脑损害启动因素之一。
中枢神经系统细胞膜上广泛分布着EAAs受体。该受体主要有两类：一类称为离子型受体，包括NMDA及非NMDA受体；另一类称为代谢型受体。其中NMDA受体与脑损伤的关系受到广泛重视。竞争性拮抗剂系通过与受体结合的方式阻断受体产生作用，非竞争性拮抗剂则是通过与离子通道结合以阻断离子的流动。MK-801是公认的神经保护作用最强的非竞争性NMDA受体拮抗剂。本资料显示，MK-801预处理后，MPBC组脑切片培养液中的Glu和Asp含量明显减少，LDH的释放量亦显 著降低，与PBC组相比差异有高度显著性 (P<0.01)。表明MK-801通过阻断NMDA受体，降低脑组织细胞EAAs的释放量，对神经细胞有保护作用。据此证明EAAs的增高是感染性脑水肿脑损害的重要因素之一。提示在感染性脑水肿时，应及时采用有效措施，减少EAAs的释放；使用阻断NMDA受体药物将有助于减轻感染性脑水肿时的脑损害。故认为，本资料为感染性脑损害的临床治疗提出了一条新的思路。
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参 考 文 献
1 陈翔，杨于嘉，陈立华，等.N-甲基-D天门冬氨酸受体及其调控的 钙内流在大鼠感染性脑损伤的变化.中华儿科杂志，1997，35：539～541
2 韩喻美，李健勇，晏金平.黄芩甙对大鼠培养脑切片上谷氨酸递质释放的影响.江西医 学院学报，1995，35(3)：5～7
3 Greenamyre JT, Porter HP. Anatomy and physiology of glutamate in the CNS. Neu rology, 1994,44(Suppl 8):s7～s13
4 江涛，戴钦舜，刘恩重，等.脑缺血-再灌注损伤中兴奋性氨基酸的变化.中华神经外 科杂志，1997，13(4)：219～221
5 Faden AL, Demediuk P, Panter SS, et al. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in transmatic brain injury. Science, 1989,244:798～800
6 Kanthasamy AG, Matsumoto RR, Gunasekar PG, et al. Excitoprotective effect of felbamate in cultured cortical neurons. Brain Res, 1995,705:97～104
7 Cazevieille C, Safa R, Osborne NN. Melatonin protects primary cultures of rat cortical neurons from NMDA excitotoxicity and hypoxia/reoxygenation. Brain Res, 1997,768:120～124, http://www.100md.com
单位：(附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
关键词：百日咳杆菌；氨基酸；脑；切片；细胞；培养的；MK-801*；大鼠
湖南医科大学学报990605
提要 目的：了解百日咳菌液对培养的大鼠脑切片兴奋性氨基酸(EAAs)释放的影响及11双氢-5H-二苯(a,d)-环庚烯亚胺(MK-801)对脑切片有无保护作用。方法：SD大鼠随机分成正常脑切片培养组(NC组)，10%百日咳菌液脑切片培养组(PBC组)和MK-801预处理后10%百日咳菌液脑切片培养组(MPBC组)。用高效液相色谱法测脑切片培养上清液中的EAAs释放量。结果：PBC组的谷氨酸(Glu)、门冬氨酸(Asp)及乳酸脱氢酶(LDH)的释放量明显高于MPBC组及NC组。结论：百日咳菌液可使培养的脑切片组织EAAs和LDH的释放量增多；MK-801预处理可降低脑切片组织EAAs及LDH的释放量。提示MK-801对离体脑组织有保护作用。
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中国图书分类号 R725.1 R728.9 R73.351
Effect of pertussis bacilli on the release of excitatory amino
acids in brain slice of rats
Yin Fei Yang Yujia Yu Peilan, et al
(Department of Pediatrics, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Objective: To investigate the effect of pertussis bacilli on the release of excitatory amino acids(EAAs) in rat-brain slice and to know whether MK-801(dizocipine) protects brain tissue from excitotoxicity. Methods: SD rats were randomly divided into 3 groups: ①Normal slice cultured group(NC); ②10% pertussis bacilli(PB) slice cultured group(PBC); ③10% PB slice cultured group af ter pretreatment with MK-801. The release of EAAs from brain slices was measured by high performance liquid chromatography. Results: The concentrations of glut amate(Glu 29.53±8.00), aspartate(Asp 23.74±5.79) and LDH(38.03±8.45) were sig nificantly higher in PBC group than those(Glu 16.46±4.00, Asp 15.2 7±5.31, LDH 2 3.10±5.11) in MPBC group and (Glu 16.09±3.74, Asp 11.47±2.51, LDH 25.82±4.50) NC group. Conclusion: Pertussis bacilli may elicit a large increase of extrace llular EAAs and LDH in vitro, while MK-801 protects brain tissue from excitotoxicity.
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Key words pertussis bacilli； amino acids; brain; slice; ce lls,cultured; MK-801*; rats
兴奋性氨基酸(EAAs)主要包括谷氨酸(Glu)和门冬氨酸(Asp)。目前EAAs与脑损伤关系的研究主要集中在缺血或创伤性脑损伤。EAAs与感染性脑水肿的关系研究较少。本研究室已证明大鼠百日咳菌液脑水肿时N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体活性上调，突触体内钙离子显著增高，11双氢-5H-二苯(a,d)-环庚烯亚胺(MK-801)能阻断NMDA受体调控的钙离子内流，减轻百日咳菌液所致脑水肿及迟发性脑损伤[1]。因此，笔者推测百日咳菌液可促使脑组织神经细胞释放大量的EAAs，通过激活NMDA受体而导致神经细胞损伤或死亡。本实验应用脑切片培养方法，了解百日咳菌液对脑切片EAAs释放的影响，并探讨MK-801预处理后对百日咳菌液导致的离体神经细胞损伤有无保护作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 SD大鼠脑切片培养随机分为3组，每组8只：①正常脑切片培养组(NC组)；②10%百日咳菌液脑切片培养组(PBC组)；③MK-801预处理后10%百日咳菌液脑切片培养组(MPBC组)。
1.2 正常脑切片标本的制备及培养 参照文献方法[2]稍加修改。实验动物采用10%水合氯醛麻醉后，冰台上断头处死大鼠后迅速取出其大脑，剥除脑膜，用0～4℃pH为7.4的Kreb's液洗二遍，双刃刀片将大脑组织切成厚约1mm的脑切片。将脑切片置于盛有Kreb’s液的培养皿内洗一次，然后将一片脑组织切片置入含用氧预先饱和了的2mlKreb's液的培养管内。37℃恒温水浴箱培养20min后，弃去Kreb's液，再加2mlKreb's液培养30min,以1000r*min-1速率离心2～3min。收集上清测EAAs和LDH。同时检测脑切片组织蛋白质的含量。培养全过程中，培养瓶内均通有95%O2和5%CO2的混合气体。
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1.3 10%百日咳菌液脑切片培养 脑切片制作及培养方法同上。37℃培养20min，去Kreb's液，加含pH值为7.4的10%百日咳菌液(V/V)2ml的Kreb's液，培养30min；离心收集上清测LDH和EAAs含量。脑切片组织作蛋白质定量检测。
1.4 MK-801预处理后脑切片培养 脑切片37℃培养10min；去Kreb's液后，将其放入含MK-801100μmol的Kreb's液继续培养10min；去上清，再加2ml含10%百日咳菌液的Kreb's液培养30min，收集上清测LDH和EAAs。切片组织作蛋白质定量检测。
1.5 EAAs与LDH含量测定 高效液相色谱法测EAAs,7170型全自动生化仪上测定LDH含量。
1.6 统计学处理 全部测定数据均用
±s表示，统计学使用Excel5.0软件进行单因素方差分析。, 百拇医药
2 结 果
2.1 百日咳菌液及MK-801预处理后脑切片培养上清液中EAAs含量 于培养液中加入10%百日咳菌液后，PBC组脑切片培养上清液中EAAs含量显著高于NC组，其差异有高度显著性(P<0.01)；而经MK-801预处理后，MPBC组的EAAs含量明显低于PBC组，差异亦有高度显著性(P<0.01)。结果见附表。
2.2 各组脑切片培养上清液中LDH含量 培养液中加入10%百日咳菌液后，PBC组LDH释放量明显升高，与NC组相比差异有高度显著性(P<0.01)；MK-801预处理后，MPBC组培养液中的LDH释放量明显降低，与PBC组比 较差异亦有高度显著性(P<0.01)。结果见附表。
附表 脑切片培养上清液中EAAs(μmol.g-1)和LDH(U.g-1)含量① 分组
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n
Glu(
±s)ASP(
±s)LDH(
±s)NC
8
16.09±3.74
11.47±2.51
25.82±4.50
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PBC
8
29.53±8.00②
23.74±5.79②
38.03±8.54 ②
MPBC
8
16.46±4.00③
15.27±5.31③
23.10±5.11③
, http://www.100md.com ①单位为大鼠脑切片组织中每克蛋白所含的EAAs和LDH含量；②与NC组比较 P<0.01；③与PBC组比较P<0.01
3 讨 论
自Lucas和Olney发现Glu可作为内源性兴奋性毒素损伤中枢神经细胞以来[3]，EAAs的神经毒性作用受到广泛重视。生理条件下，它们主要是作为兴奋性突触的神经递质。脑损伤或脑缺血后，神经细胞去极化，神经细胞和胶质细胞摄取EAAs机能下降或受损，使细胞外EAAs含量明显增高，通过与NMDA受体或非NMDA受体结合，造成神经元细胞损伤或坏死。目前认为兴奋性毒性机制可能有两方面：EAAs大量释放，导致神经细胞渗透性改变，同时激活相应受体，使K+外流，Cl-1，Na+及水内流，引起神经细胞急性肿胀；另一方面，EAAs可介导受体依赖性钙离子大量内流，使细胞内钙超载，从而引起一系列改变，导致神经细胞迟发性损害。目前，国内外主要利用脑缺血或脑创伤模型研究EAAs的神经毒性作用，发现EAAs与缺血性和创伤性脑损伤关系密切[4，5]。但EAAs与感染性脑损伤的关系报道较少。百日咳菌液能否使脑组织细胞EAAs释放增加未见报道。
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本实验将百日咳菌液直接加入脑切片培养上清液中，然后检测其EAAs含量。结果显示，在培养液中加入10%百日咳菌液后，Glu和Asp含 量均较正常脑切片培养组明显增高(P<0.01 )。说明百日咳菌液可使脑组织释放大量的EAAs。LDH的检测快速、准确，故已被广泛用于评价兴奋性毒素对神经细胞的影响[6，7]。笔者利用LDH评价离体脑组织细胞的损伤程度，显示加入10%百日咳菌液后，脑切片培养液中的LDH释放量较正常对照组显著增多(P<0.01)。表明百日咳菌液可导致离体的脑组织细胞受损。在用百日咳菌液直接注入大鼠颈内动脉制成感染性脑水肿模型后，同样以高效液相色谱法测大鼠脑组织匀浆中的EAAs，发现在注菌后5minGlu和Asp开始增高，30min达高峰，与空白对照组和相应时间的 生理盐水组比较差异有高度显著性 (P<0.01)。提示百日咳菌液在体内外可促使脑组织细胞释放大量EAAs而损害神经细胞；EAAs的大量释放是感染性脑损害启动因素之一。
中枢神经系统细胞膜上广泛分布着EAAs受体。该受体主要有两类：一类称为离子型受体，包括NMDA及非NMDA受体；另一类称为代谢型受体。其中NMDA受体与脑损伤的关系受到广泛重视。竞争性拮抗剂系通过与受体结合的方式阻断受体产生作用，非竞争性拮抗剂则是通过与离子通道结合以阻断离子的流动。MK-801是公认的神经保护作用最强的非竞争性NMDA受体拮抗剂。本资料显示，MK-801预处理后，MPBC组脑切片培养液中的Glu和Asp含量明显减少，LDH的释放量亦显 著降低，与PBC组相比差异有高度显著性 (P<0.01)。表明MK-801通过阻断NMDA受体，降低脑组织细胞EAAs的释放量，对神经细胞有保护作用。据此证明EAAs的增高是感染性脑水肿脑损害的重要因素之一。提示在感染性脑水肿时，应及时采用有效措施，减少EAAs的释放；使用阻断NMDA受体药物将有助于减轻感染性脑水肿时的脑损害。故认为，本资料为感染性脑损害的临床治疗提出了一条新的思路。
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1 陈翔，杨于嘉，陈立华，等.N-甲基-D天门冬氨酸受体及其调控的 钙内流在大鼠感染性脑损伤的变化.中华儿科杂志，1997，35：539～541
2 韩喻美，李健勇，晏金平.黄芩甙对大鼠培养脑切片上谷氨酸递质释放的影响.江西医 学院学报，1995，35(3)：5～7
3 Greenamyre JT, Porter HP. Anatomy and physiology of glutamate in the CNS. Neu rology, 1994,44(Suppl 8):s7～s13
4 江涛，戴钦舜，刘恩重，等.脑缺血-再灌注损伤中兴奋性氨基酸的变化.中华神经外 科杂志，1997，13(4)：219～221
5 Faden AL, Demediuk P, Panter SS, et al. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in transmatic brain injury. Science, 1989,244:798～800
6 Kanthasamy AG, Matsumoto RR, Gunasekar PG, et al. Excitoprotective effect of felbamate in cultured cortical neurons. Brain Res, 1995,705:97～104
7 Cazevieille C, Safa R, Osborne NN. Melatonin protects primary cultures of rat cortical neurons from NMDA excitotoxicity and hypoxia/reoxygenation. Brain Res, 1997,768:120～124, http://www.100md.com