肾小管间质纤维化中成纤维细胞的转化生长因子β1及其Ⅰ型受体蛋白及基因表达检测
作者：孙锁柱 徐曼 邹万忠
单位：孙锁柱(孙锁柱现在解放军第二炮兵总医院病理科 100088)；徐曼 邹万忠(北京医科大学病理学系 100083)
关键词：肾小管间质纤维化；成纤维细胞；转化生长因子β1；受体，转化生长因子β1 Ⅰ 型；大鼠；疾病模型，动物
临床与实验病理学杂志000215 摘要 目的：研究腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化模型的肾组织成纤维细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体的表达。方法：腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾小管间质纤维化模型，由模型肾组织培养肾间质成纤维细胞，应用免疫组化、逆转录PCR分别检测TGF-β1及其Ⅰ型受体蛋白及mRNA的表达。结果：成纤维细胞TGF-β1、TGF-β1 I 型受体免疫组化阳性；逆转录PCR可见294bp的TGF-β1及345bp的TGF-β1的Ⅰ型受体mRNA特异扩增带。结论：在肾小管间质纤维化进程中，肾间质成纤维细胞是TGF-β1的一个来源，而且也是其效应细胞，从而在TGF-β1的作用下出现增生和合成细胞外基质的效应。
, 百拇医药
中图分类号 R692.33 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(2000)02-0134-03
Detection of TGF-β1 and its type Ⅰ receptor in fibroblasts in tubulointerstitial fibrosis
Sun Suozhu, Xu Man, Zou Wanzhong
(Dept of Pathol, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Purpose To investigate the expression of TGF-β1 and it's type I receptor in fibroblasts in the renal tubulointerstitial fibrosis animal model. Methods The tubulointerstitial fibrosis model was established in Wistar rats by gastroperfusion of excessive adenine,and then to culture the renal interstitial fibroblasts. The expressions of protein and mRNA for TGF-β1 and it's type I receptor were examined utilizing immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results Immunohistochemistry showed positivity of TGF-β1 and it's type I receptor in fibroblasts. The 294bp and 345bp special RT-PCR productions for TGF-β1 and it's type Ⅰ receptor mRNA can also be detected in the cultured fibroblasts. Conclusion Fibroblast is a origin and effective cell for TGF-β1 in tubulointerstitial fibrosis.
, 百拇医药
KEY WORDS tubulointerstitial fibrosis；fibroblasts；transforming growth factor β1；receptors,transforming growth factor β1 type Ⅰ rats; disease models, animal
肾小管萎缩和消失、肾间质淋巴和单核细胞浸润及纤维组织增生称为肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis)，是各种慢性肾损伤的病理表现。肾间质成纤维细胞是肾间质中细胞外基质的主要形成细胞。肾间质纤维化进程中，在多种细胞因子作用下，该细胞增生，细胞外基质合成增加〔1〕。其中TGF-β1在促成纤维细胞增生和细胞外基质形成中有重要作用〔2〕。本文在建立腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化实验模型的基础上，以模型肾组织作供体，成功培养了肾间质成纤维细胞，进而检测该细胞TGF-β1及其Ⅰ型受体基因表达及蛋白合成。
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1 材料与方法
1.1 大鼠肾小管间质纤维化模型的建立 Wistar大鼠，雌性，150～180 g(北京医科大学实验动物部提供)，腺嘌呤加入2%淀粉溶液，加热制成腺嘌呤淀粉混悬液，每日0.3 mg/g体重剂量灌胃1次，连续5周。对照组以等体积2%淀粉溶液灌胃。
1.2 肾小管间质纤维化肾组织成纤维细胞培养 取模型5周的肾髓质，超净台内剪成l mm3的碎块，0.25%胰蛋白酶略消化，Hanks液洗，培养于含20%小牛血清的DMEM培养基中。原代培养7天，传代继续培养，取生长状态良好的二代细胞，分别经透射电镜、免疫组化(keratin、vimentin、collagen Ⅲ)及含右旋缬氨酸的MEM培养基，替代培养鉴定，证实为成纤维细胞。
1.3 成纤维细胞的免疫组化观察 常规制备培养的成纤维细胞爬片，以兔抗人TGF-β1抗血清和兔抗人TGF-β1 Ⅰ型受体的抗血清(Santa Cruz公司产品)作一抗，以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。ABC法检测TGF-β1及其I型受体。爬片经DAB显色, 成纤维细胞胞浆内棕褐色颗粒为阳性。
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1.4 逆转录PCR 异硫氰酸胍一步法提取培养的成纤维细胞RNA，在逆转录酶AMV催化下合成cDNA,以适量cDNA作模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增，所用引物序列根据文献〔3，4〕，由本系合成。TGF-β1引物：sense：5GGACTACTA-CGCCAAAGAAG 3； Antisense：5TCAAAAGACA-GCCACTCAGG 3(nt715-1008)。TGF-β1 Ⅰ型受体引物sense 5GCTTAGACACGACAACATCC 3； antisense：5CCAATGTCCAGGTAATCGCT 3(nt753-1097)。其中，TGF-β1 PCR扩增退火温度为55℃，30个循环；特异扩增片段294bp，TGF-β1 Ⅰ型受体PCR扩增退火温度为60℃，35个循环；特异扩增片段345bp。
2 结果
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2.1 腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化病变特征 给药3天始，腺嘌呤代谢产物，2，8-二羟基腺嘌呤结晶沉积于肾小管，受累小管变性坏死,间质内可见中性粒细胞为主的炎细胞浸润；给药1～2周，受累小管不断增多，间质中性粒细胞渐少，淋巴细胞和单核细胞逐渐增多；给药3～5周，各级肾小管弥漫扩张，上皮萎缩，间质弥漫淋巴单核细胞浸润，成纤维细胞增生，细胞外基质大量形成，出现肾小管间质纤维化(图1)。其中，给药3～5周时，2，8-二羟基腺嘌呤结晶周围形成以单核巨噬样细胞增生为特征的肉芽肿性病变，该细胞圆形或椭圆形，胞浆丰富淡染，细胞间界限不清，核圆形，大而浅染，核仁清晰。
图1 模型5周，大鼠肾小管间质纤维化。PAS染色×100
2.2 肾小管间质纤维化的肾间质成纤维细胞的生长及表型特征 模型肾髓质原代培样3天，梭形细胞自组织周围爬出，细胞不断分裂增生，渐成编织样排列，细胞传代后，继续分裂增殖，细胞呈梭型、纺锤型。电镜下，该细胞胞浆富含内质网，免疫组化keratin阴性，vimentin、collagen Ⅲ阳性(图2a，2b)。在含有右旋缬氨酸的MEM培养基中培养至第10天，由于成纤维细胞不能利用右旋缬氨酸，致使细胞大量死亡，这是成纤维细胞的一个重要的生物学特点，证明培养的细胞确为成纤维细胞。
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图2 a.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色vimentin阳性信号(↑)。ABC×200；b.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色collagenⅢ阳性信号(↑)。ABC×200
2.3 成纤维细胞TGF-β1、TGF-β1 Ⅰ型受体蛋白及基因表达 成纤维细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1、TGF-β1 Ⅰ型受体阳性信号(图3a，3b)。逆转录PCR可见294bp的TGF-β1及345bp的TGFβ1 Ⅰ型受体mRNA特异扩增带(图4a，4b)。
图3 a.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1阳性信号(↑)。ABC×200；b.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1 Ⅰ型受体阳性信号(↑)。ABC×200
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图4 RT-PCR
a：1.TGF-β1，2.标准分子量DNA；
b：1.TGF-β1 Ⅰ型受体，2.标准分子量DNA
3 讨论
肾间质成纤维细胞是肾小管间质纤维化中参与细胞外基质形成的主要细胞之一，主要位于皮质和外髓肾间质。肾间质纤维化进程中，间质成纤维细胞虽处于活跃增生状态且胶原表达较正常增高，但该变化的分子机制尚处研究之中。由于成纤维细胞增生活化，依赖于其存在的间质微环境，其中TGF-β1作为纤维化进程中重要的细胞因子，其促纤维化的生物学作用已被多种实验证实〔5，6〕。本研究显示：纤维化肾组织的成纤维细胞中可见TGF-β1及其Ⅰ型受体蛋白及基因的表达，说明肾间质成纤维细胞在肾小管间质纤维化中是TGF-β1的合成细胞之一，更重要的是由于该细胞具有TGF-β1的特异受体，使其以自分泌和旁分泌的方式接受TGF-β1的作用成为可能，同时也证明TGF-β1是促肾成纤维细胞增生和细胞外基质合成的一个重要的细胞因子。与其他器官的成纤维细胞培养相比，肾间质成纤维细胞的培养起步较晚，报道较多的是人纤维化肾穿刺组织的成纤维细胞培养〔1〕。由于实验动物的肾纤维化模型建立处于探索阶段，其成纤维细胞培养尚无系统报道。我们在建立腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化实验模型基础上，以模型肾髓质作组织来源探索了肾间质成纤维细胞的培养方法。研究发现，由于肾纤维化过程中成纤维细胞处于明显活化增生状态，故纤维化肾组织培养过程中成纤维细胞于培养第3天，已明显自组织的周围长出，不同于正常肾组织成纤维细胞培养中，肾小管上皮细胞首先长出，成纤维细胞于培养第7天偶见爬出的报道。此外，本实验结果显示，纤维化肾组织的悬液中含大量脱落的成纤维细胞；将悬液加入DMEM培养基原代培养，游离的成纤维细胞于1天后贴壁，继而分裂增生呈编织样排列，而正常肾组织成纤维细胞培养中未见此现象，说明纤维化肾组织中成纤维细胞确有明显增生。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题(No 39770293)
作者简介：孙锁柱， 男，30岁，硕士，主治医师
邹万忠，男，60岁,教授，博士生导师。研究方向：泌尿疾病病理学
参考文献
1，Lnonemann G, Shapiro L, Engler-Blum.Cytokines in human renal interstitial fibrosis.Kidney Int，1995;47:837～844
2，Robert AB, McCune BK, Sporn MB.TGF-β1 regulation of extracellular matrix.Kidney Int，1992;41:557～559
, http://www.100md.com
3，Derynck R, Jarrett JA, Chen EY.Human transforming growth factor beta cDNA sequence and expression in tumor cell lines.Nature，1988;316:701～705
4，Wrana JL, Attisano L, Carcamo J.TGF-β1 singals through a heteromeric protein kinase receptor complex.Cell,1992;71:1003～1014
5，Coimbra T M, Carvalho J, Fattori A, Transforming growth factor beta production during the development of renal fibrosis in rats with subtotal renal ablation. Int J Exp Pathol, 1996; 77:167～173
6，Wright EJ, McCaffrey TA, Robertson AP.Chronic unilateral ureteral obstruction is associated with interstitial fibrosis and tubular expression of transforming growth factor. Lab Invest，1996;74:528～537
收稿日期：1999-03-10 修回日期：2000-02-11, 百拇医药
单位：孙锁柱(孙锁柱现在解放军第二炮兵总医院病理科 100088)；徐曼 邹万忠(北京医科大学病理学系 100083)
关键词：肾小管间质纤维化；成纤维细胞；转化生长因子β1；受体，转化生长因子β1 Ⅰ 型；大鼠；疾病模型，动物
临床与实验病理学杂志000215 摘要 目的：研究腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化模型的肾组织成纤维细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体的表达。方法：腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾小管间质纤维化模型，由模型肾组织培养肾间质成纤维细胞，应用免疫组化、逆转录PCR分别检测TGF-β1及其Ⅰ型受体蛋白及mRNA的表达。结果：成纤维细胞TGF-β1、TGF-β1 I 型受体免疫组化阳性；逆转录PCR可见294bp的TGF-β1及345bp的TGF-β1的Ⅰ型受体mRNA特异扩增带。结论：在肾小管间质纤维化进程中，肾间质成纤维细胞是TGF-β1的一个来源，而且也是其效应细胞，从而在TGF-β1的作用下出现增生和合成细胞外基质的效应。
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中图分类号 R692.33 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(2000)02-0134-03
Detection of TGF-β1 and its type Ⅰ receptor in fibroblasts in tubulointerstitial fibrosis
Sun Suozhu, Xu Man, Zou Wanzhong
(Dept of Pathol, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Purpose To investigate the expression of TGF-β1 and it's type I receptor in fibroblasts in the renal tubulointerstitial fibrosis animal model. Methods The tubulointerstitial fibrosis model was established in Wistar rats by gastroperfusion of excessive adenine,and then to culture the renal interstitial fibroblasts. The expressions of protein and mRNA for TGF-β1 and it's type I receptor were examined utilizing immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results Immunohistochemistry showed positivity of TGF-β1 and it's type I receptor in fibroblasts. The 294bp and 345bp special RT-PCR productions for TGF-β1 and it's type Ⅰ receptor mRNA can also be detected in the cultured fibroblasts. Conclusion Fibroblast is a origin and effective cell for TGF-β1 in tubulointerstitial fibrosis.
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KEY WORDS tubulointerstitial fibrosis；fibroblasts；transforming growth factor β1；receptors,transforming growth factor β1 type Ⅰ rats; disease models, animal
肾小管萎缩和消失、肾间质淋巴和单核细胞浸润及纤维组织增生称为肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis)，是各种慢性肾损伤的病理表现。肾间质成纤维细胞是肾间质中细胞外基质的主要形成细胞。肾间质纤维化进程中，在多种细胞因子作用下，该细胞增生，细胞外基质合成增加〔1〕。其中TGF-β1在促成纤维细胞增生和细胞外基质形成中有重要作用〔2〕。本文在建立腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化实验模型的基础上，以模型肾组织作供体，成功培养了肾间质成纤维细胞，进而检测该细胞TGF-β1及其Ⅰ型受体基因表达及蛋白合成。
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1 材料与方法
1.1 大鼠肾小管间质纤维化模型的建立 Wistar大鼠，雌性，150～180 g(北京医科大学实验动物部提供)，腺嘌呤加入2%淀粉溶液，加热制成腺嘌呤淀粉混悬液，每日0.3 mg/g体重剂量灌胃1次，连续5周。对照组以等体积2%淀粉溶液灌胃。
1.2 肾小管间质纤维化肾组织成纤维细胞培养 取模型5周的肾髓质，超净台内剪成l mm3的碎块，0.25%胰蛋白酶略消化，Hanks液洗，培养于含20%小牛血清的DMEM培养基中。原代培养7天，传代继续培养，取生长状态良好的二代细胞，分别经透射电镜、免疫组化(keratin、vimentin、collagen Ⅲ)及含右旋缬氨酸的MEM培养基，替代培养鉴定，证实为成纤维细胞。
1.3 成纤维细胞的免疫组化观察 常规制备培养的成纤维细胞爬片，以兔抗人TGF-β1抗血清和兔抗人TGF-β1 Ⅰ型受体的抗血清(Santa Cruz公司产品)作一抗，以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。ABC法检测TGF-β1及其I型受体。爬片经DAB显色, 成纤维细胞胞浆内棕褐色颗粒为阳性。
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1.4 逆转录PCR 异硫氰酸胍一步法提取培养的成纤维细胞RNA，在逆转录酶AMV催化下合成cDNA,以适量cDNA作模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增，所用引物序列根据文献〔3，4〕，由本系合成。TGF-β1引物：sense：5GGACTACTA-CGCCAAAGAAG 3； Antisense：5TCAAAAGACA-GCCACTCAGG 3(nt715-1008)。TGF-β1 Ⅰ型受体引物sense 5GCTTAGACACGACAACATCC 3； antisense：5CCAATGTCCAGGTAATCGCT 3(nt753-1097)。其中，TGF-β1 PCR扩增退火温度为55℃，30个循环；特异扩增片段294bp，TGF-β1 Ⅰ型受体PCR扩增退火温度为60℃，35个循环；特异扩增片段345bp。
2 结果
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2.1 腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化病变特征 给药3天始，腺嘌呤代谢产物，2，8-二羟基腺嘌呤结晶沉积于肾小管，受累小管变性坏死,间质内可见中性粒细胞为主的炎细胞浸润；给药1～2周，受累小管不断增多，间质中性粒细胞渐少，淋巴细胞和单核细胞逐渐增多；给药3～5周，各级肾小管弥漫扩张，上皮萎缩，间质弥漫淋巴单核细胞浸润，成纤维细胞增生，细胞外基质大量形成，出现肾小管间质纤维化(图1)。其中，给药3～5周时，2，8-二羟基腺嘌呤结晶周围形成以单核巨噬样细胞增生为特征的肉芽肿性病变，该细胞圆形或椭圆形，胞浆丰富淡染，细胞间界限不清，核圆形，大而浅染，核仁清晰。
图1 模型5周，大鼠肾小管间质纤维化。PAS染色×100
2.2 肾小管间质纤维化的肾间质成纤维细胞的生长及表型特征 模型肾髓质原代培样3天，梭形细胞自组织周围爬出，细胞不断分裂增生，渐成编织样排列，细胞传代后，继续分裂增殖，细胞呈梭型、纺锤型。电镜下，该细胞胞浆富含内质网，免疫组化keratin阴性，vimentin、collagen Ⅲ阳性(图2a，2b)。在含有右旋缬氨酸的MEM培养基中培养至第10天，由于成纤维细胞不能利用右旋缬氨酸，致使细胞大量死亡，这是成纤维细胞的一个重要的生物学特点，证明培养的细胞确为成纤维细胞。
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图2 a.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色vimentin阳性信号(↑)。ABC×200；b.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色collagenⅢ阳性信号(↑)。ABC×200
2.3 成纤维细胞TGF-β1、TGF-β1 Ⅰ型受体蛋白及基因表达 成纤维细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1、TGF-β1 Ⅰ型受体阳性信号(图3a，3b)。逆转录PCR可见294bp的TGF-β1及345bp的TGFβ1 Ⅰ型受体mRNA特异扩增带(图4a，4b)。
图3 a.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1阳性信号(↑)。ABC×200；b.培养成纤维细胞爬片，细胞胞浆内可见棕褐色TGF-β1 Ⅰ型受体阳性信号(↑)。ABC×200
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图4 RT-PCR
a：1.TGF-β1，2.标准分子量DNA；
b：1.TGF-β1 Ⅰ型受体，2.标准分子量DNA
3 讨论
肾间质成纤维细胞是肾小管间质纤维化中参与细胞外基质形成的主要细胞之一，主要位于皮质和外髓肾间质。肾间质纤维化进程中，间质成纤维细胞虽处于活跃增生状态且胶原表达较正常增高，但该变化的分子机制尚处研究之中。由于成纤维细胞增生活化，依赖于其存在的间质微环境，其中TGF-β1作为纤维化进程中重要的细胞因子，其促纤维化的生物学作用已被多种实验证实〔5，6〕。本研究显示：纤维化肾组织的成纤维细胞中可见TGF-β1及其Ⅰ型受体蛋白及基因的表达，说明肾间质成纤维细胞在肾小管间质纤维化中是TGF-β1的合成细胞之一，更重要的是由于该细胞具有TGF-β1的特异受体，使其以自分泌和旁分泌的方式接受TGF-β1的作用成为可能，同时也证明TGF-β1是促肾成纤维细胞增生和细胞外基质合成的一个重要的细胞因子。与其他器官的成纤维细胞培养相比，肾间质成纤维细胞的培养起步较晚，报道较多的是人纤维化肾穿刺组织的成纤维细胞培养〔1〕。由于实验动物的肾纤维化模型建立处于探索阶段，其成纤维细胞培养尚无系统报道。我们在建立腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化实验模型基础上，以模型肾髓质作组织来源探索了肾间质成纤维细胞的培养方法。研究发现，由于肾纤维化过程中成纤维细胞处于明显活化增生状态，故纤维化肾组织培养过程中成纤维细胞于培养第3天，已明显自组织的周围长出，不同于正常肾组织成纤维细胞培养中，肾小管上皮细胞首先长出，成纤维细胞于培养第7天偶见爬出的报道。此外，本实验结果显示，纤维化肾组织的悬液中含大量脱落的成纤维细胞；将悬液加入DMEM培养基原代培养，游离的成纤维细胞于1天后贴壁，继而分裂增生呈编织样排列，而正常肾组织成纤维细胞培养中未见此现象，说明纤维化肾组织中成纤维细胞确有明显增生。
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基金项目：国家自然科学基金资助课题(No 39770293)
作者简介：孙锁柱， 男，30岁，硕士，主治医师
邹万忠，男，60岁,教授，博士生导师。研究方向：泌尿疾病病理学
参考文献
1，Lnonemann G, Shapiro L, Engler-Blum.Cytokines in human renal interstitial fibrosis.Kidney Int，1995;47:837～844
2，Robert AB, McCune BK, Sporn MB.TGF-β1 regulation of extracellular matrix.Kidney Int，1992;41:557～559
, http://www.100md.com
3，Derynck R, Jarrett JA, Chen EY.Human transforming growth factor beta cDNA sequence and expression in tumor cell lines.Nature，1988;316:701～705
4，Wrana JL, Attisano L, Carcamo J.TGF-β1 singals through a heteromeric protein kinase receptor complex.Cell,1992;71:1003～1014
5，Coimbra T M, Carvalho J, Fattori A, Transforming growth factor beta production during the development of renal fibrosis in rats with subtotal renal ablation. Int J Exp Pathol, 1996; 77:167～173
6，Wright EJ, McCaffrey TA, Robertson AP.Chronic unilateral ureteral obstruction is associated with interstitial fibrosis and tubular expression of transforming growth factor. Lab Invest，1996;74:528～537
收稿日期：1999-03-10 修回日期：2000-02-11, 百拇医药