人工心脏瓣膜材料细菌粘附的体外实验*
作者：黄云超 张尔永 石应康 田子朴 周清华 雷 蕾 贾文祥
单位：黄云超 张尔永 石应康 田子朴 周清华 (华西医科大学 附属第一医院胸心外科，成都 610041)；雷 蕾 贾文祥(华西医科大学 微生物教研室，成都 610041)
关键词：人工心瓣；生物材料；细菌粘附
生物医学工程学杂志990402 摘要 通过体外实验，评价人工心瓣心内膜炎常见致病菌对人工心瓣材料粘附情况，初步建立人工心瓣材料细菌粘附的测定方法。采用平板菌落计数法、125I标记细菌放射性测定法，测定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对涤纶、热解碳、聚四氟乙烯的粘附情况。结果四种细菌对三种材料粘附能力与细菌生长曲线基本一致。四种细菌对涤纶粘附较强，特别是金黄色葡萄球菌对涤纶粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少。表皮葡萄球菌对热解碳的粘附最强，绿脓杆菌对热解碳的粘附维持在高水平状态。大肠杆菌、绿脓杆菌对聚四氟乙烯粘附最强。结论：不同细菌对同一种人工心瓣材料或同一种细菌对不同的人工心瓣材料有不同粘附能力。
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Study of Bacterial Adhesion to Prosthetic Valve
Materials in Vitro
Huang Yunchao1** Zhang Eryong1 Shi Yingkang1 Tian Zipu1
Zhou Qinghua1 Lei Lei2 Jia Wenxiang2
1 (Department of Cardiothoracic Surgery, The University Hospital, West China University of
, 百拇医药
Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (The Institute of Microbiology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract This article reports a study of the bacterial adhesion to prosthetic valve materials in vitro. The method for assessing the degree of bacterial adhesion to prosthetic valve materials was established primarily.The capacities of staphylococcus aureus(SA), staphylococcus epidermidis(SE), Escherichia Coli(EC) and Pseudomonas aeruginosa(PA) for adhesion to Dacron, Pyrolytic carbon and polytetrofluoroethylene(PTFE) were quantitatively determined by the plate counting and Gamma-ray counting of 125I radiolabeled bacteria in vitro. The results showed that the capacities of four types of bacteria for adhesion to Dacron, Pyrolytic carbon and PTFE coincided with the bacterial-growth curve. The capacities of four bacteria for adhering to Dacron were stronger. The adhesion of SE to Pyrolytic carbon was the strongest. The adhesion of PA Kept up a high level.The capacities of EC and PA for adhering to PTFE were the strongest. The results indicate that the capacities of different types of bacteria for adhesion to the same prosthetic valve material are different, and the capacities of one type of bacteria for adhesion to different materials are also different.
, 百拇医药
Key words Prosthetic valve Biomaterials Bacterial adhesion
人工瓣膜置换术后人工瓣膜心内膜炎(Prosthetic Valve Edocarditis PVE)，对于瓣膜置换的病人往往是一个灾难性的后果[1]。近来很多国外研究表明[2]：这种生物材料植入后引起机体感染的初始动因就是细菌粘附在生物材料表面，国内对这方面研究尚属空白。人工心瓣无论是机械心瓣膜或生物心瓣膜都是多种生物材料的复合体，是哪种材料易引起细菌粘附，细菌对不同人工心瓣材料的动态粘附情况，迄今尚未见报道。本研究的目的在于通过体外实验，评价PVE常见致病菌对人工心脏瓣膜材料的体外粘附情况，初步建立人工心瓣材料细菌粘附的测定方法，并为在人工心瓣材料表面进行改性，提高生物材料的抗细菌粘附能力奠定工作基础。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 心瓣膜生物材料
涤纶(Dacron,D)苏州织带厂人造血管研究室；聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene,PTFE)Teflon-GoreTex W.L. Gore & Associates, Inc. Arizona美国；热解碳片(Pyrolytic Carbon, PC)：四川大学高分子材料系。将三种材料制成面积1.5 cm2半园型，厚度0.5 mm，高温消毒。
1.2 细菌
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA) 大肠杆菌(Escherichia coli, EC)
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, SE) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)所有细菌为标准株
, 百拇医药
1.3 125I标记细菌悬液的制备
取斜面保种的细菌种植在液体培养基中，37 ℃恒温培养16 h。接种于平板培养基，培养24 h，取单个菌落于液体培养基中37 ℃培养24 h，得到菌液。小鼠毒力回复实验与其标准比较，无统计学差异。取9.9 ml液体培养基加0.1 ml菌液，再加入10 μl 5-125I-2′-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UDR，中国科学院原子能研究院)，37 ℃培养6 h。将菌液离心，除去上清液，加入生理盐水，旋涡混合器中振荡，使沉淀后的细菌再悬浮于生理盐水中，重复三次，去除未标记细菌的125I-UDR。采用平板计数法测定菌液的细菌浓度，γ-射线计数法测定放射性强度。根据菌液稀释倍数，放射性强度的测定值，推算出125I标记的细菌菌液浓度及与放射性强度的关系，稀释成实验所需的浓度。制成5种细菌悬液。
1.4 不同细菌生长曲线的测定
, 百拇医药
按液体培养基2 ml加125I-UDR 1 μl比例加入125I-UDR和液体培养基入消毒锥形瓶中，锥形瓶编号：1、2、3和4号，在1、2、3号锥形瓶中加入125I标记的同一种细菌菌液各2 ml(已稀释成105CFU/ml)。在1号锥形瓶放入热解碳，2号放入涤纶，3号放聚四氟乙烯，4号放入热解碳、涤纶、聚四氟乙烯。将锥形瓶放入36.8～37.0 ℃水浴摇床振摇培养30 h，间隔2 h在每个锥形瓶中取定量的菌液测定细菌浓度。
同时取定量的菌液离心，除去上清液，再加生理盐水，旋涡混合器振荡，使沉淀细菌悬浮于生理盐水中，去除未标记细菌的125I-UDR，测定放射性强度。取各时点细菌浓度，放射性强度得到细菌的生长曲线与放射性强度的关系。
1.5 细菌对人工心瓣材料粘附的测定
从测定细菌生长曲线所用的锥形瓶1、2、3号中分别在0、6、12、18、24、30 h等时点各取出材料4片，4号锥形瓶在每个等时点取出热解碳、涤纶、聚四氟乙烯各1片。所有锥形瓶取出的材料，每片用20 ml PBS液冲洗材料2次，去除未粘附的细菌和附着在材料上游离的125I-UDR，测定材料的放射性强度。因4号锥形瓶未放细菌，热解碳、涤纶、聚四氟乙烯经冲洗后测得的放射性强度，是未被冲洗掉游离的125I-UDR，在计算1、2、3号锥形瓶中热解碳、涤纶、聚四氟乙烯的放射性强度时，应减去相同时点所测得的4号锥形瓶相同其材料的放射性强度。根据生长曲线将其换算成细菌数，除以材料面积得到CFU/cm2。
, 百拇医药
1.6 统计学处理
两因素或多因素的方差分析，Logrank检验法α=0.05为检验水准。所有细菌数在制图时换算成细菌数的对数。
2 结 果
图1为细菌的生长曲线。
图1 细菌的生长曲线
Fig 1 Bacterial-growth curve
图2 涤纶的细菌粘附
Fig 2 Adhesion of bacteria to Dacron
, 百拇医药
从图2看出四种细菌对涤纶的粘附情况。金葡、大肠杆菌持续在比较高水平。而且金葡粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少，与其它三种细菌比较，差异有非常显著性(P<0.01)。图3看出表皮葡萄球菌对热解碳的粘附最强，在高峰期与其它三种细菌差异有显著性(P<0.05)。但绿脓杆菌对其粘附维持在持续高水平状态，未见到随生长曲线进入衰退期有下降的趋势(P<0.01)。图4看出大肠杆菌、绿脓杆菌对聚四氟乙烯的粘附最强，与金葡菌、表葡菌对其粘附差异有非常显著性(P<0.01)。
图3 热解碳的细菌粘附
Fig 3 Adhesion of bacteria to PC
图4 聚四氟乙烯细菌粘附
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Fig 4 Adhesion of bacteria to PTFE
从以上研究结果显示细菌对材料的粘附与细菌生长曲线关系密切，粘附高峰多在对数期和稳定期。但不一定随衰亡期而下降，不同细菌对同一材料粘附差异较大。
3 讨论
近30年来，随着生物材料人工器官的广泛应用，以生物材料为中心的感染(Biomaterial Centered Infection,BCI)发病率明显增高，而最灾难性的BCI当属PVE，发生率占瓣膜置换术的1%～9%，死亡率3%～60%[3]，有的早期死亡率高达80%以上[3]。近来许多研究表明，在BCI的发生、发展过程中，材料、细菌、宿主三大因素是相互联系的，特别是细菌与材料的相互作用和粘附是引起感染的初始动因[2]。无论机械心瓣膜或生物心瓣膜都是多种生物材料的复合体。常用的热解碳、涤纶、聚四氟乙烯、牛心包等，既是不同人工心瓣膜的组成成份，也是人工血管及修补心内缺损的常用材料。本研究结果发现不同细菌对人工心瓣材料粘附差异较大，很可能是所用材料不同，制成人工心瓣后引起PVE的发病率不同[4]的重要原因之一。
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3.1 细菌生长曲线与细菌对人工心瓣材料粘附的关系
细菌在合适的液体培养基中生长，生长速度随时间而变化。生长曲线就是细菌在体外液体培养过程中，定时测量细菌数绘制的曲线。细菌生长分为迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。除细菌自身的因素外，由于培养条件，培养基成分不同，生长过程差异较大，不同细菌生长曲线也不完全一样。Schierhdz等[5]在培养基中加入一些骨科用作骨髓腔的填充物质，发现对细菌生长有促进作用。同种细菌在液体培养基中分别加入涤纶、聚四氟乙烯、热解碳材料后。不同材料之间对细菌生长无统计学差异(P>0.05)，说明三种不同材料对细菌在培养基中生长影响无差异。
细菌在培养生长过程中，一旦遇到能与之结合的生物材料或吸附在材料表面上蛋白层中的受体，则牢固的粘附在生物材料表面。细菌粘附除材料上受体外，与细菌在生长繁殖过程中生物学活性有关。细菌在生长曲线的对数期，生长迅速，分裂繁殖快，分泌物多，是细菌粘附力最强的时期。本实验所用的四种细菌，对三种人工心瓣材料的粘附高峰主要在对数期。
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本实验观察到，金黄色葡萄球菌对涤纶的粘附，绿脓杆菌对热解碳的粘附，不随生长曲线进入衰亡期而下降，表皮葡萄球菌对涤纶、热解碳的粘附下降缓慢。可能是由于培养过程中，粘附在材料上细菌改变表现型，在培养进入衰亡期，且外界能量供给不足情况下仍能长期存活。因此细菌对人工心瓣的粘附，与细菌的生长曲线关系密切，处于生长曲线不同时期的细菌，粘附能力不同。本研究表明：细菌对材料的粘附与细菌的生长曲线一样，是一个动态变化过程。在生长曲线的不同时期，同一细菌对同一材料的粘附变化较大，不是随时间推移而持续增高或恒定不变。
3.2 不同细菌对同种人工心瓣材料的粘附
随着人工心瓣的应用，临床上发现引起PVE致病菌种类增多。常见的金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、链球菌、大肠杆菌等占80%～90%。而有的特殊细菌，仅在人工心瓣植入机体后才发现引起感染[6]，这可能与不同细菌对人工心瓣材料粘附不同有关，只有在生物材料存在时，才为某些特殊细菌提供相应受体。本实验发现：所选的四种常见PVE致病菌对涤纶的粘附均较强，特别是大肠杆菌、金葡菌，持续在比较高的水平，且金葡菌的粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少；对热解碳的粘附，以表葡菌最强，绿脓杆菌维持在高水平状态，不随生长曲线进入衰亡期而下降；对聚四氟乙烯的粘附以大肠杆菌、绿脓杆菌最强，与Gristina等[7]研究结果类似。不同细菌对同一材料不同的粘附现象，有利于理解为什么不同细菌引起的PVE发病率、严重程度变化多样。
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多种细菌遇到同一生物材料后表现为一种竞争性粘附现象。这种竞争能力与临床上认为的细菌毒力强弱关系不大。如本实验所用的表皮葡萄球菌、绿脓杆菌这两种条件致病菌，在对热解碳的粘附中占有优势，对涤纶的粘附弱。由此可见，人工心瓣置换术后的病人，发生菌血症、败血症时，应密切注意感染细菌与所用人工心瓣材料的粘附情况，防止PVE的发生。
3.3 同种细菌对不同人工心瓣材料的粘附
生物材料表面的化学组成、临界表面张力、界面能、表面亲水、疏水性、表面电荷等对细菌的粘附影响较大。表现为同种细菌对不同生物材料具有不同的粘附率[7]。本研究所用的4种细菌对涤纶的粘附多数时间强于对热解碳和聚四氟乙烯粘附。Sugarman B等[8]在研究外科各种手术缝线细菌粘附时也发现肠线的细菌粘附是尼龙线的100倍，同种材料编织线的细菌粘附比非编织线高。
在人工心瓣膜的结构中，热解碳主要构成机械瓣的瓣叶、瓣架。表面光滑，不易被细菌粘附。但本实验发现表皮葡萄球菌对其粘附明显比对聚四氟乙烯强；绿脓杆菌对其粘附持续维持在比较高水平，这或许可以从细菌粘附的角度解释在PVE的发病中，机械瓣比生物瓣高[9]。涤纶包绕生物瓣或机械瓣的瓣架，在瓣膜置换中直接缝于宿主心脏的瓣环上。它由纤维编织而成，细菌对其粘附普遍较强。本实验发现：金葡菌对涤纶的粘附明显比对热解碳、聚四氟乙烯强。表葡菌对涤纶的粘附与对热解碳、聚四氟乙烯相比，也维持在比较高的水平。绿脓杆菌对三种材料的粘附，也是以涤纶在高峰期最高。因此，不论是换瓣，或者是心内缺损用涤纶作修补，一旦发生菌血症或败血症，细菌容易粘附在其表面。聚四氟乙烯与涤纶属于聚合物类物质，但前者结构严密，与机体组织相容性好，用途广泛，是目前用得最多的血管材料。Zussac等[10]用聚四氟乙烯行二尖瓣腱索置换，效果良好，认为是腱索最好的替代物。在本实验所用的四种细菌，对其粘附均较低。相比较而言，绿脓杆菌对其粘附较强，持续在高水平状态。这可能是应用聚四氟乙烯后引起PVE中，绿脓杆菌是主要病原菌之一的原因所在。
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由此可见，在选择人工心瓣制作材料时防止与减少细菌粘附应当予以考虑，对材料进行表面改性，防止细菌粘附工作值得深入研究。
* 国家自然科学基金资助项目(39670717)
黄云超 现单位为昆明医学院第二附属医院胸心外科(650101)
参考文献
1 Dismukes WE, Karchmer AW, Buckley MJ. Prosthetic valve endocarditis: analysis of 38 cases. Circulation, 1997; 48∶365
2 Naylor PT, Myrvik QN, Gristina AG. Antibiotic resistance of biomaterial-adherent coagulase-negative and coagulase-positive staphylococci. Clin Orthop Related Research, 1990; 261∶126
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3 Schoen FJ. Infective endocarditis. Curr Opin Cadiol, 1991; 6∶435
4 Tyer GE, Jamieson WR et al. Reoperation in biological and mechanical valve populations:Fate of the reoperative patient. Ann Thorac surg, 1995; 60(suppl 2)∶464
5 Schierholz JM, Steinhause H, Rump AF et al. Controlled release of antibiotics from biomedical polyurethane: morphological and structural features.Biomaterials,1997 Jun;18(12)∶839
, 百拇医药
6 Yamaguchi Y, Okada T, Yokota E et al. Prosthetic endocarditis caused by Kingella denitrificans in a patient with diabetes mellitus Kansenshogaku-Zasshi, 1997; 71(7)∶675
7 Gristina AG. Biomaterials-centered infection:microbial adhesion versus tissue integration. Science, 1987; 237∶1585
8 Sugarman B, Musher D. Adherence of bacteria to suture materials. Proc Soc Exp Biol Med, 1981; 167∶156
9 Sener E, Yamak B, Katircioglu SF et al. Risk factors of reoperations for prosthetic heart valve dysfunction in the ten years 1984-1993. Thorac Cardiovasc Surg, 1995; 43(3)∶148
10 Zussa C, Polesel E, Uberto et al. Seven-Year experience with chordal replacement with expanded polytetrafluoroethylene in floppy mitral valve. J Thorac Cardiovasc Surg, 1994; 108(1)∶37
(收稿：1998-06-26), 百拇医药
单位：黄云超 张尔永 石应康 田子朴 周清华 (华西医科大学 附属第一医院胸心外科，成都 610041)；雷 蕾 贾文祥(华西医科大学 微生物教研室，成都 610041)
关键词：人工心瓣；生物材料；细菌粘附
生物医学工程学杂志990402 摘要 通过体外实验，评价人工心瓣心内膜炎常见致病菌对人工心瓣材料粘附情况，初步建立人工心瓣材料细菌粘附的测定方法。采用平板菌落计数法、125I标记细菌放射性测定法，测定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对涤纶、热解碳、聚四氟乙烯的粘附情况。结果四种细菌对三种材料粘附能力与细菌生长曲线基本一致。四种细菌对涤纶粘附较强，特别是金黄色葡萄球菌对涤纶粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少。表皮葡萄球菌对热解碳的粘附最强，绿脓杆菌对热解碳的粘附维持在高水平状态。大肠杆菌、绿脓杆菌对聚四氟乙烯粘附最强。结论：不同细菌对同一种人工心瓣材料或同一种细菌对不同的人工心瓣材料有不同粘附能力。
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Study of Bacterial Adhesion to Prosthetic Valve
Materials in Vitro
Huang Yunchao1** Zhang Eryong1 Shi Yingkang1 Tian Zipu1
Zhou Qinghua1 Lei Lei2 Jia Wenxiang2
1 (Department of Cardiothoracic Surgery, The University Hospital, West China University of
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Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (The Institute of Microbiology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract This article reports a study of the bacterial adhesion to prosthetic valve materials in vitro. The method for assessing the degree of bacterial adhesion to prosthetic valve materials was established primarily.The capacities of staphylococcus aureus(SA), staphylococcus epidermidis(SE), Escherichia Coli(EC) and Pseudomonas aeruginosa(PA) for adhesion to Dacron, Pyrolytic carbon and polytetrofluoroethylene(PTFE) were quantitatively determined by the plate counting and Gamma-ray counting of 125I radiolabeled bacteria in vitro. The results showed that the capacities of four types of bacteria for adhesion to Dacron, Pyrolytic carbon and PTFE coincided with the bacterial-growth curve. The capacities of four bacteria for adhering to Dacron were stronger. The adhesion of SE to Pyrolytic carbon was the strongest. The adhesion of PA Kept up a high level.The capacities of EC and PA for adhering to PTFE were the strongest. The results indicate that the capacities of different types of bacteria for adhesion to the same prosthetic valve material are different, and the capacities of one type of bacteria for adhesion to different materials are also different.
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Key words Prosthetic valve Biomaterials Bacterial adhesion
人工瓣膜置换术后人工瓣膜心内膜炎(Prosthetic Valve Edocarditis PVE)，对于瓣膜置换的病人往往是一个灾难性的后果[1]。近来很多国外研究表明[2]：这种生物材料植入后引起机体感染的初始动因就是细菌粘附在生物材料表面，国内对这方面研究尚属空白。人工心瓣无论是机械心瓣膜或生物心瓣膜都是多种生物材料的复合体，是哪种材料易引起细菌粘附，细菌对不同人工心瓣材料的动态粘附情况，迄今尚未见报道。本研究的目的在于通过体外实验，评价PVE常见致病菌对人工心脏瓣膜材料的体外粘附情况，初步建立人工心瓣材料细菌粘附的测定方法，并为在人工心瓣材料表面进行改性，提高生物材料的抗细菌粘附能力奠定工作基础。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 心瓣膜生物材料
涤纶(Dacron,D)苏州织带厂人造血管研究室；聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene,PTFE)Teflon-GoreTex W.L. Gore & Associates, Inc. Arizona美国；热解碳片(Pyrolytic Carbon, PC)：四川大学高分子材料系。将三种材料制成面积1.5 cm2半园型，厚度0.5 mm，高温消毒。
1.2 细菌
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA) 大肠杆菌(Escherichia coli, EC)
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, SE) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)所有细菌为标准株
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1.3 125I标记细菌悬液的制备
取斜面保种的细菌种植在液体培养基中，37 ℃恒温培养16 h。接种于平板培养基，培养24 h，取单个菌落于液体培养基中37 ℃培养24 h，得到菌液。小鼠毒力回复实验与其标准比较，无统计学差异。取9.9 ml液体培养基加0.1 ml菌液，再加入10 μl 5-125I-2′-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UDR，中国科学院原子能研究院)，37 ℃培养6 h。将菌液离心，除去上清液，加入生理盐水，旋涡混合器中振荡，使沉淀后的细菌再悬浮于生理盐水中，重复三次，去除未标记细菌的125I-UDR。采用平板计数法测定菌液的细菌浓度，γ-射线计数法测定放射性强度。根据菌液稀释倍数，放射性强度的测定值，推算出125I标记的细菌菌液浓度及与放射性强度的关系，稀释成实验所需的浓度。制成5种细菌悬液。
1.4 不同细菌生长曲线的测定
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按液体培养基2 ml加125I-UDR 1 μl比例加入125I-UDR和液体培养基入消毒锥形瓶中，锥形瓶编号：1、2、3和4号，在1、2、3号锥形瓶中加入125I标记的同一种细菌菌液各2 ml(已稀释成105CFU/ml)。在1号锥形瓶放入热解碳，2号放入涤纶，3号放聚四氟乙烯，4号放入热解碳、涤纶、聚四氟乙烯。将锥形瓶放入36.8～37.0 ℃水浴摇床振摇培养30 h，间隔2 h在每个锥形瓶中取定量的菌液测定细菌浓度。
同时取定量的菌液离心，除去上清液，再加生理盐水，旋涡混合器振荡，使沉淀细菌悬浮于生理盐水中，去除未标记细菌的125I-UDR，测定放射性强度。取各时点细菌浓度，放射性强度得到细菌的生长曲线与放射性强度的关系。
1.5 细菌对人工心瓣材料粘附的测定
从测定细菌生长曲线所用的锥形瓶1、2、3号中分别在0、6、12、18、24、30 h等时点各取出材料4片，4号锥形瓶在每个等时点取出热解碳、涤纶、聚四氟乙烯各1片。所有锥形瓶取出的材料，每片用20 ml PBS液冲洗材料2次，去除未粘附的细菌和附着在材料上游离的125I-UDR，测定材料的放射性强度。因4号锥形瓶未放细菌，热解碳、涤纶、聚四氟乙烯经冲洗后测得的放射性强度，是未被冲洗掉游离的125I-UDR，在计算1、2、3号锥形瓶中热解碳、涤纶、聚四氟乙烯的放射性强度时，应减去相同时点所测得的4号锥形瓶相同其材料的放射性强度。根据生长曲线将其换算成细菌数，除以材料面积得到CFU/cm2。
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1.6 统计学处理
两因素或多因素的方差分析，Logrank检验法α=0.05为检验水准。所有细菌数在制图时换算成细菌数的对数。
2 结 果
图1为细菌的生长曲线。
图1 细菌的生长曲线
Fig 1 Bacterial-growth curve
图2 涤纶的细菌粘附
Fig 2 Adhesion of bacteria to Dacron
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从图2看出四种细菌对涤纶的粘附情况。金葡、大肠杆菌持续在比较高水平。而且金葡粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少，与其它三种细菌比较，差异有非常显著性(P<0.01)。图3看出表皮葡萄球菌对热解碳的粘附最强，在高峰期与其它三种细菌差异有显著性(P<0.05)。但绿脓杆菌对其粘附维持在持续高水平状态，未见到随生长曲线进入衰退期有下降的趋势(P<0.01)。图4看出大肠杆菌、绿脓杆菌对聚四氟乙烯的粘附最强，与金葡菌、表葡菌对其粘附差异有非常显著性(P<0.01)。
图3 热解碳的细菌粘附
Fig 3 Adhesion of bacteria to PC
图4 聚四氟乙烯细菌粘附
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Fig 4 Adhesion of bacteria to PTFE
从以上研究结果显示细菌对材料的粘附与细菌生长曲线关系密切，粘附高峰多在对数期和稳定期。但不一定随衰亡期而下降，不同细菌对同一材料粘附差异较大。
3 讨论
近30年来，随着生物材料人工器官的广泛应用，以生物材料为中心的感染(Biomaterial Centered Infection,BCI)发病率明显增高，而最灾难性的BCI当属PVE，发生率占瓣膜置换术的1%～9%，死亡率3%～60%[3]，有的早期死亡率高达80%以上[3]。近来许多研究表明，在BCI的发生、发展过程中，材料、细菌、宿主三大因素是相互联系的，特别是细菌与材料的相互作用和粘附是引起感染的初始动因[2]。无论机械心瓣膜或生物心瓣膜都是多种生物材料的复合体。常用的热解碳、涤纶、聚四氟乙烯、牛心包等，既是不同人工心瓣膜的组成成份，也是人工血管及修补心内缺损的常用材料。本研究结果发现不同细菌对人工心瓣材料粘附差异较大，很可能是所用材料不同，制成人工心瓣后引起PVE的发病率不同[4]的重要原因之一。
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3.1 细菌生长曲线与细菌对人工心瓣材料粘附的关系
细菌在合适的液体培养基中生长，生长速度随时间而变化。生长曲线就是细菌在体外液体培养过程中，定时测量细菌数绘制的曲线。细菌生长分为迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。除细菌自身的因素外，由于培养条件，培养基成分不同，生长过程差异较大，不同细菌生长曲线也不完全一样。Schierhdz等[5]在培养基中加入一些骨科用作骨髓腔的填充物质，发现对细菌生长有促进作用。同种细菌在液体培养基中分别加入涤纶、聚四氟乙烯、热解碳材料后。不同材料之间对细菌生长无统计学差异(P>0.05)，说明三种不同材料对细菌在培养基中生长影响无差异。
细菌在培养生长过程中，一旦遇到能与之结合的生物材料或吸附在材料表面上蛋白层中的受体，则牢固的粘附在生物材料表面。细菌粘附除材料上受体外，与细菌在生长繁殖过程中生物学活性有关。细菌在生长曲线的对数期，生长迅速，分裂繁殖快，分泌物多，是细菌粘附力最强的时期。本实验所用的四种细菌，对三种人工心瓣材料的粘附高峰主要在对数期。
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本实验观察到，金黄色葡萄球菌对涤纶的粘附，绿脓杆菌对热解碳的粘附，不随生长曲线进入衰亡期而下降，表皮葡萄球菌对涤纶、热解碳的粘附下降缓慢。可能是由于培养过程中，粘附在材料上细菌改变表现型，在培养进入衰亡期，且外界能量供给不足情况下仍能长期存活。因此细菌对人工心瓣的粘附，与细菌的生长曲线关系密切，处于生长曲线不同时期的细菌，粘附能力不同。本研究表明：细菌对材料的粘附与细菌的生长曲线一样，是一个动态变化过程。在生长曲线的不同时期，同一细菌对同一材料的粘附变化较大，不是随时间推移而持续增高或恒定不变。
3.2 不同细菌对同种人工心瓣材料的粘附
随着人工心瓣的应用，临床上发现引起PVE致病菌种类增多。常见的金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、链球菌、大肠杆菌等占80%～90%。而有的特殊细菌，仅在人工心瓣植入机体后才发现引起感染[6]，这可能与不同细菌对人工心瓣材料粘附不同有关，只有在生物材料存在时，才为某些特殊细菌提供相应受体。本实验发现：所选的四种常见PVE致病菌对涤纶的粘附均较强，特别是大肠杆菌、金葡菌，持续在比较高的水平，且金葡菌的粘附不随生长曲线进入衰亡期而减少；对热解碳的粘附，以表葡菌最强，绿脓杆菌维持在高水平状态，不随生长曲线进入衰亡期而下降；对聚四氟乙烯的粘附以大肠杆菌、绿脓杆菌最强，与Gristina等[7]研究结果类似。不同细菌对同一材料不同的粘附现象，有利于理解为什么不同细菌引起的PVE发病率、严重程度变化多样。
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多种细菌遇到同一生物材料后表现为一种竞争性粘附现象。这种竞争能力与临床上认为的细菌毒力强弱关系不大。如本实验所用的表皮葡萄球菌、绿脓杆菌这两种条件致病菌，在对热解碳的粘附中占有优势，对涤纶的粘附弱。由此可见，人工心瓣置换术后的病人，发生菌血症、败血症时，应密切注意感染细菌与所用人工心瓣材料的粘附情况，防止PVE的发生。
3.3 同种细菌对不同人工心瓣材料的粘附
生物材料表面的化学组成、临界表面张力、界面能、表面亲水、疏水性、表面电荷等对细菌的粘附影响较大。表现为同种细菌对不同生物材料具有不同的粘附率[7]。本研究所用的4种细菌对涤纶的粘附多数时间强于对热解碳和聚四氟乙烯粘附。Sugarman B等[8]在研究外科各种手术缝线细菌粘附时也发现肠线的细菌粘附是尼龙线的100倍，同种材料编织线的细菌粘附比非编织线高。
在人工心瓣膜的结构中，热解碳主要构成机械瓣的瓣叶、瓣架。表面光滑，不易被细菌粘附。但本实验发现表皮葡萄球菌对其粘附明显比对聚四氟乙烯强；绿脓杆菌对其粘附持续维持在比较高水平，这或许可以从细菌粘附的角度解释在PVE的发病中，机械瓣比生物瓣高[9]。涤纶包绕生物瓣或机械瓣的瓣架，在瓣膜置换中直接缝于宿主心脏的瓣环上。它由纤维编织而成，细菌对其粘附普遍较强。本实验发现：金葡菌对涤纶的粘附明显比对热解碳、聚四氟乙烯强。表葡菌对涤纶的粘附与对热解碳、聚四氟乙烯相比，也维持在比较高的水平。绿脓杆菌对三种材料的粘附，也是以涤纶在高峰期最高。因此，不论是换瓣，或者是心内缺损用涤纶作修补，一旦发生菌血症或败血症，细菌容易粘附在其表面。聚四氟乙烯与涤纶属于聚合物类物质，但前者结构严密，与机体组织相容性好，用途广泛，是目前用得最多的血管材料。Zussac等[10]用聚四氟乙烯行二尖瓣腱索置换，效果良好，认为是腱索最好的替代物。在本实验所用的四种细菌，对其粘附均较低。相比较而言，绿脓杆菌对其粘附较强，持续在高水平状态。这可能是应用聚四氟乙烯后引起PVE中，绿脓杆菌是主要病原菌之一的原因所在。
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由此可见，在选择人工心瓣制作材料时防止与减少细菌粘附应当予以考虑，对材料进行表面改性，防止细菌粘附工作值得深入研究。
* 国家自然科学基金资助项目(39670717)
黄云超 现单位为昆明医学院第二附属医院胸心外科(650101)
参考文献
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(收稿：1998-06-26), 百拇医药