肺炎链球菌细胞壁表面粘附相关蛋白的初步鉴定
作者：黄彬 陈茶 尹一兵 康格非
单位：黄彬(中山医科大学附属第一医院检验科，广州510080)；陈茶 尹一兵 康格非(重庆医科大学医学检验系)
关键词：肺炎链球菌；蛋白质印迹法；蛋白质；细菌粘附
临床检验杂志990319 摘要 通过Western blot将肺炎链球菌细胞壁表面蛋白质转移到PVDF膜上，然后与生物素标记的巨噬细胞在膜上进行粘附实验，初步鉴定出六条细胞壁表面粘附相关蛋白，它们的分子量分别是20、30、37、59、66、85 kD,其生物学特性、功能有待进一步研究确定。这为进一步研究肺炎链球菌致病机理，发展新一代多价疫苗和开发抗菌药物奠定了一定的基础。
The ldentification of pneumococcal cell wall surface proteins related to adhesion
, 百拇医药
HUANG Bin,CHEN Cha,YIN Yibin,et al
(Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Abstract By Western blot,pneumococcal cell wall proteins were transfered to PVDF membrane and hybridized with macrophages labelled with NHS-Biotion,six proteins were found.Their molecular weight were 20,30,37,59,66,85 kilodalton respectively,and their biological properties,roles remain to be further investigated.This work provided significant foundation for the understanding of pneumococcal pathogenesis,the further researching,developing of efficacious conjugate vaccines and antimicrobial drugs.
, 百拇医药
Key words Streptococcus pneumoniae; Western blot; proteins; bacterial adhesion
粘附是病原菌感染宿主细胞的过程中重要的一步，也是在宿主组织中定殖的前提条件。通过研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)与小鼠巨噬细胞体外的粘附机理，发现粘附过程需要肺炎链球菌细胞壁(cell wall，CW)表面蛋白质介导，而这些蛋白质尚未被鉴定[1]。为阐明其生物学性质，在体外通过Western blot(蛋白质印迹法)对其进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 实验菌株 SⅡ标准菌株由中国医学科学院提供。
1.2 实验动物 8～12周龄雄性BALB/c小鼠，健康，由重庆医科大学实验动物中心提供。
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1.3 实验方法
1.3.1 肺炎链球菌细胞壁的提取 将肺炎链球菌在C+Y半合成培养基中37℃恒温水浴静止培养[2],取对数生长中后期菌液(A620=0.5)约10 ml离心，无菌PBS洗涤细菌3次后加入0.5 ml含25 μg/ml变溶菌素的原生质缓冲液，37℃孵育1 h,离心分离出上清液(含细胞壁提取物)[3],用Lowry法测上清液中的蛋白质浓度。
去蛋白细胞壁的提取 将对数生长中后期的肺炎链球菌用0.25 g/L胰酶处理37℃、15 min后，细胞壁的提取方法同上。
1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和标记 取雄性8～12周龄BALB/c小鼠,腹腔注射10 g/L甲基纤维素1 ml,72 h后用RPMI 1640冲洗腹腔收获巨噬细胞[5],PBS洗涤细胞3次后用生物素标记,37℃、15 min,将巨噬细胞洗涤后调整浓度为106/ml。
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1.3.3 Western blot 实验温度以22～25℃为宜。SDS-PAGE采用不连续梯度的40 g/L的浓缩胶和120 g/L的分离胶，加入处理好的肺炎链球菌细胞壁样品和去蛋白细胞壁样品各10 μl、预染低分子量蛋白质标准5 μl,稳压200 V电泳约45 min。取下凝胶在冷的转移缓冲液中预平衡15 min，再将凝胶上的蛋白质带电转移到PVDF膜上，稳流5.5 mA/cm2凝胶，电泳30 min[4]。然后将标记好的巨噬细胞与PVDF膜上的细胞壁蛋白质杂交1 h，洗涤后加亲合素-辣根过氧化物酶复合物作用1 h,洗涤后再加酶底物4-氯-1-萘酚显色，出现紫色带说明PVDF膜上蛋白质在体外与巨噬细胞结合，提示这些蛋白质在体外可能参与了肺炎链球菌粘附于巨噬细胞的过程。
2 结果
通过Western blot将肺炎链球菌细胞壁蛋白质转移到PVDF膜上,然后与生物素标记的巨噬细胞在膜上进行粘附实验,得到6条显色的蛋白质带,去蛋白肺炎链球菌细胞壁样品无显色带。算出6条标准蛋白质的迁移率mR,建立mR与lg MW(分子量)间的直线回归方程,lg MW=2.38-1.25XmR,回归系数r=-0.9978,再将6条显色蛋白质带的mR代入回归方程,求出相应的MW分别为20、30、37、59、66、85 kD。
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3 讨论
肺炎链球菌是一种重要的病原微生物，可引起机体局部和全身的感染，如肺炎、脑膜炎、菌血症等，目前对肺炎链球菌如何使宿主致病的机理还并不十分清楚。
近年来的研究表明肺炎链球菌的毒力因子并不仅仅是荚膜，肺炎链球菌表面蛋白质、脂磷壁酸在致病过程中也发挥了重要的作用[6]。本文研究发现肺炎链球菌表面蛋白质介导肺炎链球菌对小鼠巨噬细胞的粘附过程[1]，并通过Western blot对肺炎链球菌的表面粘附蛋白进行了初步鉴定，发现SⅡ6种细胞壁表面蛋白可能参与了粘附过程，它们的MW分别是20、30、37、59、66、85 kD,其中37 kD蛋白质的分子量与目前已知的肺炎链球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesion A,PsaA)(MW为37 kD)或自溶酶(MW为36 kD)的分子量接近，85 kD蛋白质的分子量与肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)(MW为84 kD)的分子量接近。PspA、PsaA、自溶酶都存在于肺炎链球菌细胞壁表面，它们是目前认为的肺炎链球菌蛋白质类的毒力因子[7，8，10，11]，能增强肺炎链球菌致病力，但作用机制尚不十分清楚。Sampson等[9]人研究发现PsaA与血链球菌的粘附素SsaB、副血链球菌的粘附素FimA的DNA序列有高度的同源性，1996年底Berry等人通过功能实验首次证实PsaA就是肺炎链球菌的粘附素[8]。
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通过Western blot初步鉴定出肺炎链球菌细胞壁表面6种粘附相关蛋白，可提纯这些蛋白质或用与其MW接近的、已知的肺炎链球菌表面蛋白质的单克隆抗体来进一步鉴定。
参考文献
[1]黄彬，尹一兵，康格非.肺炎链球菌表面蛋白在细菌体外粘附中的介导作用.中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(5)：342
[2]Lacks S, Hotchkizz R D. A study of the genetic material determining an enzyme activity in pneumococcus.Biochem Biophys Acta,1960, 39:508
[3]Yother J,White J M.Novel surface attachment mechanism of the Streptococcus pneumoniae protein PspA.J Bacteriol,1994,176(10):2976
, 百拇医药
[4]Towbin H, Staehelin T,Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76:4350
[5]倪若愚,郭劲松,罗端德.巨噬细胞NO-2释放法检测小鼠IFN-r.上海免疫学杂志,1995,15(2)：84
[6]Geelen S,Bhattacharyya C,Tuomanen E.The cell wall mediates pneumococcal attachment to and cytopathology in human endothelial cells.Infect Immun,1993,61(4):1538
, 百拇医药
[7]Paton J C,Andrew P W,Boulnois G J,et al.Molecular analysis of the pathogenicity of Streptococcus pneumoniae:the role of pneumococcal proteins.Anna Rev Microbiol,1993，47：89
[8]Berry A M,Paton J C.Sequence heterogeneity of PsaA,a 37 kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae.Infect Immun,1996,64(12):5255
[9]Sampson J S,O′Connor S P,Stinson A R,et al.Cloning and nucleotide sequence analysis of PsaA，the Streptococcus pneumoniae gene encoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reported Streptococcus sp.adhesins.Infect Immun,1994,62(1):319
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[10]Talkington D F,Deborah F.A 43 kilodalton pneumococcal surface protein,PspA:isolation,protective abilities,and structural analysis of the amino-terminal sequence.Infect Immun,1991,59(4):1285
[11]Russell H,Tharpe J A,Wells D E,et al.Monoclonal antibody recognizing a species-specific protein from Streptococcus pneumoniae.J Clin Microbiol,1990,28(10):2191
(1998-04-07收稿，1998-12-01修回), http://www.100md.com
单位：黄彬(中山医科大学附属第一医院检验科，广州510080)；陈茶 尹一兵 康格非(重庆医科大学医学检验系)
关键词：肺炎链球菌；蛋白质印迹法；蛋白质；细菌粘附
临床检验杂志990319 摘要 通过Western blot将肺炎链球菌细胞壁表面蛋白质转移到PVDF膜上，然后与生物素标记的巨噬细胞在膜上进行粘附实验，初步鉴定出六条细胞壁表面粘附相关蛋白，它们的分子量分别是20、30、37、59、66、85 kD,其生物学特性、功能有待进一步研究确定。这为进一步研究肺炎链球菌致病机理，发展新一代多价疫苗和开发抗菌药物奠定了一定的基础。
The ldentification of pneumococcal cell wall surface proteins related to adhesion
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HUANG Bin,CHEN Cha,YIN Yibin,et al
(Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Abstract By Western blot,pneumococcal cell wall proteins were transfered to PVDF membrane and hybridized with macrophages labelled with NHS-Biotion,six proteins were found.Their molecular weight were 20,30,37,59,66,85 kilodalton respectively,and their biological properties,roles remain to be further investigated.This work provided significant foundation for the understanding of pneumococcal pathogenesis,the further researching,developing of efficacious conjugate vaccines and antimicrobial drugs.
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Key words Streptococcus pneumoniae; Western blot; proteins; bacterial adhesion
粘附是病原菌感染宿主细胞的过程中重要的一步，也是在宿主组织中定殖的前提条件。通过研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)与小鼠巨噬细胞体外的粘附机理，发现粘附过程需要肺炎链球菌细胞壁(cell wall，CW)表面蛋白质介导，而这些蛋白质尚未被鉴定[1]。为阐明其生物学性质，在体外通过Western blot(蛋白质印迹法)对其进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 实验菌株 SⅡ标准菌株由中国医学科学院提供。
1.2 实验动物 8～12周龄雄性BALB/c小鼠，健康，由重庆医科大学实验动物中心提供。
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1.3 实验方法
1.3.1 肺炎链球菌细胞壁的提取 将肺炎链球菌在C+Y半合成培养基中37℃恒温水浴静止培养[2],取对数生长中后期菌液(A620=0.5)约10 ml离心，无菌PBS洗涤细菌3次后加入0.5 ml含25 μg/ml变溶菌素的原生质缓冲液，37℃孵育1 h,离心分离出上清液(含细胞壁提取物)[3],用Lowry法测上清液中的蛋白质浓度。
去蛋白细胞壁的提取 将对数生长中后期的肺炎链球菌用0.25 g/L胰酶处理37℃、15 min后，细胞壁的提取方法同上。
1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和标记 取雄性8～12周龄BALB/c小鼠,腹腔注射10 g/L甲基纤维素1 ml,72 h后用RPMI 1640冲洗腹腔收获巨噬细胞[5],PBS洗涤细胞3次后用生物素标记,37℃、15 min,将巨噬细胞洗涤后调整浓度为106/ml。
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1.3.3 Western blot 实验温度以22～25℃为宜。SDS-PAGE采用不连续梯度的40 g/L的浓缩胶和120 g/L的分离胶，加入处理好的肺炎链球菌细胞壁样品和去蛋白细胞壁样品各10 μl、预染低分子量蛋白质标准5 μl,稳压200 V电泳约45 min。取下凝胶在冷的转移缓冲液中预平衡15 min，再将凝胶上的蛋白质带电转移到PVDF膜上，稳流5.5 mA/cm2凝胶，电泳30 min[4]。然后将标记好的巨噬细胞与PVDF膜上的细胞壁蛋白质杂交1 h，洗涤后加亲合素-辣根过氧化物酶复合物作用1 h,洗涤后再加酶底物4-氯-1-萘酚显色，出现紫色带说明PVDF膜上蛋白质在体外与巨噬细胞结合，提示这些蛋白质在体外可能参与了肺炎链球菌粘附于巨噬细胞的过程。
2 结果
通过Western blot将肺炎链球菌细胞壁蛋白质转移到PVDF膜上,然后与生物素标记的巨噬细胞在膜上进行粘附实验,得到6条显色的蛋白质带,去蛋白肺炎链球菌细胞壁样品无显色带。算出6条标准蛋白质的迁移率mR,建立mR与lg MW(分子量)间的直线回归方程,lg MW=2.38-1.25XmR,回归系数r=-0.9978,再将6条显色蛋白质带的mR代入回归方程,求出相应的MW分别为20、30、37、59、66、85 kD。
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3 讨论
肺炎链球菌是一种重要的病原微生物，可引起机体局部和全身的感染，如肺炎、脑膜炎、菌血症等，目前对肺炎链球菌如何使宿主致病的机理还并不十分清楚。
近年来的研究表明肺炎链球菌的毒力因子并不仅仅是荚膜，肺炎链球菌表面蛋白质、脂磷壁酸在致病过程中也发挥了重要的作用[6]。本文研究发现肺炎链球菌表面蛋白质介导肺炎链球菌对小鼠巨噬细胞的粘附过程[1]，并通过Western blot对肺炎链球菌的表面粘附蛋白进行了初步鉴定，发现SⅡ6种细胞壁表面蛋白可能参与了粘附过程，它们的MW分别是20、30、37、59、66、85 kD,其中37 kD蛋白质的分子量与目前已知的肺炎链球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesion A,PsaA)(MW为37 kD)或自溶酶(MW为36 kD)的分子量接近，85 kD蛋白质的分子量与肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)(MW为84 kD)的分子量接近。PspA、PsaA、自溶酶都存在于肺炎链球菌细胞壁表面，它们是目前认为的肺炎链球菌蛋白质类的毒力因子[7，8，10，11]，能增强肺炎链球菌致病力，但作用机制尚不十分清楚。Sampson等[9]人研究发现PsaA与血链球菌的粘附素SsaB、副血链球菌的粘附素FimA的DNA序列有高度的同源性，1996年底Berry等人通过功能实验首次证实PsaA就是肺炎链球菌的粘附素[8]。
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通过Western blot初步鉴定出肺炎链球菌细胞壁表面6种粘附相关蛋白，可提纯这些蛋白质或用与其MW接近的、已知的肺炎链球菌表面蛋白质的单克隆抗体来进一步鉴定。
参考文献
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[5]倪若愚,郭劲松,罗端德.巨噬细胞NO-2释放法检测小鼠IFN-r.上海免疫学杂志,1995,15(2)：84
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[9]Sampson J S,O′Connor S P,Stinson A R,et al.Cloning and nucleotide sequence analysis of PsaA，the Streptococcus pneumoniae gene encoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reported Streptococcus sp.adhesins.Infect Immun,1994,62(1):319
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[10]Talkington D F,Deborah F.A 43 kilodalton pneumococcal surface protein,PspA:isolation,protective abilities,and structural analysis of the amino-terminal sequence.Infect Immun,1991,59(4):1285
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(1998-04-07收稿，1998-12-01修回), http://www.100md.com