苦参碱对HepG2细胞系增殖能力的影响
作者：司维柯 张广运 马立强 康格非
单位：司维柯(第三军医大学医学检验系临床检验学教研室)；张广运(核医学教研室)；马立强(医学检验系95级本科生，重庆 400038)；康格非(重庆医科大学临床生物化学教研室，重庆 400046)
关键词：苦参碱；肝癌细胞；增殖
第三军医大学学报000537 中图法分类号： R282.07 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)05-0451-01
Effect of Matrine on the proliferation of HepG2 cell line
苦参是传统中药，广泛应用于临床各科，特别是它的抗肿瘤活性，近年来受到极大关注，我们曾发现苦参提取液可诱导K562细胞向红系和粒系分化[1，2]。研究发现苦参纯成份——苦参碱(Matrine)是抗肿瘤的活性成份[3]。我们以人肝癌细胞株HepG2作为细胞模型，观察不同浓度苦参碱作用不同时间后，对该细胞增殖能力的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 药物及主要试剂
苦参碱注射液(商品名：斯巴德康)10 g/L,5 ml/支，购自广州明兴制药厂，批号980304。RPMI-1640培养基和胰酶均为GIBCO产品，MTT为Serva产品。H3-TdR购自上海原子能究所。
1.2 细胞株及其培养
HepG2细胞株，由重庆医科大学附二院肝炎研究所提供，并在含10%小牛血清的RPMI 1640培养中，37°C，5%CO2条件下培养。
1.3 MTT试验
4.6×105个/ml的细胞悬液接种于96孔培养板中(100 μl/孔)，加入苦参碱注射液(10g/L)，使终浓度为0.5、1.5、2.0 g/L，加RPMI-1640培养液，补足体积为200 μl。另设空白孔和对照孔，每浓度均作3个平行孔，混匀后放入CO2孵箱中培养。分别于1、2、3、4 d各取出一板，弃去上清液，加培养液100 μl，MTT液(5 mg/ml PBS液)10 μl，于微量振荡器上振摇2 min，放入CO2孵箱中培养4 h，弃上清液，加二甲亚砜100 μl/孔，振摇5 min，于酶标仪上，人为600 nm下，空白调零，测得Dλ值，计算出细胞存活率%=D实验/D对照×100%。
, 百拇医药
同上操作，将(0.5～1)×105个/ml的细胞悬液接种于96孔培养板中使苦参碱终浓度为0.05～2.5 g/L，培养3 d，测Dλ值，计算出细胞存活率。
1.4 3H-TdR掺入法
加样方法同上，并使苦参碱终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 g/L，培养2d后，加入3H-TdR(1.25 μCi/孔)，振荡混匀，继续培养24 h，弃去上清液，加0.25%胰酶消化，吸去胰酶，加培养液100 μl，用微量吸管小心吹打并不时在倒置显微镜下检查，至制成细胞悬液，用多头细胞收集仪将细胞抽滤于49型纤维滤膜上，37°C烘干，加入固相闪烁液，脉冲计数仪测定Bq，计算细胞DNA合成率(%)=Bq实验/Bq对照×100%。
1.5 细胞计数
, http://www.100md.com
在培养瓶中加样，加(0.2～1)×105个/ml细胞悬液2 ml/瓶，加苦参碱使终浓度为0.5、0.8、1.0、1.5 g/L，并加培养液至总体积4.0 ml。共培养4 d，每天取出一瓶，胰酶消化，制成细胞悬液，在改良Neubauor型计数板上计数细胞，每浓度计数3次，取平均结果。
2 结果
2.1 MTT试验
2.1.1苦参碱作用时间与肝癌细胞存活率的关系 苦参碱在0.5、1.0、1.5、2.0 g/L作用细1～4d，随作用时间延长，细胞存活率降低，到第4天，除0.5 g/L外，其余浓度下的细胞存活率均<50%。
2.1.2 苦参碱剂量与肝癌细胞的关系 苦参碱对肝癌细胞的抑制，分为几个浓度段：≤0.2 g/L时，存活率≥80%；0.3～0.6 g/L，存活率>50%；0.7～0.8 g/L，存活率<50%，>30%；1.0～2.5 g/L，存活率<30%。按抗肿瘤药物判断标准，苦参碱>1.0 g/L，为抗肝癌细胞敏感的药物浓度。0.7～0.8 g/L为中度敏感，<0.6 g/L为不敏感，<0.2 g/L几乎无抑制作用。
, 百拇医药
2.2 苦参碱对肝癌细胞DNA合成的抑制
在MTT试验的基础上，确定以0.5、1.0、1.5、2.0 g/L浓度作用细胞3d，观察DNA合成情。结果：随药物浓度增加，DNA合成降低，大于1.0 g/L时，DNA合成率小于30%，表明苦参可抑制肝癌细胞DNA的合成，并有剂量依赖性。
2.3 苦参碱对肝癌细胞生长曲线的影响
苦参碱在0.3、0.5、0.8、1.5 g/L作用细胞1～4d，细胞总数逐渐减少，说明苦参碱可抑制肝癌细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性。
3 讨论
本结果表明苦参碱在一定浓度范围能有效抑制肝癌细胞的增殖，并且抑制作用有时间、剂量依赖性。其中>1.0 g/L为有效抑制浓度，<0.2 g/L抑制作用很小。我们也研究了苦参碱作用于肝癌细胞HepG2后其形态和超微结构的变化(见另篇报道)，发现苦参碱浓度≥0.3 g/L时细胞形态开始出现明显变化，特别是细胞浆内充满圆形、透明、折光强的颗粒，苏丹Ⅲ染色阳性。电镜观察发现，细胞浆内有脂肪空泡和扩张的滑面内质网。胞浆有部分溶解并出现自噬体。细胞表面微绒毛减少，所有这些均说明苦参碱对HepG2细胞有细胞毒作用，从而干扰细胞代谢，抑制细胞增殖。
, 百拇医药
作者简介：司维柯(1958-)，女，山西省晋城市人，博士研究生，讲师，主要从事肿瘤细胞的发生、发展和消亡方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68752310
参考文献：
[1] 司维柯，韩 风，秦建平，等.苦参提取液诱导K562细胞分化的细胞化学观察[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1997，6(2)：200-205.
[2] 秦建平，蒋纪恺，张 彦，等.苦参对K562红白血病细胞系的诱导分化作用[J].重庆医科大学学报，1994，19(2)：151.
[3] Zhang Y, Jiang J K, Liu X S, et al. Differentiation and Apoptosis in K562 Erythroleukemia cells Induced by Matrine[J]. Natural Medicine,1998,52(4):295-299.
收稿日期：1999-07-09；修回日期：2000-01-07, 百拇医药
单位：司维柯(第三军医大学医学检验系临床检验学教研室)；张广运(核医学教研室)；马立强(医学检验系95级本科生，重庆 400038)；康格非(重庆医科大学临床生物化学教研室，重庆 400046)
关键词：苦参碱；肝癌细胞；增殖
第三军医大学学报000537 中图法分类号： R282.07 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)05-0451-01
Effect of Matrine on the proliferation of HepG2 cell line
苦参是传统中药，广泛应用于临床各科，特别是它的抗肿瘤活性，近年来受到极大关注，我们曾发现苦参提取液可诱导K562细胞向红系和粒系分化[1，2]。研究发现苦参纯成份——苦参碱(Matrine)是抗肿瘤的活性成份[3]。我们以人肝癌细胞株HepG2作为细胞模型，观察不同浓度苦参碱作用不同时间后，对该细胞增殖能力的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 药物及主要试剂
苦参碱注射液(商品名：斯巴德康)10 g/L,5 ml/支，购自广州明兴制药厂，批号980304。RPMI-1640培养基和胰酶均为GIBCO产品，MTT为Serva产品。H3-TdR购自上海原子能究所。
1.2 细胞株及其培养
HepG2细胞株，由重庆医科大学附二院肝炎研究所提供，并在含10%小牛血清的RPMI 1640培养中，37°C，5%CO2条件下培养。
1.3 MTT试验
4.6×105个/ml的细胞悬液接种于96孔培养板中(100 μl/孔)，加入苦参碱注射液(10g/L)，使终浓度为0.5、1.5、2.0 g/L，加RPMI-1640培养液，补足体积为200 μl。另设空白孔和对照孔，每浓度均作3个平行孔，混匀后放入CO2孵箱中培养。分别于1、2、3、4 d各取出一板，弃去上清液，加培养液100 μl，MTT液(5 mg/ml PBS液)10 μl，于微量振荡器上振摇2 min，放入CO2孵箱中培养4 h，弃上清液，加二甲亚砜100 μl/孔，振摇5 min，于酶标仪上，人为600 nm下，空白调零，测得Dλ值，计算出细胞存活率%=D实验/D对照×100%。
, 百拇医药
同上操作，将(0.5～1)×105个/ml的细胞悬液接种于96孔培养板中使苦参碱终浓度为0.05～2.5 g/L，培养3 d，测Dλ值，计算出细胞存活率。
1.4 3H-TdR掺入法
加样方法同上，并使苦参碱终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 g/L，培养2d后，加入3H-TdR(1.25 μCi/孔)，振荡混匀，继续培养24 h，弃去上清液，加0.25%胰酶消化，吸去胰酶，加培养液100 μl，用微量吸管小心吹打并不时在倒置显微镜下检查，至制成细胞悬液，用多头细胞收集仪将细胞抽滤于49型纤维滤膜上，37°C烘干，加入固相闪烁液，脉冲计数仪测定Bq，计算细胞DNA合成率(%)=Bq实验/Bq对照×100%。
1.5 细胞计数
, http://www.100md.com
在培养瓶中加样，加(0.2～1)×105个/ml细胞悬液2 ml/瓶，加苦参碱使终浓度为0.5、0.8、1.0、1.5 g/L，并加培养液至总体积4.0 ml。共培养4 d，每天取出一瓶，胰酶消化，制成细胞悬液，在改良Neubauor型计数板上计数细胞，每浓度计数3次，取平均结果。
2 结果
2.1 MTT试验
2.1.1苦参碱作用时间与肝癌细胞存活率的关系 苦参碱在0.5、1.0、1.5、2.0 g/L作用细1～4d，随作用时间延长，细胞存活率降低，到第4天，除0.5 g/L外，其余浓度下的细胞存活率均<50%。
2.1.2 苦参碱剂量与肝癌细胞的关系 苦参碱对肝癌细胞的抑制，分为几个浓度段：≤0.2 g/L时，存活率≥80%；0.3～0.6 g/L，存活率>50%；0.7～0.8 g/L，存活率<50%，>30%；1.0～2.5 g/L，存活率<30%。按抗肿瘤药物判断标准，苦参碱>1.0 g/L，为抗肝癌细胞敏感的药物浓度。0.7～0.8 g/L为中度敏感，<0.6 g/L为不敏感，<0.2 g/L几乎无抑制作用。
, 百拇医药
2.2 苦参碱对肝癌细胞DNA合成的抑制
在MTT试验的基础上，确定以0.5、1.0、1.5、2.0 g/L浓度作用细胞3d，观察DNA合成情。结果：随药物浓度增加，DNA合成降低，大于1.0 g/L时，DNA合成率小于30%，表明苦参可抑制肝癌细胞DNA的合成，并有剂量依赖性。
2.3 苦参碱对肝癌细胞生长曲线的影响
苦参碱在0.3、0.5、0.8、1.5 g/L作用细胞1～4d，细胞总数逐渐减少，说明苦参碱可抑制肝癌细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性。
3 讨论
本结果表明苦参碱在一定浓度范围能有效抑制肝癌细胞的增殖，并且抑制作用有时间、剂量依赖性。其中>1.0 g/L为有效抑制浓度，<0.2 g/L抑制作用很小。我们也研究了苦参碱作用于肝癌细胞HepG2后其形态和超微结构的变化(见另篇报道)，发现苦参碱浓度≥0.3 g/L时细胞形态开始出现明显变化，特别是细胞浆内充满圆形、透明、折光强的颗粒，苏丹Ⅲ染色阳性。电镜观察发现，细胞浆内有脂肪空泡和扩张的滑面内质网。胞浆有部分溶解并出现自噬体。细胞表面微绒毛减少，所有这些均说明苦参碱对HepG2细胞有细胞毒作用，从而干扰细胞代谢，抑制细胞增殖。
, 百拇医药
作者简介：司维柯(1958-)，女，山西省晋城市人，博士研究生，讲师，主要从事肿瘤细胞的发生、发展和消亡方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68752310
参考文献：
[1] 司维柯，韩 风，秦建平，等.苦参提取液诱导K562细胞分化的细胞化学观察[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1997，6(2)：200-205.
[2] 秦建平，蒋纪恺，张 彦，等.苦参对K562红白血病细胞系的诱导分化作用[J].重庆医科大学学报，1994，19(2)：151.
[3] Zhang Y, Jiang J K, Liu X S, et al. Differentiation and Apoptosis in K562 Erythroleukemia cells Induced by Matrine[J]. Natural Medicine,1998,52(4):295-299.
收稿日期：1999-07-09；修回日期：2000-01-07, 百拇医药