我国四株狂犬病毒糖蛋白基因序列分析和位点比较
作者：唐青 Lillian A Orciari Charles E. Rupprechti 赵秀芹 李志刚 杨为松
单位：唐青 赵秀芹(北京中国预防医学科学院流行病研究所，北京 102206)；Lillian A Orciari(美国疾病控制中心，美国)；Charles E. Rupprechti(美国疾病控制中心，美国)；杨为松(第四军医大学唐都医院传染科，西安 710038)；李志刚(宁夏自治区卫生防疫站，银川 750004)
关键词：狂犬病毒；糖蛋白；基因；同源性；致病性；嗜神经性
中国病毒学000105 摘 要：测定我国人用狂犬疫苗株(aG)、减毒株(CTN-181)及两株街毒 糖蛋白(GP)基因cDNA的核苷酸序列及推导氨基酸序列。结果两株街毒仅相差两个碱基和一个氨基酸残基；两株街毒与CTN的同源性(85.9%)高于aG株(81.9%)；聚类分析将街毒和固定毒分为两支。比较GP嗜神经位点的氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位高度同源。被认为决定毒力的333位Arg，CTN发生了Q替换，其它毒株均为Arg333。所比较的毒株均存在319位糖基化位点，此外37位糖基化位点也相对保守；GP两个主要抗原表位，GⅡ的氨基酸构成完全一致，GⅢ只在一些减毒株中发生与毒力密切相关碱基的替换。
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分类号：R373.9 文献识别码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0022-12
Sequencing and Position Analysis of the Glycoprotein Gene
of Four Chinese Rabies Viruses
TANG Qing, YANG Wei-song
(Epidemiology and Microbiology Institute of National Academy
of Preventive Medicine, Beijing 102206, China)
, 百拇医药
Lillian A Orciari
(National Center for Infectious Diseases Control, 1600 Clifton Road,N.E. Atlanta, Georgia 30333, USA)
Abstract：The glycoprotein gene of human rabies vaccine strain (aG), one attenuated fixed strain (CTN-181) and two street viruses were sequenced and the amino acid sequences were deduced. The result shows that two street strains have two differences in nucleotide sequences and one in amino acid sequences, the nucleotide homology was higher compared with CTN (85.9%) than with aG (81.9 %). Phylogenetic tree divided the street strains and the laboratory strains into two branches. High amino acid sequence similarity was present between the segments of the viral GP which may function as a recognition site for AchR and the receptor-binding region of the neurotoxins; CTN strain had Q substitution at position 333 and the other virulent strains preserved 333 Arg. In all strains 319 glycosyl ation was existed, glycosylation on 37 is also relatively conserved. The amino acid constitution of antigenic site Ⅱ is identical in all compared strains, but on site Ⅲ some attenuated strains have amino acid substitution on position 333 and other sites which related with pathogenicity.
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Key words：Rabies virus; Glycoprotein; Gene; Homology; Pathogenicity; Neurotropic▲
狂犬病毒糖蛋白(GP)是嵌在病毒粒子表面形成棘状突起的结构成分，它既可以诱导宿主免疫反应产生中和抗体和刺激细胞免疫，又作为媒介使病毒吸附在宿主细胞表面进而侵入细胞，因此无论是在病毒的免疫原性或病毒的组织嗜性和毒力方面，GP都起着决定性作用。目前一些实验室固定毒株的GP基因序列测定已相继完成[1，2]。我国到目前为止仅进行过广西一只疯犬分离毒株和中国人用疫苗株(3aG和5aG)的GP基因序列测定[3，4]。通过对这些毒株的序列测定和分析已知狂犬病毒GP基因由1650个核苷酸残基组成，完整阅读框(ORF)从起始密码(ATG)到终止密码(TGA)共1575个核苷酸残基，编码524个氨基酸。流行于不同地区、不同宿主的狂犬病毒，其GP基因的变异远远大于核蛋白基因。由于GP与狂犬病的预防和致病密切相关，我国狂犬病流行严重，宿主动物种类又多，对本国分离毒株GP基因的分析和研究，有助于深入了解我国狂犬病毒致病和保护性免疫的机理，为此在对我国四株狂犬病毒GP基因序列测定的基础上进行了有关GP基因与致病性、免疫原性及组织嗜性关系的分析和研究。
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1 材料与方法
1.1 病毒 aG为中国人用地鼠肾细胞疫苗株，因分离自北京也称北京株(PG)，由中国预防医科院流研所严玉辰老师提供。CTN-181为实验室减毒株，由中国药品生物制品检定所严子林老师提供。CNX8511和CNX8601是我国宁夏省卫生防疫站收集的两例临床诊断为狂犬病的死亡病人脑组织标本，两份标本冻存于-20℃经多年后送至流研所经乳鼠脑传代，冷冻切片后用抗狂犬病毒荧光抗体染色鉴定为狂犬病毒并分离得到病毒，均为街毒。
1.2 PCR及序列反应引物 用于RT-PCR和序列反应的寡核苷酸引物，通过比较已发表的ERA株、中国广西毒株及中国人用疫苗株的序列设计合成P1-P4引物，引物941、763、93G、1444、1323、1171、989、754由美国CDC提供；采用分段PCR和分段测序的方法对4株中国狂犬病毒进行GP基因全序列测定： PCR和测序引物
引物
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序列
位置和方向
Messenger sense
941 PIMC
ACCAAGTCAGTGAGTTTCAGA
941→961
763 PIMC
AGACTTATGGATGGAACATGG
764→784
93GPIMC
ATTTACACGATACCAGACAA
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74→93
P1
TTATCACTTGTTTACCTCTGG
-142→-163
P3
GACGAAATTGAGCACCTTGTTGT
859→882
Genomic sense
1444PRIM
ACATGTCATCCAGGAAAATTAT
1432←1 444
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1323PRIM
ATTCCAACAACTCCATATG
1213←1232
1171PRIM
GCCGTCAGGTCCTAATATTAT
1151←1171
989PRIM
CTGAGACGTCTGAAACTCAC
949←969
754PRIM
AACTCCACATAACTTGAGTTT
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734←754
P2
CTCGTTCTGAACACCCAAA
673←691
P4
ACCCAAGTTATCAGGAGGACC
1644←1664
1.3 RT-PCR 用RNA分离试剂TRIZOL分离病毒RNA(按试剂说明书操作)，用正向引物逆转录合成cDNA第一链，PCR扩增cDNA，参数如下：94℃30s50℃30s，72℃1min30s，共循环40次。PCR产物经低熔点胶电泳及WizardTMPCR Preps DNA Purification System试剂盒纯化。
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1.4 双脱氧链末端终止法直接进行cDNA的核苷酸序列测定 测定引物用与PCR反应相同的引物，PCR扩增并纯化后的产物为模板，每个PCR产物分别用正向和反向两个引物从两个方向进行单链测序反应，序列测定用PRISMTMReady Reaction DyeDeo-xyTM Terminator Cycle Sequencin g Kit进行。 在总容量为20μL的测序反应中含有：9.5μL Prizm Tag Dydeoxy Terminator (包括四 种末端标记有不同波长荧光物质的双脱氧核苷：1.58μmol/L A-DyeDeoxy, 94.74μmo l/L T-DyeDeoxy, 0.42μmol/L G-DyeDeoxy, 47.37μmol/L C-DyeDeoxy; 15.79 μmol/L dNTP和0.42u/μL Tag DNA聚合酶)；2μL 1.6pmol/L引物；纯化并干燥后的 PCR产物(cDNA)约1.0μg溶在7μL H2O中作为模板；补充H2O至20μL，混均后在PCR仪上进行测序反应，反应条件：96℃30s,50℃15s,60℃4min，共循环25个周期。四种带标记的双脱氧核苷链末端终止反应均在一个反应管中进行，用373ADNA自动测序仪经10～12h电泳后直接读取核苷酸序列。
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1.5 计算机分析 将序列结果输入计算机，用Winstar软件在计算机上进行分析和比较。
2 结果
2.1 四株狂犬病毒GP基因编码区核苷酸序列和推导氨基酸的序列及其比较
计算机分析四株病毒GP基因ORF，四株病毒GP基因编码区均从起始密码ATG开始，终止密码除CTN株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基，四株病毒GP基因核苷酸序列见图1。两株街毒核苷酸序列仅在960和1535两位点相差两个碱基，与CTN及aG株相比两株街毒与CTN的同源性(85.9%)大于aG株(81.9%)。根据已发表的资料[5]，狂犬病毒GP基因可分为四个区，即：信号肽编码区(1～57位核苷酸)、膜外区(58～1374位核苷酸)、穿膜区(1375～1440位核苷酸)和膜内区(1441～1575位核苷酸)。比较四株病毒GP基因不同区段核苷酸及氨基酸序列(见表1)，膜外区同源性高于其它三个区，最低的是膜内区，氨基酸序列同源性样均大于相应区段的核苷酸序列。
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表1 G基因不同区段核苷酸和推导氨基酸序列同源性比较
Table 1 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t segments of GP genes 同源性 Homology (%)
8511/8601
8511/CTN
8601/CTN
8511/aG
8601/aG
CTN/aG
信号肽 Signal sequence
, 百拇医药
核苷酸 Nucleaotide (%)
100
68.4
68.4
75.4
75.4
78.9
氨基酸 Amino acid (%)
100
73.7
73.7
78.9
, 百拇医药
78.9
63.2
膜外区 Ectodomain
核苷酸 Nucleaotide (%)
99.9
87.4
87.4
84.2
84.2
84.2
氨基酸 Aminno acid (%)
100
, 百拇医药
95.4
95.4
94.3
94.3
92.5
穿膜区 Transmembrane domain
核苷酸 Nucleaotide (%)
100
78.8
78.8
74.2
74.2
, 百拇医药
68.2
氨基酸 Amino acid (%)
100
81.8
81.8
81.8
81.8
68.2
膜内区 Cytoplasmic domain
核苷酸 Nucleaotide (%)
99.3
81.5
, 百拇医药
82.2
65.9
65.9
73.3
氨基酸 Amino acid (%)
95.6
75.6
77.8
62.2
62.2
66.7
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图1 四株狂犬病毒GP基因核苷酸序列
Fig.1 Sequence of nucleotides of four rabies viruses GP genes
2.2 与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性比较
将本次测定的四株病毒GP基因编码区序列与广西毒株CGX89-1及国外一些毒株GP基因编码区 序列进行比较，同源性从50.9%到99.9%(见表2)，平均83.7%，同源性最低的是在CV S和Mokola两个毒株之间，为50.9%。明显可以看到的是Mokola株几乎和所有与其比较的毒株 同源性均很低，从50.9%(Mokola/CVS)到51.9%(Mokola/CNX8511和CNX8601)。如果不包括Mok ola株，同源性平均为87.3%。从表2还可以看到来自中国同一地区的两株街毒(CNX8511/ CNX8601：99.9%)之间和来源于同一毒株的两株兽用减毒疫苗株之间(SAD-B19/ERA：99.4%) 均表现GP基因序列高度同源。
, 百拇医药
表2 不同狂犬病毒G基因核苷酸和氨基酸序列同源性比 较
Table 2 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t rabies viruses GP genes 同源性 Homolog (%)
8511
86 01
CTN
aG
CGX
PV
CVS
SAD
, 百拇医药
ERA
Flury
Mokola
CNX8511
99.9
85.9
81.9
87.6
82.5
82.8
83.0
82.9
83.4
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51.9
CNX8601
99.6
86.0
81.9
87.7
82.6
82.8
83.0
83.0
83.5
51.9
CTN
, 百拇医药
92.4
92.6
82.5
92.5
81.8
81.0
82.2
82.0
82.2
51.5
aG
90.5
90.5
, 百拇医药
88.2
82.7
91.0
88.0
90.6
90.7
88.9
51.4
CGX
94.5
94.7
93.5
89.9
, 百拇医药
82.5
82.1
83.0
82.7
82.9
51.8
PV
91.6
91.8
89.0
90.5
92.0
88.3
, 百拇医药
97.7
97.9
89.7
51.1
CVS
89.9
89.9
86.5
86.9
89.0
88.4
88.1
88.1
, 百拇医药
92.8
50.9
SAD
92.0
92.2
89.1
89.9
91.6
96.2
87.8
99.4
89.3
51.5
, 百拇医药
ERA
91.8
82.0
89.0
89.7
91.54
96.4
87.6
98.9
89.4
51.1
Flury
92.4
, 百拇医药
92.6
89.7
89.7
92.2
91.4
89.9
90.7
90.5
51.6
Mokola
56.2
56.4
55.3
, 百拇医药
55.3
55.8
55.6
56.0
56.6
56.0
55.3
注：核苷酸序列同源性(上方)和氨基酸序列同源性(下方)
Note. The percentages of nucleotides (top) and amino acid (bottom) similarity.2.3 聚类分析
通过计算机Clustal Method对四株检测病毒与已经发表的国内外毒株的GP基因进行聚类分析 ，绘出系统发生树状图(见图2)。从图2可以看到所有血清(基因)一型毒株形成一个分支，在 这一个分支下，中国宁夏人分离的两株毒株、广西犬毒株和CTN归于一类；其它毒株归于另 一类，即10种病毒归为两大类：实验室固定毒和街毒，这些街毒均来自于中国。CTN虽然并 非新分离的街毒，但与其它实验室固定毒相比，分离时间短，动物和细胞传代次数也少于其 它实验室固定毒，因此与中国其它街毒更接近。相比之下，其它实验室固定毒株已分离至少 50年以上，经过多种动物和细胞传代并作为疫苗株，在生物学特性上有着更多的相似性，因 此表现为相互之间有着更近的亲缘关系。Mokola是血清(基因)三型毒株，形成一个完全独立 的分支。
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图2 不同狂犬病毒GP基因系统发生 树状图
Fig.2 Phylogenetic tree of different rabies virus's GP genes
2.4 GP膜外区部分抗原位点氨基酸构成的比较和分析
2.4.1 与抗原特性和毒力有关区段的比较 狂犬病毒与中和抗体结合的主要部位是GP分子 上第三(GⅢ)和第二抗原部位(GⅡ)[6]。GⅢ大约位于第330～357位氨基酸区段，其中333位氨基酸Arg (R，精氨酸)被认为是狂犬病毒嗜神经性和毒力的关键残基，如果该部 位R被Q(谷氨酰胺)、Ⅰ(亮氨酸)或G(甘氨酸)取代，病毒的毒力将会大大降低[7] 。GⅡ大约位于34～200位氨基酸区段[8]，至少含两个主要表位：34～42和198～2 00区段。GP抗原性变化经常是因为GⅡ位点上34～42位和198～200位氨基酸以及GⅢ位点上33 0～340位氨基酸的改变造成。比较不同狂犬病毒GP氨基酸序列在这些区域的构成，结果见表3。
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表3 不同狂犬病毒GP基因GⅢ和GⅡ区氨基酸序列比较
Table 3 Amino acid sequence comparison of GⅢ and GⅡ of different rabies virus es GP genes Viruses
毒株
GⅢ
GⅡ
330～357序列
333/339位aa
34～42序列
198～20序列
8511
, 百拇医药
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
8601
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CTN
KSVQTWDEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
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Q/I
GCTNLSGFS
KRA
aG
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CGX
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GGCTNLSGFS
, 百拇医药
KRA
PV
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CVS
KSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
ERA
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KSVRTWNEILPSKGCLKVGGRCHPHVNG
R/L
GCTNLSGFS
KRA
Flurry
KSVGTWNEIIPSKGCLKVGERCHPHVNG
G/I
GCTNLSGFS
KRA
SAD
KSVRTWNEILPSKGCLKVGGRCHPHVNG
, http://www.100md.com
R/L
GCTNLSGFS
KRA
HEP
KSVQTWNEIIPSKGCLRVGERCHPHVNG
Q/I
GCTNLSGFS
KRA
CTN、SAD-B19和HEP是减毒株，Flurry和ERA株为兽用疫苗株，这些毒株在GⅢ区氨基酸 序列与其它毒株相比有所不同。其中CTN和HEP株333位的R被Q(Glu)替代，Flurry株则被G(Gl y)替代。这三株毒株都是减毒株，都在333位发生了Q或G的替换，这与以往的研究结果 [7]一致。SAD和ERA株在339位的I(Ile)被L(Leu)替代。SAD也是减毒株，ERA为兽用口 服活毒疫苗株，其毒力也较普通疫苗株低，因此推测339位的碱基是否也与毒力有关。其余 毒株中8511、8601和CGX是街毒、aG和PV株是用于生产灭活疫苗的毒株、CVS是世界标准攻击 毒 株，这些毒株均保留了毒力，在GⅢ区氨基酸序列也完全相同。以上所有毒株在GⅡ区两个表 位的结构均相同。
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2.4.2 与组织嗜性有关区段的比较 目前认为狂犬病毒在体内的细胞受体是乙酰胆碱受体( acetylcholine receptor, AchR)，因为狂犬病毒GP与AchR的一种高亲和配体——箭毒样蛇 神 经毒素有明显的结构相似性，尤其是GP第189～214位氨基酸与该毒素第二长毒性环第30～56 位的氨基酸序列[9]高度同源(50%)，这一区段正是神经毒素与AchR的结合部位， 其中Arg37是所有神经毒素中绝对保守的基团，也是神经毒素与AchR结合的重要位点。为了 证实这一推论，我们对神经毒素与AchR结合部位的氨基酸序列和狂犬病毒GP相应位置的氨基 酸序列进行了比较，结果除Mokola株外同源性达50%(见表4)。国内鹿分离的一株病毒GP膜外 区部分片段的序列测定也显示此位点的高度同源[10]。被认为是结合区域中保守 位点的Asp31、Phe33、Gly38、Lys39残基，GP也与神经毒素的完全相同。即使是序列相差较 远的Mokola株，该段序列也表现较高的同源性。表4 狂犬病毒嗜神经区段和位点的比较
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Table 4 Site and segment comparison of neuron tropism of rabies viruses 毒株 Virus
嗜神经区段
Segment of neuron tropism
嗜神经位点
Site of neuron tropism
序列：30-56/189-214
Arg37
Asp31
Phe33
Gly38
, 百拇医药
Lys39
神经毒素
CDGFCSSRGKRIDLGCAATCPKVKPG
R
D
F
G
K
8511
CDIFVNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
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G
K
8601
CDIFVNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CTN
CDIFTNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
, 百拇医药
D
F
G
K
aG
CDIFTNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CGX
CDIFTNSRGKLASKGGKTCGFVDERG
, 百拇医药
R
D
F
G
K
中国鹿株
CDIFANSRGKRASKGTETCGFVDERG
R
D
F
G
K
PV
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CDIFVNSRGKRASKGSETCGFVDERG
R
D
F
G
K
SAD-B19
CDIFVNSRGKRASKGSKECGFVDERG
R
D
F
G
, http://www.100md.com K
ERA
CDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERG
R
D
F
G
K
Flury
CDIFTNSRGKRASKGGKTCGFVDERG
R
D
F
, 百拇医药
G
K
HEP
CDIFTHSRGKRASKGDKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CVS
CDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERG
R
D
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F
G
K
Mokola
CDIFTSSSGQKAMNGSRICGFKDERG
S
D
F
G
Q
2.4.3 与糖基化位点有关区段的比较 狂犬病毒GP细胞外区域有糖基化位点，适当的糖基 化对GP的表达非常重要。目前的研究已经证实可溶性糖蛋白(Gs)只在319位有一个糖基化位 点Asn(天冬酰胺)，GP则有数个糖基化位点。不同的狂犬病毒糖基化位点的数目和位置不完 全相同[11]，但大多数有三个，其结构特点是N-X-S(Asn-X-Ser) 或N-X-T(Asn-X-Thr)，其中319位糖基化位点存在迄今已测序的所有狂犬病毒中 [12]。本研究中四株病毒GP的糖基化位点不完全相同，与其它毒株相比也有差异 ，但319位糖基化位点(N-K-T)存在于四株病毒以及所有进行比较的毒株中，只是Mokola株 在此糖基化位点的氨基酸构成上与其它毒株不完全相同(N-G-S)。此外，37位糖基化位点 存在除Mokola株外所有进行比较的毒株中。158位(CGX、PV、SAD和Flurry)和247位(CTN、aG 、PV、SAD和ERA)糖基化位点也相对比较集中。唯有与其它毒株差异较大的Mokola株在202位 有一个糖基化位点。
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3 讨论
3.1 病毒株与核苷酸序列同源性的关系
在已经测序的中国病毒中，8511和8601来自1985和1986年死亡的病人，CGX于1989年从广西 一只疯犬分离，CTN1983年分离自济南一只疯犬。四株病毒分离年代接近，8511、8601和CGX 都是街毒。单克隆抗体分析表明8511和8601是犬毒株，CGX和CTN原本分离自犬，因此这四株病毒的宿主动物是一致的。aG株是1935年从北京一只狂犬分离的，至今已经历了60多年的实验室动物和细胞传代，成为人用疫苗株，其生物学性状已经发生了很大变化。因此无论是核苷酸序列或氨基酸序列，三株街毒与CTN的同源性(核苷酸：85.9%～99.9%，氨基酸：92.4%～99.8%)高于同aG株(核苷酸：81.9%～82.7%；氨基酸：88.2%～90.5%)相比。将我国病毒GP序列与国外血清Ⅰ型一些固定毒株进行比较，氨基酸序列同源性均高于核苷酸序列同源性。CVS源于法国狂犬病牛的病毒，目前作为具有较强毒力的国际标准攻击毒株，CTN与CVS无论从宿主来源还是后来的传代过程都不相同，两者在毒力及实际应用上也有很大差异，因此基因结构相距较远也不奇怪。ERA和SAD-B19都是兽用疫苗株，其中SAD-B19是减毒株，但两个毒株来源一致，所以具有很高的同源性。另外还可以看到的是疫苗株之间同源性高，即使是在中国和欧美疫苗株之间也表现较高的同源性：核苷酸序列同源性为88.9%(aG/Flury)～99.4%(ERA/SAD-B19)。能够筛选作为疫苗株的毒株在产生保护性免疫的作用上应有共同之处，因此疫苗株可能会在抗原结构上有更多的相同之处，基因结构也较接近。将所有这些毒株与血清型不同的Mokola株(血清型Ⅲ)相比，则核苷酸(50.9%～51.9%)和氨基酸(55.3%～56.2%)序列都有很大差异，从中不难理解血清Ⅰ型的疫苗株对血清Ⅲ型的Mokola株基本没有保护作用的原因。由此可以看到生物学性状相近的毒株，基因结构也相近。
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3.2 GP结构与保护性免疫的关系
电镜研究已经证实在病毒表面的狂犬病毒GP以一种三聚体形式存在。许多具有受体识别和膜融合特性的病毒，其外膜蛋白也都以同样形式存在，这可能在生物学上有其重要性，也可能反应与受体识别和膜融合特性有关机制的相似性。虽然随着时间的推移，描述狂犬病毒GP抗原位点的数目有所增加，但能够解释得比较明确的只有抗原位点GⅠ、GⅡ和GⅢ。GⅠ是只含有一个表位的独立位点。GⅡ是一不连续的构象依赖性抗原区，位于34～200区段，其中主要两个表位在34～42和198～200区段；GⅢ大致位于330～357区段，其中与抗原性关系最大的为第333、336、339和357位残基。虽然GⅢ由更为连续的表位组成，但与GⅢ结合的单抗不能识别其非折叠状态，表明这些氨基酸在蛋白表面有一定的立体结构。此外264位R(Arginine)被H(Histidine)取代和44位M(Methionine)被Ⅰ(Isoleucine)取代也可以使GP抗原性有所改变。从我们测序推导的氨基酸序列来看，四株病毒中两株固定毒(CTN和aG)264位是H而两株街毒(8511和8601)264位是R。减毒株CTN同时还有与毒力密切相关的333位R(Arginine)和336位N(Asparagine)被Q(Glutamine)和D(Asparticacid)所替代(见表3)。比较国际毒株，Flury和HEP也在333位发生了G(Glycine)和Q替换。三株减毒株都在333位发生了氨基酸残基的替换，而街毒以及其它保留了原有毒力的固定毒株在此位点仍为R残基，由此看来333Arg是决定狂犬病毒毒力的一个主要位点。另外，在认为与抗原性关系较大的339位，ERA和SAD株由L(Leucine)替代了Ⅰ。这两个毒株均为兽用活毒苗株，并且SAD是减毒株，因此339位可能也与病毒的毒力有关。在GⅡ区氨基酸序列，所有比较的毒株全部一致，说明GⅡ比GⅢ区保守。
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3.3 GP结构与组织嗜性的关系
狂犬病毒的增殖基本限于神经细胞内。由于GP189～214位氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位的序列高度同源，抗MAb-G独特型抗体也能与一些脑组织结构结合，因此曾推测GP有烟酸型乙酰胆碱受体(nAChR)作为狂犬病毒的受体。但仍然不清楚的是这种相互作用是否能引起病毒入侵。Christine等[13]用重组杆状病毒在昆虫细胞表面表达CVS株GP(Gcvs-Sf2)来研究GP与神经细胞之间的结合，发现几种有不同神经介质的哺乳动物神经细胞均可使狂犬病毒侵入，胆碱能和肾上腺素能神经瘤细胞都有Gcvs-Sf2结合位点的表达，提示在神经介质分泌和狂犬病毒特异性结合位点的表达之间没有关系。此外，狂犬病毒还可以感染没有nAChR的神经原，因此可能还有别的分子作为狂犬病毒的受体。研究还发现GP330或333位的单个突变既不能破坏Gcvs-Sf2与神经细胞的结合，也不能影响肌肉接种狂犬病毒后感觉和运动神经原的感染。但330和333两个位点变化后都会大大降低Gcvs-Sf2对神经细胞的亲和能力，也失去感染感觉和运动神经原的能力。体外实验狂犬病毒CVS株和CVS无毒变异株均可感染神经瘤细胞。Hanham等[14]推测狂犬病毒有两种类型的受体：高亲和力受体，只存在于神经细胞表面造成动物神经原的感染；低亲和力受体，存在于各种神经或非神经细胞表面。这种普遍存在的低亲和力受体在细胞表面高密度存在，并且可以包括BHK细胞表面饱和状态的结合位点。除此之外，磷脂[15]、糖脂和神经节苷脂[16]及蛋白也是狂犬病毒的受体，所以神经原表面的高亲和力受体的特性有待进一步阐明。但狂犬病毒GP第189～214位氨基酸与α-环蛇毒素同nAChR结合部位的氨基酸序列高度同源在本研究中也得到了证实(见表4)，尤其值得提出的是核苷酸和氨基酸序列同源性与血清Ⅰ型毒株相比都很低的Mokola株，在嗜神经位点上也表现有一定的同源性。可见nAChR学说可以解释狂犬病毒嗜神经特性的大部分特点，但它不是狂犬病毒与靶细胞表面作用的唯一方式。
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3.4 街毒和固定毒GP的变异
有关狂犬病毒GP的研究绝大多数来自对固定毒的分析，这些病毒已经有过很长的实验室动物或细胞传代的历史。由于RNA病毒突变率高，即使是在单一种群中也表现出很大的序列差异，所以从实验室固定毒得到的序列很难反应一个易变种群的真实变异情况。抗GPⅢ单抗筛选出来的实验室突变株失去了对成年鼠的神经毒能力[17]，这种毒力丧失总是与333位R(Arg)发生突变有关。这种突变株毒力的恢复常常是由于333位R或较少见的L的恢复所致。333位R的存在是否狂犬病街毒毒力绝对必需，一些街毒与GPⅢ特异性单抗反应阴性，这种情况可能与在GP结构上的其它差异所致，因此这些街毒仍保留有致病力。高度致神经毒的Mokola株与固定毒GP只有58%序列同源性，333位残基是D，但这是经过细胞培养适应后的序列，不能代表原有的序列。Benmansour等[18]对从阿尔及利亚死亡犬和犬伤病人分离的两株病毒直接进行GP测序，结果两株病毒仅有11个核苷酸、5个氨基酸不同，并都有333位R残基。人分离毒株经细胞传代数次后再次测序，结果发生4个核苷酸的变异，并产生了3个氨基酸的变异(298，326和333位)，其中333位Gln替代R导致了对GⅢ特异性单抗反应的阴性。用未发生变异的两株街毒接种成年鼠均显示特征性狂犬病症状，在同样条件下用发生了333位变异的毒株接种成年鼠，20%的鼠潜伏期延长，并且肌肉途径注射致病性降低了20倍。这表明抗原部位的变异不一定仅是免疫选择的结果，也可以由其它选择压力如特异性宿主的适应所造成。实验室毒株中，333位的变异总是与逃避GⅢ特异性单抗的中和以及丧失对成年鼠的致病性有关。结合本研究，CTN、Flury和HEP三株减毒株均表现333位的变异和对成年鼠不致病。但其它实验室毒株也经过多次细胞传代却保持了Arg333，提示组织特异性的分子基础是相当复杂的。比较中国的五株病毒，无论是核苷酸和氨基酸序列同源性及GP基因上一些特殊位点的构成都可以看出街毒与固定毒之间有一定差距。聚类分析绘出的种系发生树也将街毒和固定毒分为两个分支，可见街毒和固定毒之间在基因结构及亲源关系上都有一定的距离。由于疫苗株是固定毒，街毒和固定毒之间的差异会使我们想到已经延用了几十年的疫苗株是否会对随着时间和空间的不同而变化着的街毒始终有足够的保护作用从我们目前的研究还不能作出任何结论，但可以肯定的是街毒和实验室固定毒，包括疫苗株之间存在着抗原结构和基因结构上的差异。■
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基金项目：本研究系WHO资助课题
作者简介：唐青(1955-)，女，蒙族，内蒙赤峰人，副研究员，医学博士，研究方向：分子病毒学。
参考文献：
[1]Anilionis A, Wunner WH, Curtis PJ. Structure of the glycoprotein gene in rabies virus[J]. Nature, 1981,294,275～278
[2]Conzelmann KK, Cox JH, Schneider LG et al. Molecular cloning and comp lete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19 [J]. Virology, 199 0,175:485～499
, http://www.100md.com
[3]温冷，明文玉，朱家鸿等.中国狂犬病毒疫苗株(5aG株)糖蛋白的克隆与序列分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(3)：198～201
[4]Bai Xianhe, Cynthia K Warner, Makonnen Fekadu. Comparisions of nucleotide and deduced amino acid sequences of the glycoprotein genes of a Chinese street strain (CGX89-1) and a Chinese vaccine strain (3aG) of rabies virus [J]. Virus Research, 1993,27:101～112
[5]Anilionis A, William HW, Peter JC. Structure of the glycoprotein gene in rabies virus[J].Nature 1981,294(5838):275～278
, 百拇医药
[6]Lafon M, L Edelman, JP Bouvet et al. Human monoclonal antibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein [J]. J Gen Virol, 1990,7 1:1689～1696
[7]Sief L, Coulon P, Rollin PE et al. Rabies virulence: effect on pathog enicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antige nicsite Ⅲ of the glycoprotein[J]. J Virol, 1985,53(3)926～934
[8]Benmansour A H, Leblois H, Coulon C et al. Antigenicity of rabies virus glycoprotein[J]. J Virol, 1991,65:4198～4203
, 百拇医药
[9]Lentz TL, Wilson P T, Hawrot E et al. Amino acid sequence similarity between rabies virus glycoprotein and snake venom curaremimetic neurotoxins[J].Science, 1984,226:847～848
[10]钱爱东，侯世宽，张茂林等.狂犬病病毒糖蛋白基因主要功能区的克隆和序列比较分析[J].中国兽医学报，1996，16(6)：554～560
[11]Wunner WH, Dietzschold B, Smith CL et al. Antigenic variants of CVS rabies virus with altered glycosylation sites[J]. Virology，1985,140:1～12
[12]Rose JK, Doolittle RF, Anilionis A et al. Homolgy between the glyco proteins of vesicular stomatitis virus and rabies virus[J]. J Virology, 1982, 43:361～364
, http://www.100md.com
[13]Tuffereau C, Benejean J, Alfonso AM et al. Neuronal cell surface molecules mediate specific bonding to rabies virus glycoprotein expressed by a recombin ant baculovirus on the surfaces of lepidopteran cells [J]. J Virol，1998，72(2)：1085～1091
[14]Hanham CA, Zhao F, Tignor GH, Evidence from the anti-idiotypic network that the acetylcholine receptor is a rabies virus receotor[J]. J Virol, 1993, 67:530～542
[15]Superti F, L Seganti, H Tsiang et al. Role of phospholipids in rhabd ovirus attachment to CER cell[J]. Arch Virol, 1984,81:321～328
, 百拇医药
[16]Superti F, Hauttecoeur B, Morelec MJ et al. Involvement of ganglios ides in rabies virus infection [J]. J Gen Virol, 1986,67:47～56
[17]Coulon P, Rolin P E, Aubert M et al. Molecular basis of rabies virus virulence. I. Selection of avirulent mutants of the CVS strain with anti-G mon oclonal antibodies[J]. J Gen Virol, 1982,61:97～100
[18]Benmansour A, Brahimi M, Tuffereau C et al. Rapid sequence evolution of street rabies glycoprotein is related to the highly heterogeneous nature of the viral population[J]. Virology, 1992, 187:33～45
收稿日期：1998-11-13
修稿日期：1999-02-01, 百拇医药
单位：唐青 赵秀芹(北京中国预防医学科学院流行病研究所，北京 102206)；Lillian A Orciari(美国疾病控制中心，美国)；Charles E. Rupprechti(美国疾病控制中心，美国)；杨为松(第四军医大学唐都医院传染科，西安 710038)；李志刚(宁夏自治区卫生防疫站，银川 750004)
关键词：狂犬病毒；糖蛋白；基因；同源性；致病性；嗜神经性
中国病毒学000105 摘 要：测定我国人用狂犬疫苗株(aG)、减毒株(CTN-181)及两株街毒 糖蛋白(GP)基因cDNA的核苷酸序列及推导氨基酸序列。结果两株街毒仅相差两个碱基和一个氨基酸残基；两株街毒与CTN的同源性(85.9%)高于aG株(81.9%)；聚类分析将街毒和固定毒分为两支。比较GP嗜神经位点的氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位高度同源。被认为决定毒力的333位Arg，CTN发生了Q替换，其它毒株均为Arg333。所比较的毒株均存在319位糖基化位点，此外37位糖基化位点也相对保守；GP两个主要抗原表位，GⅡ的氨基酸构成完全一致，GⅢ只在一些减毒株中发生与毒力密切相关碱基的替换。
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分类号：R373.9 文献识别码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0022-12
Sequencing and Position Analysis of the Glycoprotein Gene
of Four Chinese Rabies Viruses
TANG Qing, YANG Wei-song
(Epidemiology and Microbiology Institute of National Academy
of Preventive Medicine, Beijing 102206, China)
, 百拇医药
Lillian A Orciari
(National Center for Infectious Diseases Control, 1600 Clifton Road,N.E. Atlanta, Georgia 30333, USA)
Abstract：The glycoprotein gene of human rabies vaccine strain (aG), one attenuated fixed strain (CTN-181) and two street viruses were sequenced and the amino acid sequences were deduced. The result shows that two street strains have two differences in nucleotide sequences and one in amino acid sequences, the nucleotide homology was higher compared with CTN (85.9%) than with aG (81.9 %). Phylogenetic tree divided the street strains and the laboratory strains into two branches. High amino acid sequence similarity was present between the segments of the viral GP which may function as a recognition site for AchR and the receptor-binding region of the neurotoxins; CTN strain had Q substitution at position 333 and the other virulent strains preserved 333 Arg. In all strains 319 glycosyl ation was existed, glycosylation on 37 is also relatively conserved. The amino acid constitution of antigenic site Ⅱ is identical in all compared strains, but on site Ⅲ some attenuated strains have amino acid substitution on position 333 and other sites which related with pathogenicity.
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Key words：Rabies virus; Glycoprotein; Gene; Homology; Pathogenicity; Neurotropic▲
狂犬病毒糖蛋白(GP)是嵌在病毒粒子表面形成棘状突起的结构成分，它既可以诱导宿主免疫反应产生中和抗体和刺激细胞免疫，又作为媒介使病毒吸附在宿主细胞表面进而侵入细胞，因此无论是在病毒的免疫原性或病毒的组织嗜性和毒力方面，GP都起着决定性作用。目前一些实验室固定毒株的GP基因序列测定已相继完成[1，2]。我国到目前为止仅进行过广西一只疯犬分离毒株和中国人用疫苗株(3aG和5aG)的GP基因序列测定[3，4]。通过对这些毒株的序列测定和分析已知狂犬病毒GP基因由1650个核苷酸残基组成，完整阅读框(ORF)从起始密码(ATG)到终止密码(TGA)共1575个核苷酸残基，编码524个氨基酸。流行于不同地区、不同宿主的狂犬病毒，其GP基因的变异远远大于核蛋白基因。由于GP与狂犬病的预防和致病密切相关，我国狂犬病流行严重，宿主动物种类又多，对本国分离毒株GP基因的分析和研究，有助于深入了解我国狂犬病毒致病和保护性免疫的机理，为此在对我国四株狂犬病毒GP基因序列测定的基础上进行了有关GP基因与致病性、免疫原性及组织嗜性关系的分析和研究。
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1 材料与方法
1.1 病毒 aG为中国人用地鼠肾细胞疫苗株，因分离自北京也称北京株(PG)，由中国预防医科院流研所严玉辰老师提供。CTN-181为实验室减毒株，由中国药品生物制品检定所严子林老师提供。CNX8511和CNX8601是我国宁夏省卫生防疫站收集的两例临床诊断为狂犬病的死亡病人脑组织标本，两份标本冻存于-20℃经多年后送至流研所经乳鼠脑传代，冷冻切片后用抗狂犬病毒荧光抗体染色鉴定为狂犬病毒并分离得到病毒，均为街毒。
1.2 PCR及序列反应引物 用于RT-PCR和序列反应的寡核苷酸引物，通过比较已发表的ERA株、中国广西毒株及中国人用疫苗株的序列设计合成P1-P4引物，引物941、763、93G、1444、1323、1171、989、754由美国CDC提供；采用分段PCR和分段测序的方法对4株中国狂犬病毒进行GP基因全序列测定： PCR和测序引物
引物
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序列
位置和方向
Messenger sense
941 PIMC
ACCAAGTCAGTGAGTTTCAGA
941→961
763 PIMC
AGACTTATGGATGGAACATGG
764→784
93GPIMC
ATTTACACGATACCAGACAA
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74→93
P1
TTATCACTTGTTTACCTCTGG
-142→-163
P3
GACGAAATTGAGCACCTTGTTGT
859→882
Genomic sense
1444PRIM
ACATGTCATCCAGGAAAATTAT
1432←1 444
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1323PRIM
ATTCCAACAACTCCATATG
1213←1232
1171PRIM
GCCGTCAGGTCCTAATATTAT
1151←1171
989PRIM
CTGAGACGTCTGAAACTCAC
949←969
754PRIM
AACTCCACATAACTTGAGTTT
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734←754
P2
CTCGTTCTGAACACCCAAA
673←691
P4
ACCCAAGTTATCAGGAGGACC
1644←1664
1.3 RT-PCR 用RNA分离试剂TRIZOL分离病毒RNA(按试剂说明书操作)，用正向引物逆转录合成cDNA第一链，PCR扩增cDNA，参数如下：94℃30s50℃30s，72℃1min30s，共循环40次。PCR产物经低熔点胶电泳及WizardTMPCR Preps DNA Purification System试剂盒纯化。
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1.4 双脱氧链末端终止法直接进行cDNA的核苷酸序列测定 测定引物用与PCR反应相同的引物，PCR扩增并纯化后的产物为模板，每个PCR产物分别用正向和反向两个引物从两个方向进行单链测序反应，序列测定用PRISMTMReady Reaction DyeDeo-xyTM Terminator Cycle Sequencin g Kit进行。 在总容量为20μL的测序反应中含有：9.5μL Prizm Tag Dydeoxy Terminator (包括四 种末端标记有不同波长荧光物质的双脱氧核苷：1.58μmol/L A-DyeDeoxy, 94.74μmo l/L T-DyeDeoxy, 0.42μmol/L G-DyeDeoxy, 47.37μmol/L C-DyeDeoxy; 15.79 μmol/L dNTP和0.42u/μL Tag DNA聚合酶)；2μL 1.6pmol/L引物；纯化并干燥后的 PCR产物(cDNA)约1.0μg溶在7μL H2O中作为模板；补充H2O至20μL，混均后在PCR仪上进行测序反应，反应条件：96℃30s,50℃15s,60℃4min，共循环25个周期。四种带标记的双脱氧核苷链末端终止反应均在一个反应管中进行，用373ADNA自动测序仪经10～12h电泳后直接读取核苷酸序列。
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1.5 计算机分析 将序列结果输入计算机，用Winstar软件在计算机上进行分析和比较。
2 结果
2.1 四株狂犬病毒GP基因编码区核苷酸序列和推导氨基酸的序列及其比较
计算机分析四株病毒GP基因ORF，四株病毒GP基因编码区均从起始密码ATG开始，终止密码除CTN株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基，四株病毒GP基因核苷酸序列见图1。两株街毒核苷酸序列仅在960和1535两位点相差两个碱基，与CTN及aG株相比两株街毒与CTN的同源性(85.9%)大于aG株(81.9%)。根据已发表的资料[5]，狂犬病毒GP基因可分为四个区，即：信号肽编码区(1～57位核苷酸)、膜外区(58～1374位核苷酸)、穿膜区(1375～1440位核苷酸)和膜内区(1441～1575位核苷酸)。比较四株病毒GP基因不同区段核苷酸及氨基酸序列(见表1)，膜外区同源性高于其它三个区，最低的是膜内区，氨基酸序列同源性样均大于相应区段的核苷酸序列。
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表1 G基因不同区段核苷酸和推导氨基酸序列同源性比较
Table 1 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t segments of GP genes 同源性 Homology (%)
8511/8601
8511/CTN
8601/CTN
8511/aG
8601/aG
CTN/aG
信号肽 Signal sequence
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核苷酸 Nucleaotide (%)
100
68.4
68.4
75.4
75.4
78.9
氨基酸 Amino acid (%)
100
73.7
73.7
78.9
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78.9
63.2
膜外区 Ectodomain
核苷酸 Nucleaotide (%)
99.9
87.4
87.4
84.2
84.2
84.2
氨基酸 Aminno acid (%)
100
, 百拇医药
95.4
95.4
94.3
94.3
92.5
穿膜区 Transmembrane domain
核苷酸 Nucleaotide (%)
100
78.8
78.8
74.2
74.2
, 百拇医药
68.2
氨基酸 Amino acid (%)
100
81.8
81.8
81.8
81.8
68.2
膜内区 Cytoplasmic domain
核苷酸 Nucleaotide (%)
99.3
81.5
, 百拇医药
82.2
65.9
65.9
73.3
氨基酸 Amino acid (%)
95.6
75.6
77.8
62.2
62.2
66.7
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图1 四株狂犬病毒GP基因核苷酸序列
Fig.1 Sequence of nucleotides of four rabies viruses GP genes
2.2 与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性比较
将本次测定的四株病毒GP基因编码区序列与广西毒株CGX89-1及国外一些毒株GP基因编码区 序列进行比较，同源性从50.9%到99.9%(见表2)，平均83.7%，同源性最低的是在CV S和Mokola两个毒株之间，为50.9%。明显可以看到的是Mokola株几乎和所有与其比较的毒株 同源性均很低，从50.9%(Mokola/CVS)到51.9%(Mokola/CNX8511和CNX8601)。如果不包括Mok ola株，同源性平均为87.3%。从表2还可以看到来自中国同一地区的两株街毒(CNX8511/ CNX8601：99.9%)之间和来源于同一毒株的两株兽用减毒疫苗株之间(SAD-B19/ERA：99.4%) 均表现GP基因序列高度同源。
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表2 不同狂犬病毒G基因核苷酸和氨基酸序列同源性比 较
Table 2 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t rabies viruses GP genes 同源性 Homolog (%)
8511
86 01
CTN
aG
CGX
PV
CVS
SAD
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ERA
Flury
Mokola
CNX8511
99.9
85.9
81.9
87.6
82.5
82.8
83.0
82.9
83.4
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51.9
CNX8601
99.6
86.0
81.9
87.7
82.6
82.8
83.0
83.0
83.5
51.9
CTN
, 百拇医药
92.4
92.6
82.5
92.5
81.8
81.0
82.2
82.0
82.2
51.5
aG
90.5
90.5
, 百拇医药
88.2
82.7
91.0
88.0
90.6
90.7
88.9
51.4
CGX
94.5
94.7
93.5
89.9
, 百拇医药
82.5
82.1
83.0
82.7
82.9
51.8
PV
91.6
91.8
89.0
90.5
92.0
88.3
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97.7
97.9
89.7
51.1
CVS
89.9
89.9
86.5
86.9
89.0
88.4
88.1
88.1
, 百拇医药
92.8
50.9
SAD
92.0
92.2
89.1
89.9
91.6
96.2
87.8
99.4
89.3
51.5
, 百拇医药
ERA
91.8
82.0
89.0
89.7
91.54
96.4
87.6
98.9
89.4
51.1
Flury
92.4
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92.6
89.7
89.7
92.2
91.4
89.9
90.7
90.5
51.6
Mokola
56.2
56.4
55.3
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55.3
55.8
55.6
56.0
56.6
56.0
55.3
注：核苷酸序列同源性(上方)和氨基酸序列同源性(下方)
Note. The percentages of nucleotides (top) and amino acid (bottom) similarity.2.3 聚类分析
通过计算机Clustal Method对四株检测病毒与已经发表的国内外毒株的GP基因进行聚类分析 ，绘出系统发生树状图(见图2)。从图2可以看到所有血清(基因)一型毒株形成一个分支，在 这一个分支下，中国宁夏人分离的两株毒株、广西犬毒株和CTN归于一类；其它毒株归于另 一类，即10种病毒归为两大类：实验室固定毒和街毒，这些街毒均来自于中国。CTN虽然并 非新分离的街毒，但与其它实验室固定毒相比，分离时间短，动物和细胞传代次数也少于其 它实验室固定毒，因此与中国其它街毒更接近。相比之下，其它实验室固定毒株已分离至少 50年以上，经过多种动物和细胞传代并作为疫苗株，在生物学特性上有着更多的相似性，因 此表现为相互之间有着更近的亲缘关系。Mokola是血清(基因)三型毒株，形成一个完全独立 的分支。
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图2 不同狂犬病毒GP基因系统发生 树状图
Fig.2 Phylogenetic tree of different rabies virus's GP genes
2.4 GP膜外区部分抗原位点氨基酸构成的比较和分析
2.4.1 与抗原特性和毒力有关区段的比较 狂犬病毒与中和抗体结合的主要部位是GP分子 上第三(GⅢ)和第二抗原部位(GⅡ)[6]。GⅢ大约位于第330～357位氨基酸区段，其中333位氨基酸Arg (R，精氨酸)被认为是狂犬病毒嗜神经性和毒力的关键残基，如果该部 位R被Q(谷氨酰胺)、Ⅰ(亮氨酸)或G(甘氨酸)取代，病毒的毒力将会大大降低[7] 。GⅡ大约位于34～200位氨基酸区段[8]，至少含两个主要表位：34～42和198～2 00区段。GP抗原性变化经常是因为GⅡ位点上34～42位和198～200位氨基酸以及GⅢ位点上33 0～340位氨基酸的改变造成。比较不同狂犬病毒GP氨基酸序列在这些区域的构成，结果见表3。
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表3 不同狂犬病毒GP基因GⅢ和GⅡ区氨基酸序列比较
Table 3 Amino acid sequence comparison of GⅢ and GⅡ of different rabies virus es GP genes Viruses
毒株
GⅢ
GⅡ
330～357序列
333/339位aa
34～42序列
198～20序列
8511
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KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
8601
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CTN
KSVQTWDEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
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Q/I
GCTNLSGFS
KRA
aG
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CGX
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GGCTNLSGFS
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KRA
PV
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
CVS
KSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNG
R/I
GCTNLSGFS
KRA
ERA
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KSVRTWNEILPSKGCLKVGGRCHPHVNG
R/L
GCTNLSGFS
KRA
Flurry
KSVGTWNEIIPSKGCLKVGERCHPHVNG
G/I
GCTNLSGFS
KRA
SAD
KSVRTWNEILPSKGCLKVGGRCHPHVNG
, http://www.100md.com
R/L
GCTNLSGFS
KRA
HEP
KSVQTWNEIIPSKGCLRVGERCHPHVNG
Q/I
GCTNLSGFS
KRA
CTN、SAD-B19和HEP是减毒株，Flurry和ERA株为兽用疫苗株，这些毒株在GⅢ区氨基酸 序列与其它毒株相比有所不同。其中CTN和HEP株333位的R被Q(Glu)替代，Flurry株则被G(Gl y)替代。这三株毒株都是减毒株，都在333位发生了Q或G的替换，这与以往的研究结果 [7]一致。SAD和ERA株在339位的I(Ile)被L(Leu)替代。SAD也是减毒株，ERA为兽用口 服活毒疫苗株，其毒力也较普通疫苗株低，因此推测339位的碱基是否也与毒力有关。其余 毒株中8511、8601和CGX是街毒、aG和PV株是用于生产灭活疫苗的毒株、CVS是世界标准攻击 毒 株，这些毒株均保留了毒力，在GⅢ区氨基酸序列也完全相同。以上所有毒株在GⅡ区两个表 位的结构均相同。
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2.4.2 与组织嗜性有关区段的比较 目前认为狂犬病毒在体内的细胞受体是乙酰胆碱受体( acetylcholine receptor, AchR)，因为狂犬病毒GP与AchR的一种高亲和配体——箭毒样蛇 神 经毒素有明显的结构相似性，尤其是GP第189～214位氨基酸与该毒素第二长毒性环第30～56 位的氨基酸序列[9]高度同源(50%)，这一区段正是神经毒素与AchR的结合部位， 其中Arg37是所有神经毒素中绝对保守的基团，也是神经毒素与AchR结合的重要位点。为了 证实这一推论，我们对神经毒素与AchR结合部位的氨基酸序列和狂犬病毒GP相应位置的氨基 酸序列进行了比较，结果除Mokola株外同源性达50%(见表4)。国内鹿分离的一株病毒GP膜外 区部分片段的序列测定也显示此位点的高度同源[10]。被认为是结合区域中保守 位点的Asp31、Phe33、Gly38、Lys39残基，GP也与神经毒素的完全相同。即使是序列相差较 远的Mokola株，该段序列也表现较高的同源性。表4 狂犬病毒嗜神经区段和位点的比较
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Table 4 Site and segment comparison of neuron tropism of rabies viruses 毒株 Virus
嗜神经区段
Segment of neuron tropism
嗜神经位点
Site of neuron tropism
序列：30-56/189-214
Arg37
Asp31
Phe33
Gly38
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Lys39
神经毒素
CDGFCSSRGKRIDLGCAATCPKVKPG
R
D
F
G
K
8511
CDIFVNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
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G
K
8601
CDIFVNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CTN
CDIFTNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
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D
F
G
K
aG
CDIFTNSRGKRASKGSKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CGX
CDIFTNSRGKLASKGGKTCGFVDERG
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R
D
F
G
K
中国鹿株
CDIFANSRGKRASKGTETCGFVDERG
R
D
F
G
K
PV
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CDIFVNSRGKRASKGSETCGFVDERG
R
D
F
G
K
SAD-B19
CDIFVNSRGKRASKGSKECGFVDERG
R
D
F
G
, http://www.100md.com K
ERA
CDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERG
R
D
F
G
K
Flury
CDIFTNSRGKRASKGGKTCGFVDERG
R
D
F
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G
K
HEP
CDIFTHSRGKRASKGDKTCGFVDERG
R
D
F
G
K
CVS
CDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERG
R
D
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F
G
K
Mokola
CDIFTSSSGQKAMNGSRICGFKDERG
S
D
F
G
Q
2.4.3 与糖基化位点有关区段的比较 狂犬病毒GP细胞外区域有糖基化位点，适当的糖基 化对GP的表达非常重要。目前的研究已经证实可溶性糖蛋白(Gs)只在319位有一个糖基化位 点Asn(天冬酰胺)，GP则有数个糖基化位点。不同的狂犬病毒糖基化位点的数目和位置不完 全相同[11]，但大多数有三个，其结构特点是N-X-S(Asn-X-Ser) 或N-X-T(Asn-X-Thr)，其中319位糖基化位点存在迄今已测序的所有狂犬病毒中 [12]。本研究中四株病毒GP的糖基化位点不完全相同，与其它毒株相比也有差异 ，但319位糖基化位点(N-K-T)存在于四株病毒以及所有进行比较的毒株中，只是Mokola株 在此糖基化位点的氨基酸构成上与其它毒株不完全相同(N-G-S)。此外，37位糖基化位点 存在除Mokola株外所有进行比较的毒株中。158位(CGX、PV、SAD和Flurry)和247位(CTN、aG 、PV、SAD和ERA)糖基化位点也相对比较集中。唯有与其它毒株差异较大的Mokola株在202位 有一个糖基化位点。
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3 讨论
3.1 病毒株与核苷酸序列同源性的关系
在已经测序的中国病毒中，8511和8601来自1985和1986年死亡的病人，CGX于1989年从广西 一只疯犬分离，CTN1983年分离自济南一只疯犬。四株病毒分离年代接近，8511、8601和CGX 都是街毒。单克隆抗体分析表明8511和8601是犬毒株，CGX和CTN原本分离自犬，因此这四株病毒的宿主动物是一致的。aG株是1935年从北京一只狂犬分离的，至今已经历了60多年的实验室动物和细胞传代，成为人用疫苗株，其生物学性状已经发生了很大变化。因此无论是核苷酸序列或氨基酸序列，三株街毒与CTN的同源性(核苷酸：85.9%～99.9%，氨基酸：92.4%～99.8%)高于同aG株(核苷酸：81.9%～82.7%；氨基酸：88.2%～90.5%)相比。将我国病毒GP序列与国外血清Ⅰ型一些固定毒株进行比较，氨基酸序列同源性均高于核苷酸序列同源性。CVS源于法国狂犬病牛的病毒，目前作为具有较强毒力的国际标准攻击毒株，CTN与CVS无论从宿主来源还是后来的传代过程都不相同，两者在毒力及实际应用上也有很大差异，因此基因结构相距较远也不奇怪。ERA和SAD-B19都是兽用疫苗株，其中SAD-B19是减毒株，但两个毒株来源一致，所以具有很高的同源性。另外还可以看到的是疫苗株之间同源性高，即使是在中国和欧美疫苗株之间也表现较高的同源性：核苷酸序列同源性为88.9%(aG/Flury)～99.4%(ERA/SAD-B19)。能够筛选作为疫苗株的毒株在产生保护性免疫的作用上应有共同之处，因此疫苗株可能会在抗原结构上有更多的相同之处，基因结构也较接近。将所有这些毒株与血清型不同的Mokola株(血清型Ⅲ)相比，则核苷酸(50.9%～51.9%)和氨基酸(55.3%～56.2%)序列都有很大差异，从中不难理解血清Ⅰ型的疫苗株对血清Ⅲ型的Mokola株基本没有保护作用的原因。由此可以看到生物学性状相近的毒株，基因结构也相近。
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3.2 GP结构与保护性免疫的关系
电镜研究已经证实在病毒表面的狂犬病毒GP以一种三聚体形式存在。许多具有受体识别和膜融合特性的病毒，其外膜蛋白也都以同样形式存在，这可能在生物学上有其重要性，也可能反应与受体识别和膜融合特性有关机制的相似性。虽然随着时间的推移，描述狂犬病毒GP抗原位点的数目有所增加，但能够解释得比较明确的只有抗原位点GⅠ、GⅡ和GⅢ。GⅠ是只含有一个表位的独立位点。GⅡ是一不连续的构象依赖性抗原区，位于34～200区段，其中主要两个表位在34～42和198～200区段；GⅢ大致位于330～357区段，其中与抗原性关系最大的为第333、336、339和357位残基。虽然GⅢ由更为连续的表位组成，但与GⅢ结合的单抗不能识别其非折叠状态，表明这些氨基酸在蛋白表面有一定的立体结构。此外264位R(Arginine)被H(Histidine)取代和44位M(Methionine)被Ⅰ(Isoleucine)取代也可以使GP抗原性有所改变。从我们测序推导的氨基酸序列来看，四株病毒中两株固定毒(CTN和aG)264位是H而两株街毒(8511和8601)264位是R。减毒株CTN同时还有与毒力密切相关的333位R(Arginine)和336位N(Asparagine)被Q(Glutamine)和D(Asparticacid)所替代(见表3)。比较国际毒株，Flury和HEP也在333位发生了G(Glycine)和Q替换。三株减毒株都在333位发生了氨基酸残基的替换，而街毒以及其它保留了原有毒力的固定毒株在此位点仍为R残基，由此看来333Arg是决定狂犬病毒毒力的一个主要位点。另外，在认为与抗原性关系较大的339位，ERA和SAD株由L(Leucine)替代了Ⅰ。这两个毒株均为兽用活毒苗株，并且SAD是减毒株，因此339位可能也与病毒的毒力有关。在GⅡ区氨基酸序列，所有比较的毒株全部一致，说明GⅡ比GⅢ区保守。
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3.3 GP结构与组织嗜性的关系
狂犬病毒的增殖基本限于神经细胞内。由于GP189～214位氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位的序列高度同源，抗MAb-G独特型抗体也能与一些脑组织结构结合，因此曾推测GP有烟酸型乙酰胆碱受体(nAChR)作为狂犬病毒的受体。但仍然不清楚的是这种相互作用是否能引起病毒入侵。Christine等[13]用重组杆状病毒在昆虫细胞表面表达CVS株GP(Gcvs-Sf2)来研究GP与神经细胞之间的结合，发现几种有不同神经介质的哺乳动物神经细胞均可使狂犬病毒侵入，胆碱能和肾上腺素能神经瘤细胞都有Gcvs-Sf2结合位点的表达，提示在神经介质分泌和狂犬病毒特异性结合位点的表达之间没有关系。此外，狂犬病毒还可以感染没有nAChR的神经原，因此可能还有别的分子作为狂犬病毒的受体。研究还发现GP330或333位的单个突变既不能破坏Gcvs-Sf2与神经细胞的结合，也不能影响肌肉接种狂犬病毒后感觉和运动神经原的感染。但330和333两个位点变化后都会大大降低Gcvs-Sf2对神经细胞的亲和能力，也失去感染感觉和运动神经原的能力。体外实验狂犬病毒CVS株和CVS无毒变异株均可感染神经瘤细胞。Hanham等[14]推测狂犬病毒有两种类型的受体：高亲和力受体，只存在于神经细胞表面造成动物神经原的感染；低亲和力受体，存在于各种神经或非神经细胞表面。这种普遍存在的低亲和力受体在细胞表面高密度存在，并且可以包括BHK细胞表面饱和状态的结合位点。除此之外，磷脂[15]、糖脂和神经节苷脂[16]及蛋白也是狂犬病毒的受体，所以神经原表面的高亲和力受体的特性有待进一步阐明。但狂犬病毒GP第189～214位氨基酸与α-环蛇毒素同nAChR结合部位的氨基酸序列高度同源在本研究中也得到了证实(见表4)，尤其值得提出的是核苷酸和氨基酸序列同源性与血清Ⅰ型毒株相比都很低的Mokola株，在嗜神经位点上也表现有一定的同源性。可见nAChR学说可以解释狂犬病毒嗜神经特性的大部分特点，但它不是狂犬病毒与靶细胞表面作用的唯一方式。
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3.4 街毒和固定毒GP的变异
有关狂犬病毒GP的研究绝大多数来自对固定毒的分析，这些病毒已经有过很长的实验室动物或细胞传代的历史。由于RNA病毒突变率高，即使是在单一种群中也表现出很大的序列差异，所以从实验室固定毒得到的序列很难反应一个易变种群的真实变异情况。抗GPⅢ单抗筛选出来的实验室突变株失去了对成年鼠的神经毒能力[17]，这种毒力丧失总是与333位R(Arg)发生突变有关。这种突变株毒力的恢复常常是由于333位R或较少见的L的恢复所致。333位R的存在是否狂犬病街毒毒力绝对必需，一些街毒与GPⅢ特异性单抗反应阴性，这种情况可能与在GP结构上的其它差异所致，因此这些街毒仍保留有致病力。高度致神经毒的Mokola株与固定毒GP只有58%序列同源性，333位残基是D，但这是经过细胞培养适应后的序列，不能代表原有的序列。Benmansour等[18]对从阿尔及利亚死亡犬和犬伤病人分离的两株病毒直接进行GP测序，结果两株病毒仅有11个核苷酸、5个氨基酸不同，并都有333位R残基。人分离毒株经细胞传代数次后再次测序，结果发生4个核苷酸的变异，并产生了3个氨基酸的变异(298，326和333位)，其中333位Gln替代R导致了对GⅢ特异性单抗反应的阴性。用未发生变异的两株街毒接种成年鼠均显示特征性狂犬病症状，在同样条件下用发生了333位变异的毒株接种成年鼠，20%的鼠潜伏期延长，并且肌肉途径注射致病性降低了20倍。这表明抗原部位的变异不一定仅是免疫选择的结果，也可以由其它选择压力如特异性宿主的适应所造成。实验室毒株中，333位的变异总是与逃避GⅢ特异性单抗的中和以及丧失对成年鼠的致病性有关。结合本研究，CTN、Flury和HEP三株减毒株均表现333位的变异和对成年鼠不致病。但其它实验室毒株也经过多次细胞传代却保持了Arg333，提示组织特异性的分子基础是相当复杂的。比较中国的五株病毒，无论是核苷酸和氨基酸序列同源性及GP基因上一些特殊位点的构成都可以看出街毒与固定毒之间有一定差距。聚类分析绘出的种系发生树也将街毒和固定毒分为两个分支，可见街毒和固定毒之间在基因结构及亲源关系上都有一定的距离。由于疫苗株是固定毒，街毒和固定毒之间的差异会使我们想到已经延用了几十年的疫苗株是否会对随着时间和空间的不同而变化着的街毒始终有足够的保护作用从我们目前的研究还不能作出任何结论，但可以肯定的是街毒和实验室固定毒，包括疫苗株之间存在着抗原结构和基因结构上的差异。■
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基金项目：本研究系WHO资助课题
作者简介：唐青(1955-)，女，蒙族，内蒙赤峰人，副研究员，医学博士，研究方向：分子病毒学。
参考文献：
[1]Anilionis A, Wunner WH, Curtis PJ. Structure of the glycoprotein gene in rabies virus[J]. Nature, 1981,294,275～278
[2]Conzelmann KK, Cox JH, Schneider LG et al. Molecular cloning and comp lete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19 [J]. Virology, 199 0,175:485～499
, http://www.100md.com
[3]温冷，明文玉，朱家鸿等.中国狂犬病毒疫苗株(5aG株)糖蛋白的克隆与序列分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，1995，9(3)：198～201
[4]Bai Xianhe, Cynthia K Warner, Makonnen Fekadu. Comparisions of nucleotide and deduced amino acid sequences of the glycoprotein genes of a Chinese street strain (CGX89-1) and a Chinese vaccine strain (3aG) of rabies virus [J]. Virus Research, 1993,27:101～112
[5]Anilionis A, William HW, Peter JC. Structure of the glycoprotein gene in rabies virus[J].Nature 1981,294(5838):275～278
, 百拇医药
[6]Lafon M, L Edelman, JP Bouvet et al. Human monoclonal antibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein [J]. J Gen Virol, 1990,7 1:1689～1696
[7]Sief L, Coulon P, Rollin PE et al. Rabies virulence: effect on pathog enicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antige nicsite Ⅲ of the glycoprotein[J]. J Virol, 1985,53(3)926～934
[8]Benmansour A H, Leblois H, Coulon C et al. Antigenicity of rabies virus glycoprotein[J]. J Virol, 1991,65:4198～4203
, 百拇医药
[9]Lentz TL, Wilson P T, Hawrot E et al. Amino acid sequence similarity between rabies virus glycoprotein and snake venom curaremimetic neurotoxins[J].Science, 1984,226:847～848
[10]钱爱东，侯世宽，张茂林等.狂犬病病毒糖蛋白基因主要功能区的克隆和序列比较分析[J].中国兽医学报，1996，16(6)：554～560
[11]Wunner WH, Dietzschold B, Smith CL et al. Antigenic variants of CVS rabies virus with altered glycosylation sites[J]. Virology，1985,140:1～12
[12]Rose JK, Doolittle RF, Anilionis A et al. Homolgy between the glyco proteins of vesicular stomatitis virus and rabies virus[J]. J Virology, 1982, 43:361～364
, http://www.100md.com
[13]Tuffereau C, Benejean J, Alfonso AM et al. Neuronal cell surface molecules mediate specific bonding to rabies virus glycoprotein expressed by a recombin ant baculovirus on the surfaces of lepidopteran cells [J]. J Virol，1998，72(2)：1085～1091
[14]Hanham CA, Zhao F, Tignor GH, Evidence from the anti-idiotypic network that the acetylcholine receptor is a rabies virus receotor[J]. J Virol, 1993, 67:530～542
[15]Superti F, L Seganti, H Tsiang et al. Role of phospholipids in rhabd ovirus attachment to CER cell[J]. Arch Virol, 1984,81:321～328
, 百拇医药
[16]Superti F, Hauttecoeur B, Morelec MJ et al. Involvement of ganglios ides in rabies virus infection [J]. J Gen Virol, 1986,67:47～56
[17]Coulon P, Rolin P E, Aubert M et al. Molecular basis of rabies virus virulence. I. Selection of avirulent mutants of the CVS strain with anti-G mon oclonal antibodies[J]. J Gen Virol, 1982,61:97～100
[18]Benmansour A, Brahimi M, Tuffereau C et al. Rapid sequence evolution of street rabies glycoprotein is related to the highly heterogeneous nature of the viral population[J]. Virology, 1992, 187:33～45
收稿日期：1998-11-13
修稿日期：1999-02-01, 百拇医药