冬凌草愈伤组织诱导及细胞培养的研究
作者：李景原 王太霞 杨相甫 张晋豫 李贺敏
单位：李景原 王太霞 相甫 张晋豫(河南师范大学生命科学学院 新乡 453002)；李贺敏(河南农业大学农学系)
关键词：冬凌草；愈伤组织；细胞悬浮培养；单细胞平板培养
中草药001232摘 要 用组织培养、细胞悬浮培养和单细胞平板培养技术，诱导出冬 凌草愈伤组织，并探讨 了细胞悬浮培养时间、培养方法和接种密度对冬凌草单细胞平板培养植板率的影响。结果表 明：从冬凌草叶和嫩茎诱导愈伤组织，以 MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基较好 ，愈 伤组织诱导率高达 96.80%。用普通单细胞平板培养法培养冬凌草单细胞的植板率很低，而 以悬浮培养 15～18 d 的单细胞为材料，接种密度为 5×103个/毫升时，进行条件培养 和 看护培养，植板率达 21.63%。本研究结果可供利用细胞培养技术筛选冬凌草高产冬 凌草素细胞株时参考。
, 百拇医药
Studies on the Induction of Calli and Cell Culture of Rab dosia rubescens
Li Jingyuan Wang Taixia Yang Xiangfu Zhang Jinyu
(College of Life Science, Henan Normal University Xinxiang 453002)
Li Hemin
(Department of Agronomy, Henan Agricultural University)
Abstract Conditions for cell culture of Rabdosia rubes cens (Hemsl) Hara. were studied with the aim to develop a new source of ru bescensin for antitumor therapy. Calli were induced from the leaf and stem of R. rubes cens and cultured either by cell suspension culture or unicellular plate c ulture. Fac tors affecting plate efficiency, such as cell suspension culture time, ways of p la ting and cell density were studied. Culture medium MS containing 1∶0.5 ratio of 2, 4-D∶NAA was found to be the most suitable medium for the induction of calli which attained an induction rate well over 96.8%. High pla ting efficiency could be obtained by plating at a density of 5×103 cells/mL w ith monocells separated from 15-18 d cells.Result of the present study may pro vide some reference for the screening of high yield cell strain for the producti on of rubescensin.
, 百拇医药
Key words Rabdosia rubescens (Hemsl) Hara. callus cell suspension culture unicellular plate culture
冬凌草 Rabdosia rubescens (Hemsl) Hara. 又称碎米桠、冰凌草和冰 凌花 ，是唇形科植物。1977年作为一种抗菌消炎、防癌抗癌的药用植物资源，收入《中华人民共 和国药典》(一部)[1]。近年的植物化学研究证明，冬凌草中所含的冬凌草甲素和 冬凌草乙素具有防癌抗癌作用[2]。冬凌草提取物可明显对抗环磷酰胺的致突变作 用。本实验以我国冬凌草主产地之一(河南济源)生长的冬凌草为材料，对其进行组织和细胞 培养，现将实验结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 愈伤组织的诱导和培养：取冬凌草叶和嫩茎，用肥皂水和自来水洗净后，吸干水分， 先用 70% 酒精灭菌 2 min，再用 0.1% 升汞灭菌 10 min，无菌蒸馏水冲洗 8 次。将 叶剪成边长约 1 cm 的小块，将嫩茎剪成长约 1 cm 的切段，分别接种到附加有不同植物激 素的 MS，White 两种培养基上。在 (23±2) ℃，光照周期 12 h/d，光强为 1 500 lx 条 件下培养，筛选出适合诱导冬凌草愈伤组织的培养基和植物激素配比。诱导出的冬凌草愈伤 组织每 3 周转接 1 次继续培养。
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1.2 细胞悬浮培养：以生长旺盛、质地疏松的愈伤组织为材料进行细胞悬浮培养。在250 mL 三角瓶中分别加入 100 mL MS 液体培养基，接种2 g 鲜愈伤组织，在 120 r/min 恒温摇床上培养，培养温度为(23±2 ) ℃。培养 30 d 后，收集并称取三角瓶的培养物， 每瓶培养基中增加的细胞鲜重(FW)表示细胞生长速度。
1.3 条件培养基的配制：配制1.4%琼脂MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基，在12 1 ℃下灭菌15 min，冷却至35 ℃备用。在无菌条件下取培养15 d的冬凌草细胞悬浮培 养物，离心10 min，取其上清液置于无菌瓶中备用。取无细胞上清液1 份与1 份上述备用的 MS培养基充分混合，然后分装成5 组，即CM1～CM5。其中CM1不加热，CM2～CM5 分别在50 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃下加热 10 min。
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1.4 单细胞平板培养的制作与培养条件：将细胞悬浮培养物用双层不锈钢网过滤。收集过 滤液并用血球计数器测量细胞密度，最终把细胞密度调整到每毫升 5×103 个。将 1 份 上述单细胞悬浮培养液与 4 份 35 ℃ 的固体条件培养基充分混合均匀，倒入无菌培养皿中 ，使培养基的厚度 3～5 mm，盖上培养皿的上盖并用蜡膜密封。置于 (23±2) ℃，光照周 期 12 h/d，光强为 1 500 lx 条件下培养。
1.5 看护培养的制作与培养条件：配制1.4%琼脂MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养 基，在121 ℃下灭菌15 min，冷却至35 ℃备用。在无菌条件下取培养21 d的冬凌草细胞悬 浮培养物1 份，与1 份上述培养基充分混合均匀，倒入无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后 ，再在培养基上放一张与培养皿直径相同的圆形无菌滤纸。在滤纸上接种已调整好细胞密度 冬凌草细胞悬浮培养液。置于(23±2)℃，光照周期12 h/d，光强为1 500 lx条件下 培养。
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1.6 实验参数：愈伤组织诱导率为产生愈伤组织的外植体数占全部接种的外植体数的百分 比。植板率(PE)为培养4 周后每个培养皿中新形成的细胞团数占接种的细胞数的百分比。细 胞悬浮培养时，细胞生长速度以培养30 d后每瓶培养基中增加的细胞鲜重(FW)表示。每 个实验结果重复3 次，取其平均数。
1.7 冬凌草素的定性测定：以冬凌草甲素，冬凌草乙素作对照，用硅胶 G 硬板薄层层析 ，氯仿-丙酮(7∶3)为展开剂，碘为显色剂，检测愈伤组织乙醚提取液中是否有冬凌草 素。
2 实验结果
2.1 愈伤组织的诱导：在所实验的 MS，White 两种培养基上均诱导出愈伤组织，但不同 培养基和不同植物激素组合愈伤组织诱导率有显著差异，所产生的愈伤组织生长状况也不相 同(表1)。结果表明：MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基上 愈伤组织诱导率最高， 且 愈伤组织质地疏松，生长较快，利于以后细胞悬浮培养。所得愈伤组织经薄层层析法定性检 测含有冬凌草甲素和冬凌草乙素。
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表1 不同培养基和不同植物激素组合愈伤组织
诱导率的影响
培养基
植物激素组合(mg/L)
诱导率(%)
愈伤组织生长状况
MS
2，4-D 2+NAA 0.5
69.51
质地疏松，生长较快
2，4-D 1+NAA 0.5
96.80
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质地疏松，生长较快
2，4-D 0.5+NAA 0.5
58.65
质地疏密，生长较慢
White
2，4-D 2+NAA 0.5
56.32
质地疏密，生长较慢
2，4-D 1+NAA 0.5
96.84
质地疏密，生长较慢
2，4-D 0.5+NAA 0.5
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58.60
质地疏密，生长较慢
2.2 细胞悬浮培养：本实验比较了 MS，White 两种培养基和不同植物激素组合对冬凌草 细胞悬浮培 养生长速度的影响，细胞生长速度以培养 30 d 后每瓶培养基中增加的细胞鲜重 (FW)表示。结果见表2。
表2 不同培养基和不同植物激素组合对细胞
悬浮培养生长速度的影响
液体培养基
植物激素组合
(mg/L)
细胞生长量
(FW g/瓶)
, 百拇医药
MS
2，4-D 3+KT 0.1
4.50
2，4-D 2+KT 0.1
6.25
2，4-D 1+KT 0.1
5.52
2，4-D 0.5+KT 0.1
3.56
2，4-D 0.1+KT 0.1
2.62
White
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2，4-D 3+KT 0.1
3.55
2，4-D 2+KT 0.1
5.82
2，4-D 1+KT 0.1
4.90
2，4-D 0.5+KT 0.1
2.12
2，4-D 0.1+KT 0.1
2.00
2.3 温度对条件培养基活性的影响：本实验对同源的无细胞培养液制备的条件培养基在不 同温度下加热处理，制备一系列条件培养基，比较了各条件培养基上单细胞培养的植板率， 结果见表3。
, 百拇医药
表3 温度对条件培养基活性的影响 条件培养基
CM1
CM2
CM3
CM4
CM5
植板率(%)
16.82
8.25
0.20
0.12
, 百拇医药
0.02
从表3可看出，在无菌条件下制备的，不经加热处理的条件培养基(CM1)上，细胞平板培养 的植板率最高，达 16.82%。在其它几种加热处理的条件培养基上，随处理温度的升高，植 板率逐渐降低。这一实验结果表明，高温能显著地破坏细胞悬浮培养液中的生长因子，降低 条件培养基的活性。
2.4 细胞悬浮培养时间对植板率的影响：在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，比较 了用悬浮培养 5～30 d 的冬凌草细胞作材料的植板率。结果见表4。
表4 细胞悬浮培养时间对植板率的影响 细胞悬浮培养时间(d)
5
10
15
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20
25
30
条件培养植板率(%)
3.51
5.82
20.55
16.82
12.05
10.62
看护培养植板率(%)
3.83
5.75
, 百拇医药
21.63
19.01
16.56
11.85
实验结果表明，用细胞悬浮培养 10 d 以内的单细胞作材料，植板率很低。用细胞悬浮培养 15～20 d 的单细胞作材料，植板率较高。用细胞悬浮培养 30 d 的单细胞作材料，植板率 也很低。
2.5 接种密度对植板率的影响：在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，比较了不同接 种密度对冬凌草单细胞平板培养植板率的影响。结果见表5。
表5 接种密度对植板率的影响 细胞密度(×103个/毫升)
1
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2
3
4
5
条件培养植板率(%)
3.72
6.04
10.51
16.28
18.00
看护培养植板率(%)
4.81
6.75
, 百拇医药
11.63
16.06
17.25
由表5可看出，在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，冬凌草单细胞平板培养植板率随接 种细胞密度的增大而升高。
3 讨论与分析
3.1 关于愈伤组织诱导的分析：诱导出愈伤组织，筛选最适合细胞生长的培养基和培养方 法是利用植物细胞培养技术生产有用次生代谢产物的基础。本研究用 MS，White 两种培养 基附加多种植物激素组合均能诱导冬凌草产生愈伤组织，但在不同培养基上诱导出愈伤组织 的质量和生长速度有较大差别，其中以 MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基愈伤组 织诱 导率高达 96.80%。在这种培养基上产生的愈伤组织生长速度快，质地疏松，利于作细胞悬 浮培养的材料。实验结果还表明，无论是诱导冬凌草愈伤组织还是进行细胞悬浮培养，在培 养基中都需要加入适量的植物生长调节物质 2，4-D，适宜的浓度在 1.0～2.0 mg/L 之 间，2，4-D 的浓度过高或过低都会降低愈伤组织的诱导率和生长速度。
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3.2 关于单细胞平板培养的分析：植物单细胞平板培养技术即单细胞克隆技术是筛选高产 细胞系的基础。然而，这项技术确实还存在一些问题，正如该技术的创始人贝格曼(Bergman n)指出的那样：“在单细胞平板培养植物细胞时，诱导细胞分裂和集落形成方面，通常存在 重大问题”[3]。本实验结果也表明，在冬凌草单细胞平板培养中，细胞悬浮培养 时间、培养方式和接种细胞密度等诸多因子都能影响植板率。
实验结果证明，影响植物单细胞平板培养植板率的关键因子之一是培养基中是否有足够的对 细胞生长和分裂有显著促进作用的活性成分即条件因子。用经高温灭菌的条件培养基培养冬 凌草单细胞，其植板率很低。相反，无论是看护培养，还是用不经高温处理的条件培养基培 养都能获得较高的植板率。植板率之所以随灭菌温度的提高而降低，是因为条件培养基中条 件因子随高温灭菌而失活。
许多文献报道过细胞悬浮培养时间对植板率有重要影响。本实验结果证明，以悬浮培养不足 10 d 的冬凌草单细胞作材料进行单细胞平板培养，植板率很低。用培养 15～20 d 的冬凌 草单细胞作材料进行单细胞平板培养，植板率显著提高。
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接种细胞密度是影响植物单细胞平板培养植板率的又一重要因素。从实验结果看，植板率随 接种细胞密度的增大而提高。但是，接种细胞密度越大，细胞之间的距离越小，细胞分裂不 久，形成的克隆就彼此长合在一起，这就给分离起源于单细胞的无性系带来很大困难。因此 ，以筛选高产细胞株为目的设计植物单细胞平板培养时，不能为了提高植板率盲目增大接种 密度，而应在保证适度植板率的前提下，改善其它培养条件，尽可能降低接种细胞密度，以 便分离起源于单细胞克隆。
Address: Li Jingyuan, College of Life Sciences, Henan Norma l University, Xinxiang
李景原 男，1988年毕业于南京农业大学植物学专业，获硕士学位。河南省植物学会副理事 长，主要从事植物资源研究与开发的工作，发表论文20多篇。现于西北大学攻读博士。
参 考 文 献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：人民卫 生出版社，1978：186
2，王太霞，李景原.植物杂志，1997，3：9
3，孙敬三，桂耀林.植物细胞工程实验技术.北京：科学出版社，1995：150
(1999-10-12收稿), 百拇医药
单位：李景原 王太霞 相甫 张晋豫(河南师范大学生命科学学院 新乡 453002)；李贺敏(河南农业大学农学系)
关键词：冬凌草；愈伤组织；细胞悬浮培养；单细胞平板培养
中草药001232摘 要 用组织培养、细胞悬浮培养和单细胞平板培养技术，诱导出冬 凌草愈伤组织，并探讨 了细胞悬浮培养时间、培养方法和接种密度对冬凌草单细胞平板培养植板率的影响。结果表 明：从冬凌草叶和嫩茎诱导愈伤组织，以 MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基较好 ，愈 伤组织诱导率高达 96.80%。用普通单细胞平板培养法培养冬凌草单细胞的植板率很低，而 以悬浮培养 15～18 d 的单细胞为材料，接种密度为 5×103个/毫升时，进行条件培养 和 看护培养，植板率达 21.63%。本研究结果可供利用细胞培养技术筛选冬凌草高产冬 凌草素细胞株时参考。
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Studies on the Induction of Calli and Cell Culture of Rab dosia rubescens
Li Jingyuan Wang Taixia Yang Xiangfu Zhang Jinyu
(College of Life Science, Henan Normal University Xinxiang 453002)
Li Hemin
(Department of Agronomy, Henan Agricultural University)
Abstract Conditions for cell culture of Rabdosia rubes cens (Hemsl) Hara. were studied with the aim to develop a new source of ru bescensin for antitumor therapy. Calli were induced from the leaf and stem of R. rubes cens and cultured either by cell suspension culture or unicellular plate c ulture. Fac tors affecting plate efficiency, such as cell suspension culture time, ways of p la ting and cell density were studied. Culture medium MS containing 1∶0.5 ratio of 2, 4-D∶NAA was found to be the most suitable medium for the induction of calli which attained an induction rate well over 96.8%. High pla ting efficiency could be obtained by plating at a density of 5×103 cells/mL w ith monocells separated from 15-18 d cells.Result of the present study may pro vide some reference for the screening of high yield cell strain for the producti on of rubescensin.
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Key words Rabdosia rubescens (Hemsl) Hara. callus cell suspension culture unicellular plate culture
冬凌草 Rabdosia rubescens (Hemsl) Hara. 又称碎米桠、冰凌草和冰 凌花 ，是唇形科植物。1977年作为一种抗菌消炎、防癌抗癌的药用植物资源，收入《中华人民共 和国药典》(一部)[1]。近年的植物化学研究证明，冬凌草中所含的冬凌草甲素和 冬凌草乙素具有防癌抗癌作用[2]。冬凌草提取物可明显对抗环磷酰胺的致突变作 用。本实验以我国冬凌草主产地之一(河南济源)生长的冬凌草为材料，对其进行组织和细胞 培养，现将实验结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 愈伤组织的诱导和培养：取冬凌草叶和嫩茎，用肥皂水和自来水洗净后，吸干水分， 先用 70% 酒精灭菌 2 min，再用 0.1% 升汞灭菌 10 min，无菌蒸馏水冲洗 8 次。将 叶剪成边长约 1 cm 的小块，将嫩茎剪成长约 1 cm 的切段，分别接种到附加有不同植物激 素的 MS，White 两种培养基上。在 (23±2) ℃，光照周期 12 h/d，光强为 1 500 lx 条 件下培养，筛选出适合诱导冬凌草愈伤组织的培养基和植物激素配比。诱导出的冬凌草愈伤 组织每 3 周转接 1 次继续培养。
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1.2 细胞悬浮培养：以生长旺盛、质地疏松的愈伤组织为材料进行细胞悬浮培养。在250 mL 三角瓶中分别加入 100 mL MS 液体培养基，接种2 g 鲜愈伤组织，在 120 r/min 恒温摇床上培养，培养温度为(23±2 ) ℃。培养 30 d 后，收集并称取三角瓶的培养物， 每瓶培养基中增加的细胞鲜重(FW)表示细胞生长速度。
1.3 条件培养基的配制：配制1.4%琼脂MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基，在12 1 ℃下灭菌15 min，冷却至35 ℃备用。在无菌条件下取培养15 d的冬凌草细胞悬浮培 养物，离心10 min，取其上清液置于无菌瓶中备用。取无细胞上清液1 份与1 份上述备用的 MS培养基充分混合，然后分装成5 组，即CM1～CM5。其中CM1不加热，CM2～CM5 分别在50 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃下加热 10 min。
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1.4 单细胞平板培养的制作与培养条件：将细胞悬浮培养物用双层不锈钢网过滤。收集过 滤液并用血球计数器测量细胞密度，最终把细胞密度调整到每毫升 5×103 个。将 1 份 上述单细胞悬浮培养液与 4 份 35 ℃ 的固体条件培养基充分混合均匀，倒入无菌培养皿中 ，使培养基的厚度 3～5 mm，盖上培养皿的上盖并用蜡膜密封。置于 (23±2) ℃，光照周 期 12 h/d，光强为 1 500 lx 条件下培养。
1.5 看护培养的制作与培养条件：配制1.4%琼脂MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养 基，在121 ℃下灭菌15 min，冷却至35 ℃备用。在无菌条件下取培养21 d的冬凌草细胞悬 浮培养物1 份，与1 份上述培养基充分混合均匀，倒入无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后 ，再在培养基上放一张与培养皿直径相同的圆形无菌滤纸。在滤纸上接种已调整好细胞密度 冬凌草细胞悬浮培养液。置于(23±2)℃，光照周期12 h/d，光强为1 500 lx条件下 培养。
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1.6 实验参数：愈伤组织诱导率为产生愈伤组织的外植体数占全部接种的外植体数的百分 比。植板率(PE)为培养4 周后每个培养皿中新形成的细胞团数占接种的细胞数的百分比。细 胞悬浮培养时，细胞生长速度以培养30 d后每瓶培养基中增加的细胞鲜重(FW)表示。每 个实验结果重复3 次，取其平均数。
1.7 冬凌草素的定性测定：以冬凌草甲素，冬凌草乙素作对照，用硅胶 G 硬板薄层层析 ，氯仿-丙酮(7∶3)为展开剂，碘为显色剂，检测愈伤组织乙醚提取液中是否有冬凌草 素。
2 实验结果
2.1 愈伤组织的诱导：在所实验的 MS，White 两种培养基上均诱导出愈伤组织，但不同 培养基和不同植物激素组合愈伤组织诱导率有显著差异，所产生的愈伤组织生长状况也不相 同(表1)。结果表明：MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基上 愈伤组织诱导率最高， 且 愈伤组织质地疏松，生长较快，利于以后细胞悬浮培养。所得愈伤组织经薄层层析法定性检 测含有冬凌草甲素和冬凌草乙素。
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表1 不同培养基和不同植物激素组合愈伤组织
诱导率的影响
培养基
植物激素组合(mg/L)
诱导率(%)
愈伤组织生长状况
MS
2，4-D 2+NAA 0.5
69.51
质地疏松，生长较快
2，4-D 1+NAA 0.5
96.80
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质地疏松，生长较快
2，4-D 0.5+NAA 0.5
58.65
质地疏密，生长较慢
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56.32
质地疏密，生长较慢
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质地疏密，生长较慢
2，4-D 0.5+NAA 0.5
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58.60
质地疏密，生长较慢
2.2 细胞悬浮培养：本实验比较了 MS，White 两种培养基和不同植物激素组合对冬凌草 细胞悬浮培 养生长速度的影响，细胞生长速度以培养 30 d 后每瓶培养基中增加的细胞鲜重 (FW)表示。结果见表2。
表2 不同培养基和不同植物激素组合对细胞
悬浮培养生长速度的影响
液体培养基
植物激素组合
(mg/L)
细胞生长量
(FW g/瓶)
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MS
2，4-D 3+KT 0.1
4.50
2，4-D 2+KT 0.1
6.25
2，4-D 1+KT 0.1
5.52
2，4-D 0.5+KT 0.1
3.56
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White
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3.55
2，4-D 2+KT 0.1
5.82
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2.12
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2.3 温度对条件培养基活性的影响：本实验对同源的无细胞培养液制备的条件培养基在不 同温度下加热处理，制备一系列条件培养基，比较了各条件培养基上单细胞培养的植板率， 结果见表3。
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表3 温度对条件培养基活性的影响 条件培养基
CM1
CM2
CM3
CM4
CM5
植板率(%)
16.82
8.25
0.20
0.12
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从表3可看出，在无菌条件下制备的，不经加热处理的条件培养基(CM1)上，细胞平板培养 的植板率最高，达 16.82%。在其它几种加热处理的条件培养基上，随处理温度的升高，植 板率逐渐降低。这一实验结果表明，高温能显著地破坏细胞悬浮培养液中的生长因子，降低 条件培养基的活性。
2.4 细胞悬浮培养时间对植板率的影响：在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，比较 了用悬浮培养 5～30 d 的冬凌草细胞作材料的植板率。结果见表4。
表4 细胞悬浮培养时间对植板率的影响 细胞悬浮培养时间(d)
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条件培养植板率(%)
3.51
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12.05
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看护培养植板率(%)
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实验结果表明，用细胞悬浮培养 10 d 以内的单细胞作材料，植板率很低。用细胞悬浮培养 15～20 d 的单细胞作材料，植板率较高。用细胞悬浮培养 30 d 的单细胞作材料，植板率 也很低。
2.5 接种密度对植板率的影响：在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，比较了不同接 种密度对冬凌草单细胞平板培养植板率的影响。结果见表5。
表5 接种密度对植板率的影响 细胞密度(×103个/毫升)
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16.06
17.25
由表5可看出，在条件培养基(CM1)和看护培养情况下，冬凌草单细胞平板培养植板率随接 种细胞密度的增大而升高。
3 讨论与分析
3.1 关于愈伤组织诱导的分析：诱导出愈伤组织，筛选最适合细胞生长的培养基和培养方 法是利用植物细胞培养技术生产有用次生代谢产物的基础。本研究用 MS，White 两种培养 基附加多种植物激素组合均能诱导冬凌草产生愈伤组织，但在不同培养基上诱导出愈伤组织 的质量和生长速度有较大差别，其中以 MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基愈伤组 织诱 导率高达 96.80%。在这种培养基上产生的愈伤组织生长速度快，质地疏松，利于作细胞悬 浮培养的材料。实验结果还表明，无论是诱导冬凌草愈伤组织还是进行细胞悬浮培养，在培 养基中都需要加入适量的植物生长调节物质 2，4-D，适宜的浓度在 1.0～2.0 mg/L 之 间，2，4-D 的浓度过高或过低都会降低愈伤组织的诱导率和生长速度。
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3.2 关于单细胞平板培养的分析：植物单细胞平板培养技术即单细胞克隆技术是筛选高产 细胞系的基础。然而，这项技术确实还存在一些问题，正如该技术的创始人贝格曼(Bergman n)指出的那样：“在单细胞平板培养植物细胞时，诱导细胞分裂和集落形成方面，通常存在 重大问题”[3]。本实验结果也表明，在冬凌草单细胞平板培养中，细胞悬浮培养 时间、培养方式和接种细胞密度等诸多因子都能影响植板率。
实验结果证明，影响植物单细胞平板培养植板率的关键因子之一是培养基中是否有足够的对 细胞生长和分裂有显著促进作用的活性成分即条件因子。用经高温灭菌的条件培养基培养冬 凌草单细胞，其植板率很低。相反，无论是看护培养，还是用不经高温处理的条件培养基培 养都能获得较高的植板率。植板率之所以随灭菌温度的提高而降低，是因为条件培养基中条 件因子随高温灭菌而失活。
许多文献报道过细胞悬浮培养时间对植板率有重要影响。本实验结果证明，以悬浮培养不足 10 d 的冬凌草单细胞作材料进行单细胞平板培养，植板率很低。用培养 15～20 d 的冬凌 草单细胞作材料进行单细胞平板培养，植板率显著提高。
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接种细胞密度是影响植物单细胞平板培养植板率的又一重要因素。从实验结果看，植板率随 接种细胞密度的增大而提高。但是，接种细胞密度越大，细胞之间的距离越小，细胞分裂不 久，形成的克隆就彼此长合在一起，这就给分离起源于单细胞的无性系带来很大困难。因此 ，以筛选高产细胞株为目的设计植物单细胞平板培养时，不能为了提高植板率盲目增大接种 密度，而应在保证适度植板率的前提下，改善其它培养条件，尽可能降低接种细胞密度，以 便分离起源于单细胞克隆。
Address: Li Jingyuan, College of Life Sciences, Henan Norma l University, Xinxiang
李景原 男，1988年毕业于南京农业大学植物学专业，获硕士学位。河南省植物学会副理事 长，主要从事植物资源研究与开发的工作，发表论文20多篇。现于西北大学攻读博士。
参 考 文 献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：人民卫 生出版社，1978：186
2，王太霞，李景原.植物杂志，1997，3：9
3，孙敬三，桂耀林.植物细胞工程实验技术.北京：科学出版社，1995：150
(1999-10-12收稿), 百拇医药