研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜试验模型的应用
作者：张树成 吴志奎 王 蕾 王弘毅 王介东
单位：
张树成 王弘毅 王介东(国家计划生育委员会科学技术研究所 北京 100081)；吴志奎 王 蕾(中国中医研究院广安门医院 北京 100053)
关键词：血管生成；鸡胚；试验模型
中国中医基础医学杂志990507 摘 要 目的 建立研究中药血管生成活性和作用的实验模型并进行初步应用。方法 将服用中药后的动物血清、组织匀浆、生药等被测物置于鸡胚绒毛尿囊膜(Chicken Chorioallantoic Membrane, CAM)表面的不同载体上，被测物作用3d后制取CAM标本，显微镜下计数血管生成数目。结果 不同被测物均可在CAM模型完成观察，6种载体中研究血管生成抑制和促进作用应分别选择明胶海棉和羧甲基纤维素、微孔滤膜。结论 中药具有的血管生成活性和作用应引起重视。
, 百拇医药
Application of chicken chorioallantoic membrane as a model for study of
effects of chinese medicine on angiogensis
Zhang Shucheng, Wu Zhikui, Wang Lei, Wang Hongyi, Wang Jiedong
(National Research Institute for Family Planning, Beijing 100081 and Guang Anmen Hospital,Chinese Medical research Institute of Sinica, Beijing 100053)
Abstract: Objec:Angiogensisi plays an important role in phyisological and pathological process of body and is a hot field of research inernationally.Present works introduce chicken chorioallantoic membrane (CAM) model into traditional chinese medical research.It is suggested that we should pay attention to angiogenic activity and effect of herb medicine.
, 百拇医药
Key words:experimental model, chicken chorioallantoic membrane, angiogenesis
血管生成是指从已存在的血管中生成新毛细血管的过程。体内大部分血管在发育完全后保持高度的稳定性，其血管生成缓慢且难以觉察。但是，在创伤修复、周期子宫内膜和一些疾病等生理、病理情况中，存在着活跃的血管生成。在牛皮癣、肿瘤、风湿病、视网膜眼底病等状态下，血管生成失控是导致疾病发生的关键，这些疾病可称为血管生成病。血管生成在血管生成病和其他一些相关疾病，如胶元病、缺血性脑栓塞、骨伤、白内障、冠心病、甲状腺病变等的治疗、恢复和预后中，均具有重要意义。中医中药治疗这些疾病具有明确的作用，其机理是否与血管生成有关，这是我们建立CAM模型的目的所在，旨在研究中药血管生成活性和作用的特点。
研究血管生成问题，主要有动物角膜囊(眼前房)、动物颊囊和鸡胚CAM三种模型。这些动物模型，早在40～60年代就已建立[1～5]。前两种模型，是在动物体上进行观察，有诸多不便，无法同时进行大样本实验，操作技术要求高，而CAM最为理想。
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利用CAM模型进行研究，国内主要集中于肿瘤、生殖等方面[6～10]，至今未见在中医药学方面应用的文献报告。
1 CAM模型的建立
1.1 种蛋的选择
选择白皮种蛋(如北京白鸡)，表面清洁，蛋壳均质，每蛋50克～65克，蛋形规范，气室、气孔均匀。种蛋来源于受精率>90%的种鸡场。
1.2 种蛋的消毒
种蛋用温水清洗2次后，于1∶1000新洁尔灭液中浸泡3分钟，或甲醛熏蒸，1∶1000碘液浸泡1分钟。
1.3 种蛋的孵育
种蛋孵育于普通培养箱中效果好于CO2培养箱。温度37.8±0.5℃，培养箱中放入水盘以保持湿度在40%～60%，要有通气孔。
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1.4 孵育中的转蛋
鸡孵蛋过程中不停地转蛋，可防止胚胎发生粘连，促进羊膜运动。种蛋钝端(大头端)向上，呈45°倾斜，每天转蛋至少2～4次。
1.5 鸡胚的检查
自制照蛋灯，使用聚光射灯光源。每日检查胚胎发育情况，识别胚胎发育的标志特征[11]，随时淘汰死弱精蛋和死胎及胚胎发育不良的种蛋。
1.6 假气室的制备
孵蛋第6d～7d，用碘伏和酒精消毒蛋壳表面2×3cm区域，用牙科钻或砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕，用尖针在蛋气室表面扎1小洞，在凹痕处滴少量生理盐水，用针轻揭凹陷处蛋皮，轻轻撕掉内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室(区别于蛋自身的气室)。制备假气室时切勿损伤CAM。用透明胶带纸封贴假气室，形成透明观察窗，可供观察和加药操作。
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1.7 实验操作程序
制备假气室后胚胎应稳定1d～2d。实验时需先期准备好各种被测物，轻轻撕开透明胶带纸，由此加入载体、被测物或药物。为保证被测物在CAM上集中于载体上，可根据被测物性质选择不同载体。检测结束后(一般加被测物3天)，由观察窗加入甲醇：丙酮=1∶1的固定液预固定15min，去掉鸡胚，取下CAM并与蛋皮分离，完成后固定，将CAM平铺在平板或滤纸上，可长期保存。
2 CAM试验中载体的选择
2.1 载体的处理
选择6种载体进行比较：快速和中速定性滤纸、擦镜纸、混合纤维素微孔滤膜(0.45μ)4种，用打孔器制成直径5mm圆片，湿热高压消毒，无菌水浸洗2次备用；明胶海绵由无菌包装中取出，无菌条件下制成5mm直径圆片，无菌水浸泡2次备用；M-450羧甲基纤维素配成1%溶液，9磅10min湿热灭菌后平铺在玻璃板上，60℃烤干，无菌制成直径5mm圆片备用。
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2.2 载体的比较
将6种载体置于孵育7d的鸡胚CAM表面，由假气室操作。继续孵育3d ，制备CAM血管标本，解剖镜下观察载体边缘1mm内血管数目，分析血管生成表现。结果见表。
表1 载体的选择
CAM血管数目(条)
大血管
中血管
细小血管
大中血管
中小血管
血管总数
明胶海绵
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24.7*
21.4*
99.1*
46.1*
120.5*
145.3*
快速定性滤纸
8.2
10.3
65.8
18.5
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76.0
84.2
中速定性滤纸
6.6
8.3
59.9
14.7
68.2
74.8
檫镜纸
8.1
11.5
65.6
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19.6
77.1
85.2
混合纤维素滤膜
4.8
6.8
45.6
11.6
52.4
57.2
羧甲基纤维素膜
4.3
10.6
, 百拇医药
49.1
15.0
59.7
64.0
注：* 与其他各组比较：P<0.01～0.001。
6种载体引发的血管生成表现均无特异性，特异性放射状血管程度低或无，以非特性的贯穿、杂乱、包绕、叶脉样、平行等表现形式为主，显示载体自身无诱发特异性放射状血管生成的作用。
6种载体的血管数目以微孔滤膜最低，依次为羧甲基纤维素、中性定性滤纸和快速定性滤纸、擦镜纸，以明胶海绵最高。表明研究血管生成抑制作用选择明胶海绵为好，研究血管生成促进作用应选择羧甲基纤维素和微孔滤膜。微孔滤膜自身不透明，而羧甲基纤维素透明，选择后者有利于观察分析。
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3 CAM模型检测中药血管生成活性和作用的方法
3.1 血清学检测方法
根据研究目的，选择不同实验动物模型，给予中药，制备动物血清。将动物血清滴于CAM表面放置的载体上，分析服用中药动物血清的血管生成和作用，根据动物给药分组进行比较分析。动物血清可滴于载体上，也可将载体浸泡于血清后放置于CAM表面，滴加血清可1至数次。
3.2 组织匀浆检测方法
动物服用中药后，根据归经理论，选取动物脏器、组织进行匀 浆处理。将组织匀浆滴于CAM表面载体上，以检测服用中药动物不同组织的匀浆所具有的血管生成活性和作用。
3.3 冰冻切片方法
将服用中药动物的不同组织，在恒冷箱进行原冰冻切片，直接将冰 冻切片铺展于CAM表面，观察该组织的血管生成活性和作用。本方法可与组织形态学、形态计量学技术相结合，与免疫细胞组织化学方法相结合可更深入地进行研究。
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3.4 冷冻真空干燥技术应用
血清和组织匀浆，可进行冷冻真空干燥，得到固态粉剂，再完成CAM试验。可进行定量分析和深入研究。
3.5 组织在体培养方法
组织种植于CAM表面，组织可在CAM上生长。组织生长的条件是CAM血管与组织发生联系，组织具有促进、刺激CAM血管趋向生长的作用。服用中药动物组织种植于CAM表面，并外源性给予中药，将对CAM产生不同影响，以分析血管生成活性和作用。
3.6 生药材的检测
最好选择道地生药材进行。原产药材经加工清洗干燥后，选择同样大小的薄片，直接置于CAM表面。对照组药材，选择同样大小、经醇提水提后完成。
3.7 中药纯品、有效成分的检测
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已明确的中药有效成分或纯品，制成不同浓度溶液，直接滴于CAM表面的载体上完成实验。
3.8 中药方剂、饮片、胶囊等的检测
可将复方制成小丸，直接置于CAM表面完成实验。对照药可选择中药提取后的残渣进行。
4 CAM血管生成活性和作用的观察指标
4.1 CAM血管生成的特异性
CAM自然状态的血管生长呈叶脉样。以实验部位为中心，呈放射状生长的血管网，或具有明确趋向性血管生长区，为具有特异性血管生长。非特异性血管生长形式有包绕、杂乱、贯穿、平行、围绕等(见附图)。
图1 CAM表面的载体
, 百拇医药
(可见载体周围的血管生成表现)
4.2 CAM血管生成的计数
解剖镜下相同放大倍数计数血管，根据直径分为大、中、小三种血管。以实验部位边缘1mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管，一、二级管血管分别观察分析。血管计数可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成。
本文简单介绍了研究中药血管生成活性和作用的CAM模型的有关内容，目的在于为评价中药是否具有直接和(或)间接的血管生成活性和作用，建立一种简便、快速、有效并可同时进行大样本的实验方法，并可与其他技术方法结合。
血管生成研究已引起学者们的高度重视，中医药研究领域应进行此方面的研究工作。目前，首先应该明确的课题是，临床具有很好治疗血管生成病的中药，是否直接和(或)间接具有促进、抑制血管生成活性和作用，并深入进行中药的血管生成促进因子、抑制因子样作用的研究。总之，进行中药血管生成课题的研究具有重要意义。
, 百拇医药
作者简介：张树成，男，37岁，助理研究员，现在国家计划生育委员会科学技术研究所从事促排卵中药与子宫内膜反应性的分子基础研究。
参考文献
[1] Markee, JE.Menstruation in intraocular endometrial transplants in the rhesus monkey. Embryol, Carnegie Institute, Washingto, 1940; 28:219
[2] Leighton, J.Invasion and metastasis of heterologous tumors in the chick embryo. In“Progress. Experimental Tumor Research”. 1964；14：98
[3] Cameron T.et al. The endocrine requirements for implantation and early embryogenesis in women. J Reprod Fert. 1988; 36(1):17
, http://www.100md.com
[4] 袁冬，吴燕婉，宗书东.兔眼前房子宫内膜自体移植模型的研究.解剖学报 1994；25：102
[5] 祝城.人子宫内膜在体培养的动物模型.生殖与避孕 1984；4：31
[6] 张月桂，韩立群，刘旭，等.肿瘤血管生成模型的建立，哈尔滨医科大学学报 1995；29：102
[7] 沈先荣，贾福星，于志洁，等.软骨血管生成抑制因子抑制血管生成的研究.生物化学与生物物理进展 1995；22：237
[8] 姜志钢.鄂征.鸡胚绒毛尿囊膜检测肿瘤促血管生成作用改良技术方法.解剖学杂志 1989；12：142
[9] 付生法，陆应鳞，张朝山，等.检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术.军事医学科学院院刊 1993;17:294
[10] 王介东，张树成，王弘毅，等.人蜕膜和绒毛膜组织在CAM的种植和在体培养观察.生殖与避孕 1998；18：22
[11] 张树成，王弘毅，许如华，等. 生殖器官鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型的建立.生殖医学杂志 1998；7：105
(收稿日期 1999—01—14 修回日期 1999—03—25), 百拇医药
单位：
张树成 王弘毅 王介东(国家计划生育委员会科学技术研究所 北京 100081)；吴志奎 王 蕾(中国中医研究院广安门医院 北京 100053)
关键词：血管生成；鸡胚；试验模型
中国中医基础医学杂志990507 摘 要 目的 建立研究中药血管生成活性和作用的实验模型并进行初步应用。方法 将服用中药后的动物血清、组织匀浆、生药等被测物置于鸡胚绒毛尿囊膜(Chicken Chorioallantoic Membrane, CAM)表面的不同载体上，被测物作用3d后制取CAM标本，显微镜下计数血管生成数目。结果 不同被测物均可在CAM模型完成观察，6种载体中研究血管生成抑制和促进作用应分别选择明胶海棉和羧甲基纤维素、微孔滤膜。结论 中药具有的血管生成活性和作用应引起重视。
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Application of chicken chorioallantoic membrane as a model for study of
effects of chinese medicine on angiogensis
Zhang Shucheng, Wu Zhikui, Wang Lei, Wang Hongyi, Wang Jiedong
(National Research Institute for Family Planning, Beijing 100081 and Guang Anmen Hospital,Chinese Medical research Institute of Sinica, Beijing 100053)
Abstract: Objec:Angiogensisi plays an important role in phyisological and pathological process of body and is a hot field of research inernationally.Present works introduce chicken chorioallantoic membrane (CAM) model into traditional chinese medical research.It is suggested that we should pay attention to angiogenic activity and effect of herb medicine.
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Key words:experimental model, chicken chorioallantoic membrane, angiogenesis
血管生成是指从已存在的血管中生成新毛细血管的过程。体内大部分血管在发育完全后保持高度的稳定性，其血管生成缓慢且难以觉察。但是，在创伤修复、周期子宫内膜和一些疾病等生理、病理情况中，存在着活跃的血管生成。在牛皮癣、肿瘤、风湿病、视网膜眼底病等状态下，血管生成失控是导致疾病发生的关键，这些疾病可称为血管生成病。血管生成在血管生成病和其他一些相关疾病，如胶元病、缺血性脑栓塞、骨伤、白内障、冠心病、甲状腺病变等的治疗、恢复和预后中，均具有重要意义。中医中药治疗这些疾病具有明确的作用，其机理是否与血管生成有关，这是我们建立CAM模型的目的所在，旨在研究中药血管生成活性和作用的特点。
研究血管生成问题，主要有动物角膜囊(眼前房)、动物颊囊和鸡胚CAM三种模型。这些动物模型，早在40～60年代就已建立[1～5]。前两种模型，是在动物体上进行观察，有诸多不便，无法同时进行大样本实验，操作技术要求高，而CAM最为理想。
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利用CAM模型进行研究，国内主要集中于肿瘤、生殖等方面[6～10]，至今未见在中医药学方面应用的文献报告。
1 CAM模型的建立
1.1 种蛋的选择
选择白皮种蛋(如北京白鸡)，表面清洁，蛋壳均质，每蛋50克～65克，蛋形规范，气室、气孔均匀。种蛋来源于受精率>90%的种鸡场。
1.2 种蛋的消毒
种蛋用温水清洗2次后，于1∶1000新洁尔灭液中浸泡3分钟，或甲醛熏蒸，1∶1000碘液浸泡1分钟。
1.3 种蛋的孵育
种蛋孵育于普通培养箱中效果好于CO2培养箱。温度37.8±0.5℃，培养箱中放入水盘以保持湿度在40%～60%，要有通气孔。
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1.4 孵育中的转蛋
鸡孵蛋过程中不停地转蛋，可防止胚胎发生粘连，促进羊膜运动。种蛋钝端(大头端)向上，呈45°倾斜，每天转蛋至少2～4次。
1.5 鸡胚的检查
自制照蛋灯，使用聚光射灯光源。每日检查胚胎发育情况，识别胚胎发育的标志特征[11]，随时淘汰死弱精蛋和死胎及胚胎发育不良的种蛋。
1.6 假气室的制备
孵蛋第6d～7d，用碘伏和酒精消毒蛋壳表面2×3cm区域，用牙科钻或砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕，用尖针在蛋气室表面扎1小洞，在凹痕处滴少量生理盐水，用针轻揭凹陷处蛋皮，轻轻撕掉内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室(区别于蛋自身的气室)。制备假气室时切勿损伤CAM。用透明胶带纸封贴假气室，形成透明观察窗，可供观察和加药操作。
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1.7 实验操作程序
制备假气室后胚胎应稳定1d～2d。实验时需先期准备好各种被测物，轻轻撕开透明胶带纸，由此加入载体、被测物或药物。为保证被测物在CAM上集中于载体上，可根据被测物性质选择不同载体。检测结束后(一般加被测物3天)，由观察窗加入甲醇：丙酮=1∶1的固定液预固定15min，去掉鸡胚，取下CAM并与蛋皮分离，完成后固定，将CAM平铺在平板或滤纸上，可长期保存。
2 CAM试验中载体的选择
2.1 载体的处理
选择6种载体进行比较：快速和中速定性滤纸、擦镜纸、混合纤维素微孔滤膜(0.45μ)4种，用打孔器制成直径5mm圆片，湿热高压消毒，无菌水浸洗2次备用；明胶海绵由无菌包装中取出，无菌条件下制成5mm直径圆片，无菌水浸泡2次备用；M-450羧甲基纤维素配成1%溶液，9磅10min湿热灭菌后平铺在玻璃板上，60℃烤干，无菌制成直径5mm圆片备用。
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2.2 载体的比较
将6种载体置于孵育7d的鸡胚CAM表面，由假气室操作。继续孵育3d ，制备CAM血管标本，解剖镜下观察载体边缘1mm内血管数目，分析血管生成表现。结果见表。
表1 载体的选择
CAM血管数目(条)
大血管
中血管
细小血管
大中血管
中小血管
血管总数
明胶海绵
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24.7*
21.4*
99.1*
46.1*
120.5*
145.3*
快速定性滤纸
8.2
10.3
65.8
18.5
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76.0
84.2
中速定性滤纸
6.6
8.3
59.9
14.7
68.2
74.8
檫镜纸
8.1
11.5
65.6
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19.6
77.1
85.2
混合纤维素滤膜
4.8
6.8
45.6
11.6
52.4
57.2
羧甲基纤维素膜
4.3
10.6
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49.1
15.0
59.7
64.0
注：* 与其他各组比较：P<0.01～0.001。
6种载体引发的血管生成表现均无特异性，特异性放射状血管程度低或无，以非特性的贯穿、杂乱、包绕、叶脉样、平行等表现形式为主，显示载体自身无诱发特异性放射状血管生成的作用。
6种载体的血管数目以微孔滤膜最低，依次为羧甲基纤维素、中性定性滤纸和快速定性滤纸、擦镜纸，以明胶海绵最高。表明研究血管生成抑制作用选择明胶海绵为好，研究血管生成促进作用应选择羧甲基纤维素和微孔滤膜。微孔滤膜自身不透明，而羧甲基纤维素透明，选择后者有利于观察分析。
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3 CAM模型检测中药血管生成活性和作用的方法
3.1 血清学检测方法
根据研究目的，选择不同实验动物模型，给予中药，制备动物血清。将动物血清滴于CAM表面放置的载体上，分析服用中药动物血清的血管生成和作用，根据动物给药分组进行比较分析。动物血清可滴于载体上，也可将载体浸泡于血清后放置于CAM表面，滴加血清可1至数次。
3.2 组织匀浆检测方法
动物服用中药后，根据归经理论，选取动物脏器、组织进行匀 浆处理。将组织匀浆滴于CAM表面载体上，以检测服用中药动物不同组织的匀浆所具有的血管生成活性和作用。
3.3 冰冻切片方法
将服用中药动物的不同组织，在恒冷箱进行原冰冻切片，直接将冰 冻切片铺展于CAM表面，观察该组织的血管生成活性和作用。本方法可与组织形态学、形态计量学技术相结合，与免疫细胞组织化学方法相结合可更深入地进行研究。
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3.4 冷冻真空干燥技术应用
血清和组织匀浆，可进行冷冻真空干燥，得到固态粉剂，再完成CAM试验。可进行定量分析和深入研究。
3.5 组织在体培养方法
组织种植于CAM表面，组织可在CAM上生长。组织生长的条件是CAM血管与组织发生联系，组织具有促进、刺激CAM血管趋向生长的作用。服用中药动物组织种植于CAM表面，并外源性给予中药，将对CAM产生不同影响，以分析血管生成活性和作用。
3.6 生药材的检测
最好选择道地生药材进行。原产药材经加工清洗干燥后，选择同样大小的薄片，直接置于CAM表面。对照组药材，选择同样大小、经醇提水提后完成。
3.7 中药纯品、有效成分的检测
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已明确的中药有效成分或纯品，制成不同浓度溶液，直接滴于CAM表面的载体上完成实验。
3.8 中药方剂、饮片、胶囊等的检测
可将复方制成小丸，直接置于CAM表面完成实验。对照药可选择中药提取后的残渣进行。
4 CAM血管生成活性和作用的观察指标
4.1 CAM血管生成的特异性
CAM自然状态的血管生长呈叶脉样。以实验部位为中心，呈放射状生长的血管网，或具有明确趋向性血管生长区，为具有特异性血管生长。非特异性血管生长形式有包绕、杂乱、贯穿、平行、围绕等(见附图)。
图1 CAM表面的载体
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(可见载体周围的血管生成表现)
4.2 CAM血管生成的计数
解剖镜下相同放大倍数计数血管，根据直径分为大、中、小三种血管。以实验部位边缘1mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管，一、二级管血管分别观察分析。血管计数可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成。
本文简单介绍了研究中药血管生成活性和作用的CAM模型的有关内容，目的在于为评价中药是否具有直接和(或)间接的血管生成活性和作用，建立一种简便、快速、有效并可同时进行大样本的实验方法，并可与其他技术方法结合。
血管生成研究已引起学者们的高度重视，中医药研究领域应进行此方面的研究工作。目前，首先应该明确的课题是，临床具有很好治疗血管生成病的中药，是否直接和(或)间接具有促进、抑制血管生成活性和作用，并深入进行中药的血管生成促进因子、抑制因子样作用的研究。总之，进行中药血管生成课题的研究具有重要意义。
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作者简介：张树成，男，37岁，助理研究员，现在国家计划生育委员会科学技术研究所从事促排卵中药与子宫内膜反应性的分子基础研究。
参考文献
[1] Markee, JE.Menstruation in intraocular endometrial transplants in the rhesus monkey. Embryol, Carnegie Institute, Washingto, 1940; 28:219
[2] Leighton, J.Invasion and metastasis of heterologous tumors in the chick embryo. In“Progress. Experimental Tumor Research”. 1964；14：98
[3] Cameron T.et al. The endocrine requirements for implantation and early embryogenesis in women. J Reprod Fert. 1988; 36(1):17
, http://www.100md.com
[4] 袁冬，吴燕婉，宗书东.兔眼前房子宫内膜自体移植模型的研究.解剖学报 1994；25：102
[5] 祝城.人子宫内膜在体培养的动物模型.生殖与避孕 1984；4：31
[6] 张月桂，韩立群，刘旭，等.肿瘤血管生成模型的建立，哈尔滨医科大学学报 1995；29：102
[7] 沈先荣，贾福星，于志洁，等.软骨血管生成抑制因子抑制血管生成的研究.生物化学与生物物理进展 1995；22：237
[8] 姜志钢.鄂征.鸡胚绒毛尿囊膜检测肿瘤促血管生成作用改良技术方法.解剖学杂志 1989；12：142
[9] 付生法，陆应鳞，张朝山，等.检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术.军事医学科学院院刊 1993;17:294
[10] 王介东，张树成，王弘毅，等.人蜕膜和绒毛膜组织在CAM的种植和在体培养观察.生殖与避孕 1998；18：22
[11] 张树成，王弘毅，许如华，等. 生殖器官鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型的建立.生殖医学杂志 1998；7：105
(收稿日期 1999—01—14 修回日期 1999—03—25), 百拇医药