Balb/C乳鼠实验性感染汉坦病毒与脑神经细胞凋亡
作者：贺宏印 刘俊彬 杨守京 刘彦仿 火翠香
单位：贺宏印(730030 兰州，解放军第一医院神经内科)；火翠香(730030 兰州，解放军第一医院神经内科)；刘俊彬(第四军医大学西京医院临床免疫科)；杨守京(第四军医大学病理教研室)；刘彦仿(第四军医大学病理教研室)
关键词：肾综合征出血热；凋亡；原位末端标记
中华传染病杂志000206 【摘要】 目的 应用原位末端标记技术对Balb/C乳鼠脑组织的凋亡细胞进行检测，并对脑组织中汉坦病毒(HV)感染和细胞凋亡的关系进行初步探讨。方法 HV陈株经腹腔接种Balb/C乳鼠，感染后分别在1、2、4、8、10和14 d取脑组织，4%多聚甲醛固定，常规制备5 μm石蜡切片，应用原位杂交对乳鼠石蜡切片的病毒定位，用原位末端标记显示乳鼠脑组织中存在着凋亡细胞。结果 原位杂交检测结果显示，病毒主要累及大脑皮层、海马等部位，阳性信号主要分布于胞浆、紧靠核膜，原位末端标记的阳性细胞存在于神经细胞核内，在感染乳鼠脑组织中许多细胞被原位末端标记，呈胞核深染，弥漫分布于皮层、海马、白质等部位。结论 乳鼠脑组织中存在着凋亡细胞，该病变可能与病毒感染有关。
, 百拇医药
Experimental Hantaan virus infection induced apoptosis of nerve cells in the brain of Balb/C suckling mice
HE Hongying, LIU Junbin, YANG Shoujing, et al.
(Department of Neurology, The First Hospital of PLA, Lanzhou 730030, China)
【Abstract】 Objective We employed the in situ end labeling (ISEL) to detect the apoptosis in brain nerve cells of the suckling mice to study the relationship between the Hantaan virus in the brain and the apoptosis. Methods Hantaan virus (HV) was injected into the abdominal cavity of the suckling mice. The brain tissue was harvested at 1,2,4,6,8,10 and 14 days after the injection. The specimens were fixed in 4% paraformaldehyde fixative, embedded in paraffin and cut into 5 μm serial sections. We employed the in situ hybridization (ISH) to locate the HV in the brain nerve cells of the suckling mice and detected the apoptosis with ISEL. Results After in situ hybridization, the positive signals were mainly localized in the cytoplasm close to the nuclear membrane in the cells of cerebral cortex, hippocampus. The detection using ISEL revealed the existence of apoptosis in the nuclei of the nerve cells. The darkly stained positive nuclei could be observed scattering in the cerebral cortex, hippocampus, and white matter. Conclusion We found the existence of the apoptosis in nerve cell and probably resulted from the HV infection.
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【Key words】Hemorrhagic fever with renal syndrome; Apoptosis; In situ end labeling
肾综合征出血热(HFRS)是汉坦病毒属病毒(HV)引起的一种自然疫源性疾病。有文献报道[1]在实验性感染乳鼠脑组织中，存在神经细胞变性和嗜酸样坏死，且病变存在于皮质层、海马和基底核，但这些病变中是否有细胞凋亡，作者目前尚未见报道。现就这一问题进行研究。
材料和方法
一、材料
(一) 抗体 抗HV糖蛋白2(G2)单克隆抗体(MAb)LV48A(中国预防科学院病毒研究所)；抗HV核蛋白MAb1A8，抗HV血凝素(HA)MAb3D8，8G3(第四军医大学分子病毒研究所)。
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(二) 动物来源 2～3 d龄Balb/C乳鼠，雄雌不分，由第四军医大学实验动物中心提供。
(三) 主要试剂 非放射性标记试剂盒及检测试剂盒Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim德国)，PAP试剂盒和BSA(Fraction V.Sigma华美生物工程公司)，质粒M56含有Hantaan病毒M全cDNA系Schmalijohn构建，HV陈株F1M10(第四军医大学分子病毒室薛小平博士提供)。蛋白酶K(Boehringer Mannheim德国)，DNA聚合酶Ⅰ(Promega Ihadisob WⅠ)，RNase DNase(购于华美生物制品公司)，Taq酶(Boehringer Mannheim德国)，RNase,AMV酶(购于华美生物制品公司)。
二、方法
(一) 病毒接种 以100LD50HV，0.05 ml经腹腔途径感染病毒Balb/C乳鼠。
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(二) 标本制备 乳鼠接种后分别于第1、2、4、6、8、10、12及14 d，解剖取鼠脑，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm切片。
(三) 免疫组织化学 一抗为1∶2 000稀释的LV48A，1A8，3D8，8G3，4℃温育36 h，然后按文献[2，3]介绍的多重PAP法染色检测病毒抗原。实验同时设有阳性对照，正常组织阴性对照。
(四) 原位分子杂交 质粒M56经内切酶PstⅠ消化，分离回收特异性片段后，用Dig-11-dUTP随机引物延伸法标记做为探针。分子杂交过程分别按有关文献[4，5]及试剂盒操作指南进行。同时设不含探针的空白对照和RNase消化组织阴性对照。
(五) 原位末端标记[6，7] 石蜡切片常规脱蜡，蛋白酶K消化后脱水干燥，加标记反应液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L DTT,0.05% BSA,0.01 mmol/L dATP,dCTA,dGTP,0.006 5 mmol/L dTTP,0.003 5 mmol/L digoxigenin-11-dUTP;Klnow酶20U)37℃，2 h，其余检测步骤按试剂盒操作指南进行。实验同时设有正常阴性对照。
, http://www.100md.com
结果
一、脑组织中HV抗原定位
所有感染标本除第1 d外，均在大脑皮质海马、基底核的神经细胞中查到了病毒抗原。在脑组织中抗原主要分布于神经细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒(图1)，正常、替代及空白对照呈阴性。阳性对照结果稳定。
二、脑组织病毒RNA的定位分布
所有感染标本中，均能检到HV RNA，RNA分布于皮质、海马、基底核和白质中的神经细胞中，阳性颗粒或阳性反应主要位于核周，沿核膜密集排列(图2)。
三、脑组织中的凋亡细胞
所有标本中均有凋亡细胞，阳性呈蓝色颗粒，位于神经细胞核内，分布于皮质、海马及白质中(图3)，以皮质和海马部位较多。
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四、脑组织中凋亡细胞的分布与HV抗原、HV RNA定位的关系
HV抗原和HV RNA主要分布在大脑皮层、海马的神经细胞中，凋亡细胞在此部位多见。
讨论
已证实HV在许多实验动物体内呈泛嗜性感染，乳鼠脑对HV高度易感。HV可以穿过血脑屏障造成中枢系统感染，特别是早期出现的神经精神症状，包括躁动、抽搐等，这除与脑水肿、脑出血及尿毒症等有关外，病毒作用是不可忽视的原因之一。Yoneda等[8]报道病毒感染可造成细胞凋亡。
细胞的凋亡和坏死是两个不同的概念，有着形态和生化特征等方面的不同。前者在核酶的作用下，将胞核DNA溶解成大小不一的片段，电泳时呈“阶梯状”[9，10]；细胞坏死是在溶酶体酶的作用下，使胞核DNA降解，电泳时呈弥漫状；凋亡细胞在体内存留时间短(12 h)，形态观察较为困难。在DNA聚合酶的作用下，将带有标记的核苷酸掺入合成到DNA断裂部位并将其补平，可有效地标记组织切片中凋亡细胞的DNA的断裂。我们利用它检测HV感染乳鼠脑组织凋亡细胞。杨为松[11]证实HV可以通过血脑屏障，对神经细胞造成损伤，在大脑皮质层、海马、基底核部位出现散在神经细胞变性和嗜酸样坏死。我们的研究结果显示，感染动物脑神经细胞中有明显的病毒RNA和抗原阳性，说明神经细胞是病毒感染的靶细胞。脑中的点状坏死存在于皮质层、海马部位，伴有病毒RNA和抗原阳性但无炎细胞浸润，结果提示这种损伤是由病毒感染和相关因素引起的。我们发现在接种病毒后各天的标本中均有凋亡细胞分布于皮质层、海马、白质，其中以皮质层和海马部位较多。原位杂交结果表明，HV RNA分布于以上出现凋亡细胞较多的部位，提示病变可能与病毒感染有关。以前有报道的神经细胞变性、嗜酸样坏死[11-13]很大一部分可能是凋亡细胞。本研究表明，实验性病毒感染动物的脑组织中存在着凋亡细胞，后者可能是通过直接或间接地激活神经细胞程序性死亡(PCD)机制，造成的脑神经细胞损伤，并继而出现一系列的临床症状，以上病变过程的机制有待进一步研究。
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图1 HFRS脑组织免疫组化，病毒NP抗原定位于神经细胞浆，阳性细胞分布的海马回，苏木素衬染×400
图2 HV脑组织原位分子杂交，病毒RNA定位神经细胞浆，阳性细胞散在分布，核固红衬染×400
图3 HV感染乳鼠脑组织ISEL，阳性细胞核散在分布，核固红衬染×400
参考文献
1，姚楚铮.流行性出血热动物模型的建立.中华医学杂志，1987，67：243-246.
2，杨守京.PAP多重及多重PAP结合免疫细胞化学方法的建立、敏感性分析与研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2：42-45.
, 百拇医药
3，周德山.免疫酶细胞化学.见：蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术原位分子杂交研究.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994.72-97.
4，杨守京.原位分子杂交研究肾综合征出血热尸检组织中汉坦病毒M和sRNA的分布.中国病毒学，1995，10：48-55.
5，Furuta Y, Shinohara T, Sano K, et al. In situ hybridization with digoxigenin-labelled DNA probes for detection of viral genomes. J Clin Pathol, 1990, 43:806-809.
6，Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993, 41:7-12.
, http://www.100md.com
7，Hashimoto S, Koji T, Niu J, et al. Differential staining of DNA strand brand breaks in dying cells by non-radioactive in situ nick translation. Arch Histol Cytol, 1995, 58:161-170.
8，Yoneda M, Katsumata K, Hayakaw M, et al. Oxygen stress induces and apoptotic cell death associated with fragmentation of mitochondrial genome. Biochem Biopys Res Commun, 1995, 209: 723-729.
9，Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995, 267:1449-1456.
, 百拇医药
10，Wyllie AH, Morris RG, Smith AL, et al. Chromatin cleavage in apoptosis association with condensed chromation morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol, 1984, 142:67-69.
11，杨为松，姚志强，张文彬，等.流行性出血热病毒在患者中枢神经系统中的定位研究.第四军医大学学报，1990，11：112-114.
12，Lee HW, Lee PW, Back LJ, et al. Geographical distibution of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantaviruses. Arch Virol, 1990, suppl 1:5-18.
13，刘彦仿.流行性出血热患者脑内原发性及继发性病变研究.中华病理学杂志，1989，18：244-247.
收稿日期：1999-08-30, 百拇医药
单位：贺宏印(730030 兰州，解放军第一医院神经内科)；火翠香(730030 兰州，解放军第一医院神经内科)；刘俊彬(第四军医大学西京医院临床免疫科)；杨守京(第四军医大学病理教研室)；刘彦仿(第四军医大学病理教研室)
关键词：肾综合征出血热；凋亡；原位末端标记
中华传染病杂志000206 【摘要】 目的 应用原位末端标记技术对Balb/C乳鼠脑组织的凋亡细胞进行检测，并对脑组织中汉坦病毒(HV)感染和细胞凋亡的关系进行初步探讨。方法 HV陈株经腹腔接种Balb/C乳鼠，感染后分别在1、2、4、8、10和14 d取脑组织，4%多聚甲醛固定，常规制备5 μm石蜡切片，应用原位杂交对乳鼠石蜡切片的病毒定位，用原位末端标记显示乳鼠脑组织中存在着凋亡细胞。结果 原位杂交检测结果显示，病毒主要累及大脑皮层、海马等部位，阳性信号主要分布于胞浆、紧靠核膜，原位末端标记的阳性细胞存在于神经细胞核内，在感染乳鼠脑组织中许多细胞被原位末端标记，呈胞核深染，弥漫分布于皮层、海马、白质等部位。结论 乳鼠脑组织中存在着凋亡细胞，该病变可能与病毒感染有关。
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Experimental Hantaan virus infection induced apoptosis of nerve cells in the brain of Balb/C suckling mice
HE Hongying, LIU Junbin, YANG Shoujing, et al.
(Department of Neurology, The First Hospital of PLA, Lanzhou 730030, China)
【Abstract】 Objective We employed the in situ end labeling (ISEL) to detect the apoptosis in brain nerve cells of the suckling mice to study the relationship between the Hantaan virus in the brain and the apoptosis. Methods Hantaan virus (HV) was injected into the abdominal cavity of the suckling mice. The brain tissue was harvested at 1,2,4,6,8,10 and 14 days after the injection. The specimens were fixed in 4% paraformaldehyde fixative, embedded in paraffin and cut into 5 μm serial sections. We employed the in situ hybridization (ISH) to locate the HV in the brain nerve cells of the suckling mice and detected the apoptosis with ISEL. Results After in situ hybridization, the positive signals were mainly localized in the cytoplasm close to the nuclear membrane in the cells of cerebral cortex, hippocampus. The detection using ISEL revealed the existence of apoptosis in the nuclei of the nerve cells. The darkly stained positive nuclei could be observed scattering in the cerebral cortex, hippocampus, and white matter. Conclusion We found the existence of the apoptosis in nerve cell and probably resulted from the HV infection.
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【Key words】Hemorrhagic fever with renal syndrome; Apoptosis; In situ end labeling
肾综合征出血热(HFRS)是汉坦病毒属病毒(HV)引起的一种自然疫源性疾病。有文献报道[1]在实验性感染乳鼠脑组织中，存在神经细胞变性和嗜酸样坏死，且病变存在于皮质层、海马和基底核，但这些病变中是否有细胞凋亡，作者目前尚未见报道。现就这一问题进行研究。
材料和方法
一、材料
(一) 抗体 抗HV糖蛋白2(G2)单克隆抗体(MAb)LV48A(中国预防科学院病毒研究所)；抗HV核蛋白MAb1A8，抗HV血凝素(HA)MAb3D8，8G3(第四军医大学分子病毒研究所)。
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(二) 动物来源 2～3 d龄Balb/C乳鼠，雄雌不分，由第四军医大学实验动物中心提供。
(三) 主要试剂 非放射性标记试剂盒及检测试剂盒Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim德国)，PAP试剂盒和BSA(Fraction V.Sigma华美生物工程公司)，质粒M56含有Hantaan病毒M全cDNA系Schmalijohn构建，HV陈株F1M10(第四军医大学分子病毒室薛小平博士提供)。蛋白酶K(Boehringer Mannheim德国)，DNA聚合酶Ⅰ(Promega Ihadisob WⅠ)，RNase DNase(购于华美生物制品公司)，Taq酶(Boehringer Mannheim德国)，RNase,AMV酶(购于华美生物制品公司)。
二、方法
(一) 病毒接种 以100LD50HV，0.05 ml经腹腔途径感染病毒Balb/C乳鼠。
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(二) 标本制备 乳鼠接种后分别于第1、2、4、6、8、10、12及14 d，解剖取鼠脑，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm切片。
(三) 免疫组织化学 一抗为1∶2 000稀释的LV48A，1A8，3D8，8G3，4℃温育36 h，然后按文献[2，3]介绍的多重PAP法染色检测病毒抗原。实验同时设有阳性对照，正常组织阴性对照。
(四) 原位分子杂交 质粒M56经内切酶PstⅠ消化，分离回收特异性片段后，用Dig-11-dUTP随机引物延伸法标记做为探针。分子杂交过程分别按有关文献[4，5]及试剂盒操作指南进行。同时设不含探针的空白对照和RNase消化组织阴性对照。
(五) 原位末端标记[6，7] 石蜡切片常规脱蜡，蛋白酶K消化后脱水干燥，加标记反应液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L DTT,0.05% BSA,0.01 mmol/L dATP,dCTA,dGTP,0.006 5 mmol/L dTTP,0.003 5 mmol/L digoxigenin-11-dUTP;Klnow酶20U)37℃，2 h，其余检测步骤按试剂盒操作指南进行。实验同时设有正常阴性对照。
, http://www.100md.com
结果
一、脑组织中HV抗原定位
所有感染标本除第1 d外，均在大脑皮质海马、基底核的神经细胞中查到了病毒抗原。在脑组织中抗原主要分布于神经细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒(图1)，正常、替代及空白对照呈阴性。阳性对照结果稳定。
二、脑组织病毒RNA的定位分布
所有感染标本中，均能检到HV RNA，RNA分布于皮质、海马、基底核和白质中的神经细胞中，阳性颗粒或阳性反应主要位于核周，沿核膜密集排列(图2)。
三、脑组织中的凋亡细胞
所有标本中均有凋亡细胞，阳性呈蓝色颗粒，位于神经细胞核内，分布于皮质、海马及白质中(图3)，以皮质和海马部位较多。
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四、脑组织中凋亡细胞的分布与HV抗原、HV RNA定位的关系
HV抗原和HV RNA主要分布在大脑皮层、海马的神经细胞中，凋亡细胞在此部位多见。
讨论
已证实HV在许多实验动物体内呈泛嗜性感染，乳鼠脑对HV高度易感。HV可以穿过血脑屏障造成中枢系统感染，特别是早期出现的神经精神症状，包括躁动、抽搐等，这除与脑水肿、脑出血及尿毒症等有关外，病毒作用是不可忽视的原因之一。Yoneda等[8]报道病毒感染可造成细胞凋亡。
细胞的凋亡和坏死是两个不同的概念，有着形态和生化特征等方面的不同。前者在核酶的作用下，将胞核DNA溶解成大小不一的片段，电泳时呈“阶梯状”[9，10]；细胞坏死是在溶酶体酶的作用下，使胞核DNA降解，电泳时呈弥漫状；凋亡细胞在体内存留时间短(12 h)，形态观察较为困难。在DNA聚合酶的作用下，将带有标记的核苷酸掺入合成到DNA断裂部位并将其补平，可有效地标记组织切片中凋亡细胞的DNA的断裂。我们利用它检测HV感染乳鼠脑组织凋亡细胞。杨为松[11]证实HV可以通过血脑屏障，对神经细胞造成损伤，在大脑皮质层、海马、基底核部位出现散在神经细胞变性和嗜酸样坏死。我们的研究结果显示，感染动物脑神经细胞中有明显的病毒RNA和抗原阳性，说明神经细胞是病毒感染的靶细胞。脑中的点状坏死存在于皮质层、海马部位，伴有病毒RNA和抗原阳性但无炎细胞浸润，结果提示这种损伤是由病毒感染和相关因素引起的。我们发现在接种病毒后各天的标本中均有凋亡细胞分布于皮质层、海马、白质，其中以皮质层和海马部位较多。原位杂交结果表明，HV RNA分布于以上出现凋亡细胞较多的部位，提示病变可能与病毒感染有关。以前有报道的神经细胞变性、嗜酸样坏死[11-13]很大一部分可能是凋亡细胞。本研究表明，实验性病毒感染动物的脑组织中存在着凋亡细胞，后者可能是通过直接或间接地激活神经细胞程序性死亡(PCD)机制，造成的脑神经细胞损伤，并继而出现一系列的临床症状，以上病变过程的机制有待进一步研究。
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图1 HFRS脑组织免疫组化，病毒NP抗原定位于神经细胞浆，阳性细胞分布的海马回，苏木素衬染×400
图2 HV脑组织原位分子杂交，病毒RNA定位神经细胞浆，阳性细胞散在分布，核固红衬染×400
图3 HV感染乳鼠脑组织ISEL，阳性细胞核散在分布，核固红衬染×400
参考文献
1，姚楚铮.流行性出血热动物模型的建立.中华医学杂志，1987，67：243-246.
2，杨守京.PAP多重及多重PAP结合免疫细胞化学方法的建立、敏感性分析与研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2：42-45.
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3，周德山.免疫酶细胞化学.见：蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术原位分子杂交研究.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994.72-97.
4，杨守京.原位分子杂交研究肾综合征出血热尸检组织中汉坦病毒M和sRNA的分布.中国病毒学，1995，10：48-55.
5，Furuta Y, Shinohara T, Sano K, et al. In situ hybridization with digoxigenin-labelled DNA probes for detection of viral genomes. J Clin Pathol, 1990, 43:806-809.
6，Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993, 41:7-12.
, http://www.100md.com
7，Hashimoto S, Koji T, Niu J, et al. Differential staining of DNA strand brand breaks in dying cells by non-radioactive in situ nick translation. Arch Histol Cytol, 1995, 58:161-170.
8，Yoneda M, Katsumata K, Hayakaw M, et al. Oxygen stress induces and apoptotic cell death associated with fragmentation of mitochondrial genome. Biochem Biopys Res Commun, 1995, 209: 723-729.
9，Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995, 267:1449-1456.
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10，Wyllie AH, Morris RG, Smith AL, et al. Chromatin cleavage in apoptosis association with condensed chromation morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol, 1984, 142:67-69.
11，杨为松，姚志强，张文彬，等.流行性出血热病毒在患者中枢神经系统中的定位研究.第四军医大学学报，1990，11：112-114.
12，Lee HW, Lee PW, Back LJ, et al. Geographical distibution of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantaviruses. Arch Virol, 1990, suppl 1:5-18.
13，刘彦仿.流行性出血热患者脑内原发性及继发性病变研究.中华病理学杂志，1989，18：244-247.
收稿日期：1999-08-30, 百拇医药