氟化钠及其拮抗剂硫酸锌对成骨细胞的影响
作者：陈璐璐 柯俐 曾天舒 夏文芳 陈荣安
单位：陈璐璐(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；柯俐(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；曾天舒(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；夏文芳(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；陈荣安(公共卫生学院)
关键词：氟化钠；硫酸锌；成骨细胞
中国骨质疏松杂志000302 [摘要] 目的 观察不同剂量氟化钠(NaF)对成骨细胞的影响及硫酸锌(ZnSO4)的拮抗作用，为临床治疗提供实验依据。方法 取新生24 hSD鼠头盖骨分离成骨细胞，在不同浓度的NaF和/或ZnSO4(10-5mol/L)中培养。经MTT法测定细胞增殖，细胞分化由碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素水平测定得到。结果 NaF对成骨细胞增殖及分化呈双向调节，主要表现为大剂量抑制，小剂量促进。当NaF浓度为10-6mol/L及10-5mol/L时，细胞增殖及碱性磷酸酶活性(ALP)均增加(P<0.05)。但当NaF浓度增加至10-4mol/L及5×10-4mol/L时，其对细胞增殖及ALP活性呈现抑制作用。然而，不同剂量的NaF对骨钙素均表现为促进其分泌(P<0.05)。ZnSO4与低浓度的NaF(10-6mol/L、10-5mol/L)有协同作用，而对高浓度的NaF(10-4mol/L、5×10-4mol/L)拮抗，使NaF对细胞增殖率及ALP活性的抑制作用减弱，并降低高浓度NaF所刺激的骨钙素分泌。结论 NaF对离体成骨细胞的增殖呈双向调节，而对细胞分化的影响呈多样性，早期表现为剂量依赖性双向调节，后期仅呈现单向刺激。10-5mol/L ZnSO4拮抗大剂量NaF，对低浓度NaF无拮抗作用。
, 百拇医药
Effect of sodium fluoride and its antagonist zine sulfate on rat osteoblasts
Chen Lulu，Ke Li，Zeng Tianshu
(Department of Endocrinology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022,China)
[Abstract] Objective To assess the effect of sodium fluoride(NaF)on rat osteoblasts and the antagonism of zinc sulfate(ZnSO4)on NaF.Methods Osteoblasts obtained from the calvariae of newborn rats were cultured in medium with different concentrations of NaF and /or ZnSO4.Cell proliferation was detected by MTT method and differentiation was determined by measuring alkaline phosphatase(ALP) activity and osteocalcin secretion.Results NaF increased cell proliferation and differentiation in a double-regulation manner,i.e.low doses of NaF stimulated both proliferation and ALP activity of osteoblasts,while high doses suppressed them. However,all doses of NaF we used increased osteocalcin production.ZnSO4 was synergistic with low doses of NaF and antagonistic to high doses of NaF by restoring partly the suppressive effect of NaF on cell proliferation and ALP activity,as well decreasing the enhancement of osteocalcin secretion by NaF. Conclusion NaF acts on osteoblast proliferation in a double-regulated manner and possesses multiple effects on cell differentiation.10-5M ZnSO4 antagonizes high doses of NaF,but does not antagonizes low doses of NaF.
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[Key words] Sodium fluoride; Zinc sulfate; Osteoblasts
氟是人体重要的微量元素，主要分布在硬组织内，现为治疗骨质疏松的药物之一。然而，摄入过量的氟将会对机体产生损害，包括氟骨症。我国不仅地方性氟病流行较严重，工业氟暴露所致的职业损害亦较明显。对于氟骨症患者，如何找到一种有效的防治药物；对于骨质疏松症患者，如何获得适当的氟制剂治疗，仍是亟待解决的重大问题。本文通过对离体成骨细胞培养，研究不同剂量氟化钠(NaF)对成骨细胞的影响及观察硫酸锌(ZnSO4)是否直接在细胞水平对抗NaF的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞分离与培养
选取新生24 h SD大鼠(同济医科大学动物中心提供)，拉颈处死后周身用75%乙醇消毒，无菌条件下取颅骨并清除表面血迹及软组织，用DMEM洗2次，将骨片剪碎成糜状，然后经过胶原酶(2 mg/ml)及透明质酸酶(1 mg/ml)混合液的阶段性消化[1]，收集2～4批细胞接种到含有DMEM(含抗生素及10%的小牛血清)的培养瓶中，置37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞接近融合时，用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化，以2×104/cm2个细胞的密度种板。
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1.2 细胞增殖率测定
细胞接种至96孔培养板，24 h后换为含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM，次日加入不同浓度(10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/L、5×10-4mmol/L)的NaF和/或ZnSO4，继续培养48 h，在最后4 h每孔滴入20μl MTT(5 mg/ml),37℃、5%CO2培养箱中孵化4 h，吸出上层液体，每孔滴加100 μl 20% SDS-50% DMF，震荡15 min后37℃再孵育4 h，用酶标仪读数(波长570 nm)。
1.3 碱性磷酸酶(ALP)活性测定
细胞接种至24孔板，24 h后加入前述浓度NaF和/或ZnSO4，继续培养4 d。吸出培养液，加0.1%tritonX-100 100μl/孔以裂解细胞，然后加入2.5 mmol/L PNPP及缓冲液50 μl/孔，37℃孵育30 min，0.1 mmol/L氢氧化钠50μl/孔终止反应。将各孔液体分别移入96孔板，用酶标仪读取OD值(波长570 mm)
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1.4 骨钙素(OC)放免测定
细胞接种至6孔板，24 h后加入前述浓度NaF和/或ZnSO4及50μg/ml维生素C，继续培养12 d，其间每3 d换液一次。第12天收集每孔100 ul上清液，用骨钙素放免试剂盒(北京中山生物技术公司)测定骨钙素水平。试剂盒批内变异系数2.61%，批间变异系统5.74%±0.51%。
1.5 统计分析
实验结果以均值±标准差(
±s)表示，组间用t检验。
2 结果
2.1 细胞增殖
NaF对细胞增殖表现为双向调节，NaF浓度偏低时(10-6M,10-5mol/L)，细胞增殖率明显增加，与无NaF组相比，P<0.05。但培养液中NaF浓度增至10-4mol/L及5×10-4mol/L时，细胞增殖率受抑制。10-5mol/L ZnSO4本身具有一定的增加成骨细胞增殖的作用，在与NaF联合作用时，其加强小剂量NaF对细胞增殖的刺激，并部分恢复大剂量NaF抑制细胞增殖的影响(表1)。
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表1 细胞MTT测定结果(n=8) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
10-5
10-4
5×10-4
0
0.344±0.027
0.377±0.03*
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0.367±0.026*
0.332±0.019*
0.336±0.022*
10-5
0.361±0.028*
0.408±0.019*△
0.397±0.03*△
0.369±0.02*△
0.358±0.019*△
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注：与0组比，*P<0.05(0组即NaF、ZnSO4浓度均为0)；与相对应无ZnSO4，NaF浓度相同组比，△P<0.05
2.2 ALP活性测定
不同剂量NaF及ZnSO4与NaF共同培养对成骨细胞ALP活性影响的方式与细胞增殖率的改变基本一致(表2)。
表2 细胞ALP活性测定结果(OD值，n=6) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
, 百拇医药
10-5
10-4
5×10-4
0
0.35 ±0.03
0.396±0.07*
0.425±0.028*
0.274±0.016*
0.115±0.017*
10-5
, 百拇医药
0.378±0.051*
0.428±0.027*△
0.45 ±0.025**△
0.318±0.031*△
0.236±0.019*△
注：与0组比*P<0.05；**P<0.01；与相对应无ZnSO4、NaF浓度相同组比，△P<0.05
2.3 骨钙素分泌
各剂量NaF对细胞骨钙素的分泌均有促进作用，差异具有显著性(P<0.05)。ZnSO4协同小剂量NaF、但对抗大剂量NaF的影响(表3)。
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表3 细胞骨钙素分泌量(ng/ml，n=3) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
10-5
10-4
5×10-4
0
1.23±0.07
1.35±0.049*
, 百拇医药
1.37±0.052*
1.59±0.067*
2.33±0.09**
10-5
1.38±0.05*
1.78±0.06*△
1.52±0.05*△
1.3 ±0.068△
1.36±0.072*△
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注：与0组比，*P<0.05；**P<0.01；与相对应无ZnSO4、NaF浓度相同组比较，△P<0.05
3 讨论
氟化物能明显增加骨密度，组织学研究亦显示它能促进类骨质沉积而提高骨量[2]，体外研究则表明氟具有促进成骨细胞有丝分裂，增加骨形成的作用[3，4]，因此在过去30年中，它是治疗骨质疏松的一种重要药物。同时，氟剂量过大会导致氟骨症(骨硬度增加)，如地方性氟病及工业氟暴露。如何寻求最有效而安全的剂量来治疗骨质疏松症及寻找有效的拮抗剂对抗过量氟所致的损害仍是人们关心的问题。
体外胎鼠或新生鼠颅骨成骨细胞培养，是观察不同药物对离体成骨细胞影响的良好模型。通过对细胞增殖及分化不同时期标志物如ALP、骨钙素、骨小结形成等的测定，可客观地评价所选择的实验药物在细胞水平的效果。我们的结果显示，NaF对成骨细胞增殖，分化的作用依赖于其剂量，10-6mol/L、10-5mol/L NaF促进增殖及ALP活性；10-4 mol/L及5×10-4 mol/L NaF反而对细胞有毒性作用，抑制其增殖和早期分化，但5×104 mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L及10-6mol/L NaF组骨钙素水平均较对照组增高，其中5×10-4mol/L组骨钙素水平最高。这些数据与其他作者对人和鸡成骨细胞研究所得的结果相似，但也有不同之处。Khokher等报道氟化钠浓度至少在100μmol/L才能刺激人成骨细胞ALP活性，至少250μmol/L才能显著提高3H掺入率[4]。Wergedal等则观察到50μmol/L为促进人成骨细胞增殖和分化的最适剂量[5]。这些差异可能是由于所用细胞的种类及培养条件不同所致。NaF对骨钙素分泌的促进作用是导致骨基质不适当矿化的基础。有研究揭示，氟离子(F-)半径与骨基质中的OH-具有相同的半径及电荷，故易发生置换而使羟磷灰石结晶变为更稳定的氟磷灰石结晶，但后者可比前者体积大2～9倍。当氟过量时，这种巨大的板块状结晶将使骨力学框架的连续性、规律性遭到破坏[6]。
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NaF对骨细胞作用的分子生物学机制尚有争议。Lau等认为促有丝分裂剂量的氟能特异性抑制成骨细胞内磷酸激酶而增加有丝分裂原活化蛋白激酶氨酰磷酸化作用和活性以促进成骨细胞增殖[7]。近来，Burgener等提出氟通过直接增加特异性酪氨酸激酶活性(与抑制PTPP相反)而促进成骨细胞增殖[8]。
锌(Zn++)是氟的拮抗剂之一，可被用于治疗氟骨症。锌的作用认为在体内能与氟结合，形成难以溶解的氟化物，降低体内氟含量[9]。但锌在细胞水平如何拮抗氟的作用现不详，且未见报道。我们的实验显示10-5mol/L ZnSO4本身亦有刺激成骨细胞的作用，在与NaF共同加入成骨细胞培养时，表现为协同小剂量NaF增加细胞增殖及分化，但抑制大剂量NaF的作用，并降低大剂量NaF促进骨钙素分泌的影响，这一观察解释了临床上锌为何可以对抗过量氟所致的骨硬化症。目前的研究证明锌与骨质疏松也有关系，给绝经期妇女补充微量元素锌，结果钙缺乏组和不缺乏组密度均增加[10]。刘秀明等在胎鼠头盖骨细胞的体外培养中加入10-5mol/LZnSO4即能够促进成骨细胞增殖和分化[11]。因此，将适量的锌和氟共同作用于成骨细胞，有可能既对抗氟的毒性，又加强治疗骨质疏松的效果。我们的上述结果为骨质疏松症治疗的新思路提供了一定的实验依据。
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总之，本实验提示NaF对成骨细胞增殖分化的作用呈剂量依赖性双向调节，10-5mol/L ZnSO4能够部分对抗大剂量NaF抑制增殖分化的作用，ZnSO4这种在细胞水平与氟相互影响是否仅存在于化学反应水平，抑或有不同的生物效应，有待进一步的研究。
基金项目：国家九五攻关课题项目(96906040210)
参考文献
1，陈璐璐，Schöller J,Foged NT.孕酮对离胎鼠头盖骨成骨细胞增殖与分化的影响，中华妇产科杂志，1997，32：538.
2，Riggs BL,Seeman E,Hodgson SF,et al.Effect of the fluoride/calcium regime on vertebral fracture occurrence in postemenopausal ostoporosis.N Eng J Med,1983;306:211.
, http://www.100md.com
3，Khokher MA,Dandona P.Fluoride stimulates 3H thymidine incorporation and alkaline phosphatase production by human osteoblasts.Metabolism,1990,39:1118.
4，Kau KH,Farley JR,Freema TK,et al.A proposed mechanism of the mitofenic action of fluoride on bone cells:inhibition of the activity of an osteoblastic acid phosphatase.Metabolism,1989,38:858.
5，Wergedal JE,Lau KHW,Baylink.Fluoride and bovine bone extract influence cell proliferation and phosphatase activities in human bone cell culture.Clin Orthop Relat Res,1988,233:274.
, 百拇医药
6，蒋明，朱立平，林孝义,主编.风湿病学.北京：科学出版社，1998,54.
7，Lau KHW,Wu LW,Yoon HK,et al.Inhibition of phosphotyrosine dephosphorylation(p-tyr)leads to increase p-tyr phosphorylation of MAP kinase(MAPK)activity,and human bone cell proliferation.Bone,1995,16(Suppl):96S.
8，Burgener D,Bonjour JP,Caverzasio J.Fluoride increases tyrosine activity in osteoblast-like cell:regulatory role on the stimulation of cell proliferation and Pi transport across the plasma membrane.J Bone Miner Res,1995,10:164.
9，Singh M.Effects of fluoride on copper, manganese and zinc in bone and kidney.Fluoride,1983;16(3):187.
10，马丽英，王瑞淑.锌与骨代谢的研究进展.国外医学卫生学分册，1998，25：271.
11，刘秀明，王淑云，李锐，等.微量元素对大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞体外培养增殖分化的影响.中华骨科杂志，1995，15：177., 百拇医药
单位：陈璐璐(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；柯俐(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；曾天舒(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；夏文芳(430022 武汉，同济医科大学协和医院内分泌科)；陈荣安(公共卫生学院)
关键词：氟化钠；硫酸锌；成骨细胞
中国骨质疏松杂志000302 [摘要] 目的 观察不同剂量氟化钠(NaF)对成骨细胞的影响及硫酸锌(ZnSO4)的拮抗作用，为临床治疗提供实验依据。方法 取新生24 hSD鼠头盖骨分离成骨细胞，在不同浓度的NaF和/或ZnSO4(10-5mol/L)中培养。经MTT法测定细胞增殖，细胞分化由碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素水平测定得到。结果 NaF对成骨细胞增殖及分化呈双向调节，主要表现为大剂量抑制，小剂量促进。当NaF浓度为10-6mol/L及10-5mol/L时，细胞增殖及碱性磷酸酶活性(ALP)均增加(P<0.05)。但当NaF浓度增加至10-4mol/L及5×10-4mol/L时，其对细胞增殖及ALP活性呈现抑制作用。然而，不同剂量的NaF对骨钙素均表现为促进其分泌(P<0.05)。ZnSO4与低浓度的NaF(10-6mol/L、10-5mol/L)有协同作用，而对高浓度的NaF(10-4mol/L、5×10-4mol/L)拮抗，使NaF对细胞增殖率及ALP活性的抑制作用减弱，并降低高浓度NaF所刺激的骨钙素分泌。结论 NaF对离体成骨细胞的增殖呈双向调节，而对细胞分化的影响呈多样性，早期表现为剂量依赖性双向调节，后期仅呈现单向刺激。10-5mol/L ZnSO4拮抗大剂量NaF，对低浓度NaF无拮抗作用。
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Effect of sodium fluoride and its antagonist zine sulfate on rat osteoblasts
Chen Lulu，Ke Li，Zeng Tianshu
(Department of Endocrinology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022,China)
[Abstract] Objective To assess the effect of sodium fluoride(NaF)on rat osteoblasts and the antagonism of zinc sulfate(ZnSO4)on NaF.Methods Osteoblasts obtained from the calvariae of newborn rats were cultured in medium with different concentrations of NaF and /or ZnSO4.Cell proliferation was detected by MTT method and differentiation was determined by measuring alkaline phosphatase(ALP) activity and osteocalcin secretion.Results NaF increased cell proliferation and differentiation in a double-regulation manner,i.e.low doses of NaF stimulated both proliferation and ALP activity of osteoblasts,while high doses suppressed them. However,all doses of NaF we used increased osteocalcin production.ZnSO4 was synergistic with low doses of NaF and antagonistic to high doses of NaF by restoring partly the suppressive effect of NaF on cell proliferation and ALP activity,as well decreasing the enhancement of osteocalcin secretion by NaF. Conclusion NaF acts on osteoblast proliferation in a double-regulated manner and possesses multiple effects on cell differentiation.10-5M ZnSO4 antagonizes high doses of NaF,but does not antagonizes low doses of NaF.
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[Key words] Sodium fluoride; Zinc sulfate; Osteoblasts
氟是人体重要的微量元素，主要分布在硬组织内，现为治疗骨质疏松的药物之一。然而，摄入过量的氟将会对机体产生损害，包括氟骨症。我国不仅地方性氟病流行较严重，工业氟暴露所致的职业损害亦较明显。对于氟骨症患者，如何找到一种有效的防治药物；对于骨质疏松症患者，如何获得适当的氟制剂治疗，仍是亟待解决的重大问题。本文通过对离体成骨细胞培养，研究不同剂量氟化钠(NaF)对成骨细胞的影响及观察硫酸锌(ZnSO4)是否直接在细胞水平对抗NaF的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞分离与培养
选取新生24 h SD大鼠(同济医科大学动物中心提供)，拉颈处死后周身用75%乙醇消毒，无菌条件下取颅骨并清除表面血迹及软组织，用DMEM洗2次，将骨片剪碎成糜状，然后经过胶原酶(2 mg/ml)及透明质酸酶(1 mg/ml)混合液的阶段性消化[1]，收集2～4批细胞接种到含有DMEM(含抗生素及10%的小牛血清)的培养瓶中，置37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞接近融合时，用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化，以2×104/cm2个细胞的密度种板。
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1.2 细胞增殖率测定
细胞接种至96孔培养板，24 h后换为含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM，次日加入不同浓度(10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/L、5×10-4mmol/L)的NaF和/或ZnSO4，继续培养48 h，在最后4 h每孔滴入20μl MTT(5 mg/ml),37℃、5%CO2培养箱中孵化4 h，吸出上层液体，每孔滴加100 μl 20% SDS-50% DMF，震荡15 min后37℃再孵育4 h，用酶标仪读数(波长570 nm)。
1.3 碱性磷酸酶(ALP)活性测定
细胞接种至24孔板，24 h后加入前述浓度NaF和/或ZnSO4，继续培养4 d。吸出培养液，加0.1%tritonX-100 100μl/孔以裂解细胞，然后加入2.5 mmol/L PNPP及缓冲液50 μl/孔，37℃孵育30 min，0.1 mmol/L氢氧化钠50μl/孔终止反应。将各孔液体分别移入96孔板，用酶标仪读取OD值(波长570 mm)
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1.4 骨钙素(OC)放免测定
细胞接种至6孔板，24 h后加入前述浓度NaF和/或ZnSO4及50μg/ml维生素C，继续培养12 d，其间每3 d换液一次。第12天收集每孔100 ul上清液，用骨钙素放免试剂盒(北京中山生物技术公司)测定骨钙素水平。试剂盒批内变异系数2.61%，批间变异系统5.74%±0.51%。
1.5 统计分析
实验结果以均值±标准差(
±s)表示，组间用t检验。2 结果
2.1 细胞增殖
NaF对细胞增殖表现为双向调节，NaF浓度偏低时(10-6M,10-5mol/L)，细胞增殖率明显增加，与无NaF组相比，P<0.05。但培养液中NaF浓度增至10-4mol/L及5×10-4mol/L时，细胞增殖率受抑制。10-5mol/L ZnSO4本身具有一定的增加成骨细胞增殖的作用，在与NaF联合作用时，其加强小剂量NaF对细胞增殖的刺激，并部分恢复大剂量NaF抑制细胞增殖的影响(表1)。
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表1 细胞MTT测定结果(n=8) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
10-5
10-4
5×10-4
0
0.344±0.027
0.377±0.03*
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0.367±0.026*
0.332±0.019*
0.336±0.022*
10-5
0.361±0.028*
0.408±0.019*△
0.397±0.03*△
0.369±0.02*△
0.358±0.019*△
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注：与0组比，*P<0.05(0组即NaF、ZnSO4浓度均为0)；与相对应无ZnSO4，NaF浓度相同组比，△P<0.05
2.2 ALP活性测定
不同剂量NaF及ZnSO4与NaF共同培养对成骨细胞ALP活性影响的方式与细胞增殖率的改变基本一致(表2)。
表2 细胞ALP活性测定结果(OD值，n=6) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
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10-5
10-4
5×10-4
0
0.35 ±0.03
0.396±0.07*
0.425±0.028*
0.274±0.016*
0.115±0.017*
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0.378±0.051*
0.428±0.027*△
0.45 ±0.025**△
0.318±0.031*△
0.236±0.019*△
注：与0组比*P<0.05；**P<0.01；与相对应无ZnSO4、NaF浓度相同组比，△P<0.05
2.3 骨钙素分泌
各剂量NaF对细胞骨钙素的分泌均有促进作用，差异具有显著性(P<0.05)。ZnSO4协同小剂量NaF、但对抗大剂量NaF的影响(表3)。
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表3 细胞骨钙素分泌量(ng/ml，n=3) ZnSO4
(mol/L)
NaF(mol/L)
0
10-6
10-5
10-4
5×10-4
0
1.23±0.07
1.35±0.049*
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1.37±0.052*
1.59±0.067*
2.33±0.09**
10-5
1.38±0.05*
1.78±0.06*△
1.52±0.05*△
1.3 ±0.068△
1.36±0.072*△
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注：与0组比，*P<0.05；**P<0.01；与相对应无ZnSO4、NaF浓度相同组比较，△P<0.05
3 讨论
氟化物能明显增加骨密度，组织学研究亦显示它能促进类骨质沉积而提高骨量[2]，体外研究则表明氟具有促进成骨细胞有丝分裂，增加骨形成的作用[3，4]，因此在过去30年中，它是治疗骨质疏松的一种重要药物。同时，氟剂量过大会导致氟骨症(骨硬度增加)，如地方性氟病及工业氟暴露。如何寻求最有效而安全的剂量来治疗骨质疏松症及寻找有效的拮抗剂对抗过量氟所致的损害仍是人们关心的问题。
体外胎鼠或新生鼠颅骨成骨细胞培养，是观察不同药物对离体成骨细胞影响的良好模型。通过对细胞增殖及分化不同时期标志物如ALP、骨钙素、骨小结形成等的测定，可客观地评价所选择的实验药物在细胞水平的效果。我们的结果显示，NaF对成骨细胞增殖，分化的作用依赖于其剂量，10-6mol/L、10-5mol/L NaF促进增殖及ALP活性；10-4 mol/L及5×10-4 mol/L NaF反而对细胞有毒性作用，抑制其增殖和早期分化，但5×104 mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L及10-6mol/L NaF组骨钙素水平均较对照组增高，其中5×10-4mol/L组骨钙素水平最高。这些数据与其他作者对人和鸡成骨细胞研究所得的结果相似，但也有不同之处。Khokher等报道氟化钠浓度至少在100μmol/L才能刺激人成骨细胞ALP活性，至少250μmol/L才能显著提高3H掺入率[4]。Wergedal等则观察到50μmol/L为促进人成骨细胞增殖和分化的最适剂量[5]。这些差异可能是由于所用细胞的种类及培养条件不同所致。NaF对骨钙素分泌的促进作用是导致骨基质不适当矿化的基础。有研究揭示，氟离子(F-)半径与骨基质中的OH-具有相同的半径及电荷，故易发生置换而使羟磷灰石结晶变为更稳定的氟磷灰石结晶，但后者可比前者体积大2～9倍。当氟过量时，这种巨大的板块状结晶将使骨力学框架的连续性、规律性遭到破坏[6]。
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NaF对骨细胞作用的分子生物学机制尚有争议。Lau等认为促有丝分裂剂量的氟能特异性抑制成骨细胞内磷酸激酶而增加有丝分裂原活化蛋白激酶氨酰磷酸化作用和活性以促进成骨细胞增殖[7]。近来，Burgener等提出氟通过直接增加特异性酪氨酸激酶活性(与抑制PTPP相反)而促进成骨细胞增殖[8]。
锌(Zn++)是氟的拮抗剂之一，可被用于治疗氟骨症。锌的作用认为在体内能与氟结合，形成难以溶解的氟化物，降低体内氟含量[9]。但锌在细胞水平如何拮抗氟的作用现不详，且未见报道。我们的实验显示10-5mol/L ZnSO4本身亦有刺激成骨细胞的作用，在与NaF共同加入成骨细胞培养时，表现为协同小剂量NaF增加细胞增殖及分化，但抑制大剂量NaF的作用，并降低大剂量NaF促进骨钙素分泌的影响，这一观察解释了临床上锌为何可以对抗过量氟所致的骨硬化症。目前的研究证明锌与骨质疏松也有关系，给绝经期妇女补充微量元素锌，结果钙缺乏组和不缺乏组密度均增加[10]。刘秀明等在胎鼠头盖骨细胞的体外培养中加入10-5mol/LZnSO4即能够促进成骨细胞增殖和分化[11]。因此，将适量的锌和氟共同作用于成骨细胞，有可能既对抗氟的毒性，又加强治疗骨质疏松的效果。我们的上述结果为骨质疏松症治疗的新思路提供了一定的实验依据。
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总之，本实验提示NaF对成骨细胞增殖分化的作用呈剂量依赖性双向调节，10-5mol/L ZnSO4能够部分对抗大剂量NaF抑制增殖分化的作用，ZnSO4这种在细胞水平与氟相互影响是否仅存在于化学反应水平，抑或有不同的生物效应，有待进一步的研究。
基金项目：国家九五攻关课题项目(96906040210)
参考文献
1，陈璐璐，Schöller J,Foged NT.孕酮对离胎鼠头盖骨成骨细胞增殖与分化的影响，中华妇产科杂志，1997，32：538.
2，Riggs BL,Seeman E,Hodgson SF,et al.Effect of the fluoride/calcium regime on vertebral fracture occurrence in postemenopausal ostoporosis.N Eng J Med,1983;306:211.
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3，Khokher MA,Dandona P.Fluoride stimulates 3H thymidine incorporation and alkaline phosphatase production by human osteoblasts.Metabolism,1990,39:1118.
4，Kau KH,Farley JR,Freema TK,et al.A proposed mechanism of the mitofenic action of fluoride on bone cells:inhibition of the activity of an osteoblastic acid phosphatase.Metabolism,1989,38:858.
5，Wergedal JE,Lau KHW,Baylink.Fluoride and bovine bone extract influence cell proliferation and phosphatase activities in human bone cell culture.Clin Orthop Relat Res,1988,233:274.
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6，蒋明，朱立平，林孝义,主编.风湿病学.北京：科学出版社，1998,54.
7，Lau KHW,Wu LW,Yoon HK,et al.Inhibition of phosphotyrosine dephosphorylation(p-tyr)leads to increase p-tyr phosphorylation of MAP kinase(MAPK)activity,and human bone cell proliferation.Bone,1995,16(Suppl):96S.
8，Burgener D,Bonjour JP,Caverzasio J.Fluoride increases tyrosine activity in osteoblast-like cell:regulatory role on the stimulation of cell proliferation and Pi transport across the plasma membrane.J Bone Miner Res,1995,10:164.
9，Singh M.Effects of fluoride on copper, manganese and zinc in bone and kidney.Fluoride,1983;16(3):187.
10，马丽英，王瑞淑.锌与骨代谢的研究进展.国外医学卫生学分册，1998，25：271.
11，刘秀明，王淑云，李锐，等.微量元素对大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞体外培养增殖分化的影响.中华骨科杂志，1995，15：177., 百拇医药