高效液相色谱法测定外用培氟沙星软膏后兔皮肤中药物浓度
作者：邱银生 周祖坤 潘经媛 李小明 朱式欧
单位：湖北省医药工业研究院 武汉430061
关键词：HPLC；培氟沙星软膏；皮肤药物浓度
数理医药学杂志990232
摘要 采用高效液相色谱法(HPLC)测定了外用培氟沙星软膏后兔用药部位皮肤中药物浓度，薄涂0.75%软膏后兔皮肤中药物浓度经时过程表明，药物能迅速渗入皮肤，涂药后即刻检出的浓度为8.04±2.40μg/g，1h浓度达峰值(24.64±3.29μg/g)，12h时仍保持较高浓度(8.28±2.43μg/g)；不同浓度软膏涂药后1h和12h的测定结果显示，皮肤中药物浓度与软膏浓度具良好相关性，0.375%软膏的皮肤药浓分别为16.11±5.19μg/g和5.55±1.40μg/g，1.5%软膏分别为33.20±5.97μg/g和17.67±3.80μg/g。根据试验结果结合培氟沙星对皮肤主要致病菌的MIC90，建议临床用培氟沙星软膏浓度以0.75%为宜。
, 百拇医药
培氟沙星系氟喹诺酮类广谱抗菌药物[1]，其口服及静脉给药制剂已广泛应用于医学临床。湖北省医药工业研究院研制出培氟沙星软膏(pefloxacin cream)，拟于用治疗毛囊炎、疖、脓疱疮等皮肤细菌性感染。为了解该软膏外用后培氟沙星渗入皮肤的快慢及在皮肤的滞留情况，笔者采用HPLC法测定了外用软膏后皮肤中培氟沙星浓度。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 培氟沙星软膏，主药浓度分别为0.375%、0.75%、1.5%，由本院制剂室提供，乙腈、二氯甲烷、甲丁基溴化铵、磷酸二氢钾等均为分析纯试剂。
1.2 动物 健康家兔，2.2～3.2(2.6±0.3)kg,雌雄兼用，由本院动物观察室提供。
1.3 仪器和色谱条件 美国spectra-physics SP 8810泵；water 484 紫外检测器；Nucleosil-ODS 色谱柱(粒度7μm, 200×5.0mm I.D, 大连化学物理所)；流动相为乙睛-0.5M四丁基溴化铵-0.05M磷酸二氢钾溶液(10.5：10：79.5)，流速1.5ml/min；检测波长260nm。
, 百拇医药
1.4 动物分组 试验用兔60只，随机分成12组，每组5只，其中8组用于测定0.75%软膏皮肤药浓经时过程，4组用于测定0.375%和1.5%软膏外用后1h和12h皮肤药浓。
1.5 给药与采样 受试兔给药前24h背部剪毛脱毛，于脱毛部位按3×3cm2面积涂予0.2g软膏。0.75%软膏涂药后即刻及0.5、1、2、4、6、8、12h，0.375%和1.5%软膏涂药后1、12h，分批将兔处死，先用脱脂棉将皮肤涂药部位残留软膏擦掉，用10ml蒸馏水分五次进行清洗，最后用脱脂棉将涂药部位擦干。取涂药部位皮肤2g，剪碎后置于冰箱(-4℃)内避光保存。
1.6 制样方法 将参考文献[2]稍作改动，取剪碎后皮肤2g，加入10ml蒸馏水，匀浆(10000rpm)10min，取1ml匀浆液加入1ml乙腈，旋转振荡1min，离心15min，取全部上清液加入0.1ml HCI(0.5M)及5ml二氯甲烷，手摇振荡5min，离心15min，取上清液0.5ml，加入1.5μg内标物氯甲哌噻嗪，进样20μl作HPLC测定。
, 百拇医药
1.7 定量方法建立
1.7.1 标准曲线及最低检出量 取剪碎后空白皮肤2g，分别加入不同量的培氟沙星标准液，使得每g皮肤样相当含培氟沙星5、10、15、20、30、50μg， 按前述方法制样，测定各样品的药物与内标物的峰高比，皮肤药浓(y)与峰高比(x)的回归方程为y=18.825x+1.099，R=0.9979。本试验条件下皮肤中药物的最低可检出浓度为1.25μg/g。
1.7.2 回收率 皮肤中药物浓度为10、20、50μg/g时，各浓度(n=5)的回收率分别为101.27±2.32%、100.05±4.58%、95.95±5.53%，误差(RSD)均小于6%。
2 结果
2.1 外用0.75%培氟沙星软膏后的皮肤药浓经时过程涂药后即刻取样检测，浓度为8.04±2.40μg/g，1h浓度达峰值,为24.64±3.29μg/g，12h时浓度为8.28±2.43μg/g。
, 百拇医药
2.2 三种浓度软膏外用后的皮肤药浓比较
按0.75%软膏皮肤药浓的达峰时间及终末采样时间，测定了0.375%软膏和1.5%软膏给药后1h和12h的皮肤药浓，三种浓度软膏的测定结果见附图，显著性检验(t检验)见附表。
附图 外用三种浓度软膏后的皮肤药物浓度比较
附表 三种浓度软膏的皮肤药浓的显著性检验 时间
(h)
软膏浓度
(%)
皮肤药浓
, http://www.100md.com (μg/g)
与0.375%
软膏比较
与0.75%
软膏比较
1
1.5
33.20±5.97
P<0.01
P<0.05
0.75
24.64±3.29
P<0.05
, 百拇医药
0.375
16.11±5.19
12
1.5
17.67±3.80
P<0.01
P<0.01
0.75
8.28±2.43
P>0.05
0.375
5.55±1.40
, 百拇医药
3 讨论
3.1 本文建立的兔皮肤中培氟沙星测定，HPLC分析中杂质不干扰主峰，药物浓度与峰高响应值的相关性良好，最低检测限能满足试验要求，内标法定量可减少操作误差，制样过程较简便，药物提取回收率高。
3.2 外用0.75%软膏的经时过程表明，软膏中主药能迅速渗入皮肤，峰浓度高，药物滞留时间长。
3.3 本试验中的涂药厚度为薄涂，与临床用法相同，在此涂药量下，涂药局部皮肤中培氟沙星浓度与软膏药浓呈良好相关性。
3.4 文献报道[3]培氟沙星对皮肤感染的常见致病菌金葡菌、大肠杆菌、链球菌、变形杆菌、绿脓杆菌的MIC90分别为1、0.25、4、0.25、8μg/ml，据此，0.75%软膏和1.5%软膏有效药浓可持续12h以上，每日涂药两次可持续有效药浓，而0.375%软膏用药后12h皮肤药浓已低于8μg/g，从有效性和成本综合考虑，建议临床用软膏浓度以0.75%为宜。
参考文献
1 J.P. Gonzalez and J.M. Henwood. Drugs, 1989，37: 628.
2 Oliver Bouvet et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1992，29: 579.
3 杨国昌.国外医药抗生素分册.1990，11(2)：129.
收稿日期：1998-11-15, 百拇医药
单位：湖北省医药工业研究院 武汉430061
关键词：HPLC；培氟沙星软膏；皮肤药物浓度
数理医药学杂志990232
摘要 采用高效液相色谱法(HPLC)测定了外用培氟沙星软膏后兔用药部位皮肤中药物浓度，薄涂0.75%软膏后兔皮肤中药物浓度经时过程表明，药物能迅速渗入皮肤，涂药后即刻检出的浓度为8.04±2.40μg/g，1h浓度达峰值(24.64±3.29μg/g)，12h时仍保持较高浓度(8.28±2.43μg/g)；不同浓度软膏涂药后1h和12h的测定结果显示，皮肤中药物浓度与软膏浓度具良好相关性，0.375%软膏的皮肤药浓分别为16.11±5.19μg/g和5.55±1.40μg/g，1.5%软膏分别为33.20±5.97μg/g和17.67±3.80μg/g。根据试验结果结合培氟沙星对皮肤主要致病菌的MIC90，建议临床用培氟沙星软膏浓度以0.75%为宜。
, 百拇医药
培氟沙星系氟喹诺酮类广谱抗菌药物[1]，其口服及静脉给药制剂已广泛应用于医学临床。湖北省医药工业研究院研制出培氟沙星软膏(pefloxacin cream)，拟于用治疗毛囊炎、疖、脓疱疮等皮肤细菌性感染。为了解该软膏外用后培氟沙星渗入皮肤的快慢及在皮肤的滞留情况，笔者采用HPLC法测定了外用软膏后皮肤中培氟沙星浓度。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 培氟沙星软膏，主药浓度分别为0.375%、0.75%、1.5%，由本院制剂室提供，乙腈、二氯甲烷、甲丁基溴化铵、磷酸二氢钾等均为分析纯试剂。
1.2 动物 健康家兔，2.2～3.2(2.6±0.3)kg,雌雄兼用，由本院动物观察室提供。
1.3 仪器和色谱条件 美国spectra-physics SP 8810泵；water 484 紫外检测器；Nucleosil-ODS 色谱柱(粒度7μm, 200×5.0mm I.D, 大连化学物理所)；流动相为乙睛-0.5M四丁基溴化铵-0.05M磷酸二氢钾溶液(10.5：10：79.5)，流速1.5ml/min；检测波长260nm。
, 百拇医药
1.4 动物分组 试验用兔60只，随机分成12组，每组5只，其中8组用于测定0.75%软膏皮肤药浓经时过程，4组用于测定0.375%和1.5%软膏外用后1h和12h皮肤药浓。
1.5 给药与采样 受试兔给药前24h背部剪毛脱毛，于脱毛部位按3×3cm2面积涂予0.2g软膏。0.75%软膏涂药后即刻及0.5、1、2、4、6、8、12h，0.375%和1.5%软膏涂药后1、12h，分批将兔处死，先用脱脂棉将皮肤涂药部位残留软膏擦掉，用10ml蒸馏水分五次进行清洗，最后用脱脂棉将涂药部位擦干。取涂药部位皮肤2g，剪碎后置于冰箱(-4℃)内避光保存。
1.6 制样方法 将参考文献[2]稍作改动，取剪碎后皮肤2g，加入10ml蒸馏水，匀浆(10000rpm)10min，取1ml匀浆液加入1ml乙腈，旋转振荡1min，离心15min，取全部上清液加入0.1ml HCI(0.5M)及5ml二氯甲烷，手摇振荡5min，离心15min，取上清液0.5ml，加入1.5μg内标物氯甲哌噻嗪，进样20μl作HPLC测定。
, 百拇医药
1.7 定量方法建立
1.7.1 标准曲线及最低检出量 取剪碎后空白皮肤2g，分别加入不同量的培氟沙星标准液，使得每g皮肤样相当含培氟沙星5、10、15、20、30、50μg， 按前述方法制样，测定各样品的药物与内标物的峰高比，皮肤药浓(y)与峰高比(x)的回归方程为y=18.825x+1.099，R=0.9979。本试验条件下皮肤中药物的最低可检出浓度为1.25μg/g。
1.7.2 回收率 皮肤中药物浓度为10、20、50μg/g时，各浓度(n=5)的回收率分别为101.27±2.32%、100.05±4.58%、95.95±5.53%，误差(RSD)均小于6%。
2 结果
2.1 外用0.75%培氟沙星软膏后的皮肤药浓经时过程涂药后即刻取样检测，浓度为8.04±2.40μg/g，1h浓度达峰值,为24.64±3.29μg/g，12h时浓度为8.28±2.43μg/g。
, 百拇医药
2.2 三种浓度软膏外用后的皮肤药浓比较
按0.75%软膏皮肤药浓的达峰时间及终末采样时间，测定了0.375%软膏和1.5%软膏给药后1h和12h的皮肤药浓，三种浓度软膏的测定结果见附图，显著性检验(t检验)见附表。
附图 外用三种浓度软膏后的皮肤药物浓度比较
附表 三种浓度软膏的皮肤药浓的显著性检验 时间
(h)
软膏浓度
(%)
皮肤药浓
, http://www.100md.com (μg/g)
与0.375%
软膏比较
与0.75%
软膏比较
1
1.5
33.20±5.97
P<0.01
P<0.05
0.75
24.64±3.29
P<0.05
, 百拇医药
0.375
16.11±5.19
12
1.5
17.67±3.80
P<0.01
P<0.01
0.75
8.28±2.43
P>0.05
0.375
5.55±1.40
, 百拇医药
3 讨论
3.1 本文建立的兔皮肤中培氟沙星测定，HPLC分析中杂质不干扰主峰，药物浓度与峰高响应值的相关性良好，最低检测限能满足试验要求，内标法定量可减少操作误差，制样过程较简便，药物提取回收率高。
3.2 外用0.75%软膏的经时过程表明，软膏中主药能迅速渗入皮肤，峰浓度高，药物滞留时间长。
3.3 本试验中的涂药厚度为薄涂，与临床用法相同，在此涂药量下，涂药局部皮肤中培氟沙星浓度与软膏药浓呈良好相关性。
3.4 文献报道[3]培氟沙星对皮肤感染的常见致病菌金葡菌、大肠杆菌、链球菌、变形杆菌、绿脓杆菌的MIC90分别为1、0.25、4、0.25、8μg/ml，据此，0.75%软膏和1.5%软膏有效药浓可持续12h以上，每日涂药两次可持续有效药浓，而0.375%软膏用药后12h皮肤药浓已低于8μg/g，从有效性和成本综合考虑，建议临床用软膏浓度以0.75%为宜。
参考文献
1 J.P. Gonzalez and J.M. Henwood. Drugs, 1989，37: 628.
2 Oliver Bouvet et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1992，29: 579.
3 杨国昌.国外医药抗生素分册.1990，11(2)：129.
收稿日期：1998-11-15, 百拇医药