PBP2a体外诱导与MRSA的耐药关系
作者：吴本权 唐英春 张扣兴 张天托 朱家馨 谈淑卿
单位：中山医科大学附属第三医院内科； 广州， 510630
关键词：蛋白结合；药物作用；甲氧西林抗药性；葡萄球菌，金黄色；药物作用；药物疗法；抗生素类，内酰胺；治疗应用
中山医科大学学报/990311
摘要 目的：探讨作用于不同青霉素结合蛋白(PBPs)靶位点的 β-内酰胺抗生素联合用药对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)体外抗菌活性的影响及其PBP2a的诱导作用。方法：测定头孢拉啶和头孢氨噻肟单独和联合对MRSA的最小抑菌浓度(MIC)和联合抑菌分数(FIC)，以甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)作对照；用SDS-PAGE法分离细菌膜蛋白，用分光光度扫描仪分别测定两种药物单独及联合使用前后菌膜耐药蛋白PBP2a的相对含量。结果：头孢拉啶对20株MRSA的MIC50、MIC90分别为128 mg/L、512 mg/L，头孢氨噻肟为16 mg/L、256 mg/L；两药联合应用时：头孢拉啶的FIC50、FIC90为4 mg/L、64 mg/L，头孢氨噻肟为2 mg/L、32 mg/L，FIC指数≤0.5，两药联合有良好的协同作用。两药单独应用都能在一定范围诱导MRSA大量表达PBP2a，而联合用药却不会诱导PBP2a的表达增多。结论：作用于不同PBPs靶位点的β-内酰胺抗生素联合用药不诱导耐药蛋白PBP2a的表达，从而具有良好的协同作用。
, 百拇医药
中图号 R 453.2
Study on the Relationship between the Induction
in Vitro of PBP2a and MRSA Resistance
Wu Benquan Tang Yingchun Zhang Kouxing Zhang Tiantuo Zhu Jiaxin Tan Shuqing
(The Department of Internal Medicine, the 3 Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen
University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630)
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate the effects of β-lactam binding PBPs sites in combination on anti-MRSA activities in vitro and induction of PBP2a. Methods: MIC(FIC) of cephradine and cefotaxime alone or in combination against MRSA were measured. Bacterial membrane proteins were induced with the two drugs and identified by SDS-PAGE. The relative amount of PBP2a was quatitatively analyzed with densitometer. Results:MIC50 and MIC90 of cephradine against 20 strains of MRSA were 128 mg/L,512 mg/L and that of cefotaxime 16 mg/L, 256 mg/L, respectively. When the two drugs were combined, FIC50 and FIC90 of cephradine were 4 mg/L, 64 mg/L and that of cefotaxime 2 mg/L,32 mg/L,respectively and FIC index ≤0.5. Conclusion: β-lactam binding various PBPs sites in combination have a synergism and don′t induce over expression of PBP2a.
, 百拇医药
Subject headings protein binding/drug effects; methicillin resistance,staphylococcus aureus/drug effects; anti-biotics, lactoun/therapeutic use
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)致病性与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus,MSSA)相似，是医院内感染的重要致病菌之一[1]。它几乎对包括甲氧西林在内的所有抗生素耐药，目前只有万古霉素有效，而且已出现对万古霉素中度敏感的MRSA。因此，寻找可能的抗菌途径有重要意义，本实验就作用于不同青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)靶位点的β-内酰胺抗生素联合用药对MRSA的抗菌活性，以及对低亲和性青霉素结合蛋白(penicillin binding protein2a, PBP2a)的诱导作用进行探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂
MRSA20株MSSA10株为1995～1997年住院病人痰检标本中分离。L-Broth培养基(修改)：NaCl 40 g，酵母浸膏5 g，胰蛋白胨10 g，pH 7.2。Maeller Hinton培养基：牛肉浸膏2 g，水解酪蛋白17.5 g，淀粉1.5 g，加蒸馏水1 L。细菌膜蛋白提取试剂：lyostaphin 50 mg/L(Sigma)，脱氧胆酸钠10 g/L，磷酸钠缓冲液(Na3PO4) 50 mmol/L，氯化镁(MgCl2)10 mmol/L，pH 7.2。凝胶储备液：300 g/L，丙烯酰胺 80 g/L，N，N-亚甲双丙酰胺 0.6 g/L。蛋白质分子标准品(上海生化试剂厂)。头孢拉啶(cephradine)(中美上海施贵宝制药有限公司)；头孢氨噻肟(cefotaxime)(德国赫斯特公司)。
, http://www.100md.com
1.2 MRSA鉴定方法
琼脂板稀释法：参照NCCLS标准，从临床痰标本分离的金葡菌转种至L-B培养基，培养24 h，配成1010CFU/L的细菌悬液，沾取1.2 μL接种至M-H琼脂板上(M-H平板含40 g/L NaCl，对倍稀释的Oxacillin)直径约5～8 mm的圆形区，32 ℃孵育24 h，MIC≥4 mg/L为MRSA。 MRSA特异性MecA基因的PCR检测：按常规方法抽提细菌DNA， PCR循环条件参照詹文华等[2]，在20 g/L琼脂糖上电泳，623 bp处出现强荧光带为耐药株MRSA，并设阴性及阳性对照。
1.3 体外药物敏感实验
头孢拉啶和头孢氨噻肟按对倍稀释法加入pH 7.2，40 g/L NaCl的M-H琼脂板中，借用多点接种仪，接种20株MRSA和10株MSSA， 32 ℃培养24 h观察结果，测定MIC50、MIC90。
, http://www.100md.com
1.4 体外联合抑菌实验
首先分别测定拟联合的抗生素，头孢拉啶和头孢氨噻肟对MRSA，MSSA的MIC。根据两药的MIC确定药物联合抑菌的8个稀释度，按棋盘法对倍稀释，从高到低得到两药各种浓度配对。用多点接种仪分别接种MRSA、MSSA(1010 CFU/L)至不同浓度M-H平板中。测定FIC50、FIC90和FIC指数[3]。
1.5 PBP2a的诱导
从L-B平板挑单个MRSA菌落至15 mL L-B液体培养基振荡16 h至对数生长期，转种至300 mL改良的L-B培养基(接种量50 mL/L)32 ℃震荡过夜，细菌收获前1.5 h加入β-内酰胺抗生素作为诱导剂，离心获取细菌，加入lysostaphin 30 ℃孵育30 min，超声粉碎细菌，上清100 000×g， 4 ℃离心1 h，沉淀加10 g/L脱氧胆酸钠游离膜蛋白。用80 g/L丙烯酰胺及0.6 g/L单丙烯酰胺行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色。参照分子量标志物同步电泳所制的对数曲线图，根据PBP2a相对分子质量78 ku及被β-内酰胺抗生素诱导来确定PBP2a在凝胶板的位置，用分光光度扫描仪测定PBP2a的相对含量[4]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 头孢拉啶(PBP3)和头孢氨噻肟(PBP2)联合用药对MRSA体外抗菌活性
头孢拉啶联合时对MRSA的MIC50即FIC50为4 mg/L,FIC90 64 mg/L,而单独用药MIC50为128 mg/L，MIC90 512 mg/L；头孢氨噻肟联合时对MRSA的FIC50为2 mg/L，FIC90 32 mg/L，单独用药MIC50为16 mg/L，MIC90 256 mg/L，两药联合时各自的最小抑菌浓度均明显低于单独用药。两种抗生素对MSSA和MRSA的FIC指数均≤0.5，有良好的协同作用。由于耐药蛋白PBP2a对MRSA的保护作用，两药对MRSA抑菌浓度明显高于MSSA，结果见表1。
, http://www.100md.com
2.2 头孢拉啶和头孢氨噻肟单独应用能诱导耐药蛋白PBP2a的大量表达
头孢拉啶和头孢氨噻肟分别以不同浓度作用于10株MRSA，其中7株在相对分子质量78 ku处出现明显的蓝色蛋白浓集带为PBP2a，分光光密度扫描仪测定其相对含量显示，随着药物浓度递增PBP2a的平均相对含量增多，头孢拉啶的最佳诱导浓度1 mg/L，此时诱导的PBP2a平均相对含量(19.4±2.9)%明显高于无药对照组(12.0±1.5)%(P<0.01)，随后开始下降，但仍然高于无药组。头孢氨噻肟浓度达到0.2 mg/L时，诱导PBP2a最多(20.9±1.9)% (P<0.01)，，药物最佳诱导浓度峰值前移，显示较头孢拉啶更强的诱导活性，见图1。
图1 头孢拉啶和头孢氨噻肟单独或联合对MRSA PBP2a表达的诱导作用
, 百拇医药
Fig.1 Inducing effects of cephradine and cefotaxime alone
or in combination on PBP2a expression in MRSA
Cephradine and cefotaxime alone induced different amount of PBP2a at 5-fold dilution of MICs. The relative amount of PBP2a increased along with their higher MICs before the optimum inducing concentration, but the two drugs combined did not induce over expression of PBP2a
, http://www.100md.com
2.3 头孢拉啶和头孢氨噻肟联合应用不诱导MRSA耐药蛋白PBP2a的表达
联合用药后各个浓度梯度均不能诱导PBP2a表达增加，与单独用药比较，有8株MRSA出现相对分子质量78 ku的蓝色蛋白带即PBP2a淡染和变细，在两药合用的药物浓度上升致25 mg/L之前，PBP2a平均相对含量与对照组比较无显著差异(P>0.05)，当药物浓度增加到25 mg/L PBP2a表达减少(9.8±1.8)%，低于无药对照组(11.9±1.6)% (P<0.01)。联合用药高浓度时对PBP2a产生了破坏作用。从图1可以看出两药单独应用时PBP2a随药物浓度增加而上升，达到最高时开始下降，两药联合时则呈一平缓曲线。
表1 头孢拉啶和头孢氨噻肟联合对MRSA的体外抗菌活性
, http://www.100md.com
Table 1 Antimicrobial activities of cephradine and cefotaxime in combination against MRSA in vitro (c/mg.L-1) Antibiotics
Range
MIC(FIC)50
MIC(FIC)90
MSSA
MRSA
MSSA
MRSA
MSSA
, 百拇医药
MRSA
Cephradine
0.5～2.0
64～1024
1.0
128
2.0
512
Cefotaxime
0.25～1.0
8～512
1.0
16
, http://www.100md.com
1.0
256
Cephradine
0.06～0.5
0.5～125
0.25
4
0.5
64
(combination)
Cefotaxime
0.03～0.25
, 百拇医药
1～64
0.125
2
0.125
32
(combinatioin)
1) FIC index≤0.5; against 20 strains of MRSA and 10 of MSSA3 讨论
本实验应用作用不同PBPs靶位点的头孢拉啶和头孢氨噻肟对PBP2a的诱导作用，探讨临床上MRSA的广泛耐药与β-内酰胺抗生素应用关系和可能的抗菌途径。有报道，在一定剂量β-内酰胺抗生素作用下MRSA表达大量PBP2a，并且证实诱导增多的PBP2a在相对长的时间内保护细菌避免抗生素的攻击，抗生素浓度不同诱导的PBP2a含量不同，不同抗生素最佳诱导浓度亦不相同[4，5]。本实验发现头孢拉啶最佳诱导浓度为1.0 mg/L，而头孢氨噻肟为0.2 mg/L，达到最佳浓度后进一步增加抗生素剂量PBP2a开始下降。从两药最佳诱导浓度可以看出头孢氨噻肟更容易诱导MRSA高度耐药。在最佳诱导浓度前，随抗生素浓度增加PBP2a的含量亦增加(P<0.01)，与国外的报道相近[4]，提示盲目增加抗生素剂量会诱导严重耐药的MRSA出现。
, 百拇医药
抗生素必须与PBP结合才能破坏该蛋白酶的肽聚糖转肽功能，产生抗菌作用，耐酶的β-内酰胺抗生素广泛使用诱导MRSA产生低亲合性PBP2a，PBP2a与所有β-内酰胺抗生素亲合性极低，但具有其它PBP的生物学功能，能维持细菌胞壁肽聚糖的正常代谢，从而使MRSA逃避抗生素攻击[5]。作用不同PBPs的β-内酰胺抗生素联合会产生多靶蛋白的破坏作用。由于头孢拉啶主要作用于PBP3，头孢氨噻肟作用于PBP2，前者影响细菌分裂，后者参与胞壁肽聚糖合成，因此两药合用抗菌性增强。
本研究显示头孢拉啶和头孢氨噻肟单独应用时，对MRSA和MSSA的MIC50、MIC90均明显高于两药联合使用，单独用药对MRSA的抗菌活性较差，但对MSSA显示较强的抗菌作用，两种药物对耐药菌与敏感菌的MIC50分别相差近10～100倍以上。头孢拉啶和头孢氨噻肟联合用药时对耐药菌和敏感菌的抗菌活性均明显增强，其FIC指数均≤0.5，具有良好的协同作用。就高度耐药的MRSA而言，由于PBP3和PBP2为金黄色葡萄球菌存活所必需，特异性作用于此类PBP靶位点的抗生素具有联合应用的前景。结果亦表明两种药物联合时各个浓度对PBP2a均无诱导作用(P>0.05)，并且当抗生素浓度升至25 mg/L时PBP2a含量则减少，(9.8±1.8)%，低于对照组(11.9±1.6)%(P<0.01)。因此不仅具有良好的协同作用，而且不会诱导MRSA耐药增强。Uete T,Matsuda K等证实，作用于金黄色葡萄球菌PBP4的头霉素与作用于其它PBPs的β-内酰胺抗生素联合应用具有良好的协同作用，推测可能对PBP2a的影响有关[3，7]。β-内酰胺抗生素联合应用在临床上已经取得了良好的效果，如青霉素类与2、3代头孢菌素合用治疗严重革兰阴性杆菌感染。这种联合减少了与氨基甙类联用的毒副作用，但作用方式或机制相同的抗生素以不合用为宜[6]，象作用于同一PBPs靶位点的抗生素合用会产生相互拮抗作用。
, 百拇医药
临床可以用两药联合来治疗MSSA感染，并可预防尚未确诊的MRSA感染，以防单独用药耐药性进一步增强，为种种原因不适合使用万古霉素或出现万古霉素耐药时提供一种新的抗菌途径。
参考文献
1.Mulligan M E, Murray leisure K A, Ribner R S. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus:A consensus review of the microbiology, pathogenesis, and epidemiology mith implications for prevention and management. Am J Med, 1993,94(3):313
2.詹文华，竹村弘，东山康仁，等. PCR 法检测耐甲氧苯青霉素金葡菌的MecA基因. 中山医科大学学报，1995，16(3)：35
, http://www.100md.com
3.Uete T, Matsuo K. Synergistic enhancement of in vitro antimicrobial activity of Cefmetazole and cefazolin, cefotiam, cefamandole or cefoperazone in combination against methicillin-sensitive and resistant Staphylococcus aureus. Jap J Antibiotics, 1995,553(113):48
4.Tomasz A, Drugeon H B, Lencastre H M P. New mechanism for methicillin-resistance in Staphylococcus aureus: Clinical isolates that lack the PBP2a gene and contain normal penicillin-binding proteins with modified penicillin-binding capacity.Antimicrob Agents Chemother, 1989,33(11):1869
, 百拇医药
5.Murakami K, Nomurak K, Doi M, et al. Production of low-affinity penicillin-binding pretein by low and high-resistance groups of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother,1987,31(9):1307
6.戴自英. 抗菌药物的治疗性应用. 见：戴自英主编. 实用抗菌药物学. 上海：上海科学技术出版社， 1992. 74～75
8.Matsuda K, Nakamura K, Adachi Y, et al. Autolysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus is involved in synergism between impenem and cefotiam. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39(12):2631
1998 - 10 - 07收稿
1999 - 04 - 23修回
, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第三医院内科； 广州， 510630
关键词：蛋白结合；药物作用；甲氧西林抗药性；葡萄球菌，金黄色；药物作用；药物疗法；抗生素类，内酰胺；治疗应用
中山医科大学学报/990311
摘要 目的：探讨作用于不同青霉素结合蛋白(PBPs)靶位点的 β-内酰胺抗生素联合用药对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)体外抗菌活性的影响及其PBP2a的诱导作用。方法：测定头孢拉啶和头孢氨噻肟单独和联合对MRSA的最小抑菌浓度(MIC)和联合抑菌分数(FIC)，以甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)作对照；用SDS-PAGE法分离细菌膜蛋白，用分光光度扫描仪分别测定两种药物单独及联合使用前后菌膜耐药蛋白PBP2a的相对含量。结果：头孢拉啶对20株MRSA的MIC50、MIC90分别为128 mg/L、512 mg/L，头孢氨噻肟为16 mg/L、256 mg/L；两药联合应用时：头孢拉啶的FIC50、FIC90为4 mg/L、64 mg/L，头孢氨噻肟为2 mg/L、32 mg/L，FIC指数≤0.5，两药联合有良好的协同作用。两药单独应用都能在一定范围诱导MRSA大量表达PBP2a，而联合用药却不会诱导PBP2a的表达增多。结论：作用于不同PBPs靶位点的β-内酰胺抗生素联合用药不诱导耐药蛋白PBP2a的表达，从而具有良好的协同作用。
, 百拇医药
中图号 R 453.2
Study on the Relationship between the Induction
in Vitro of PBP2a and MRSA Resistance
Wu Benquan Tang Yingchun Zhang Kouxing Zhang Tiantuo Zhu Jiaxin Tan Shuqing
(The Department of Internal Medicine, the 3 Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen
University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630)
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate the effects of β-lactam binding PBPs sites in combination on anti-MRSA activities in vitro and induction of PBP2a. Methods: MIC(FIC) of cephradine and cefotaxime alone or in combination against MRSA were measured. Bacterial membrane proteins were induced with the two drugs and identified by SDS-PAGE. The relative amount of PBP2a was quatitatively analyzed with densitometer. Results:MIC50 and MIC90 of cephradine against 20 strains of MRSA were 128 mg/L,512 mg/L and that of cefotaxime 16 mg/L, 256 mg/L, respectively. When the two drugs were combined, FIC50 and FIC90 of cephradine were 4 mg/L, 64 mg/L and that of cefotaxime 2 mg/L,32 mg/L,respectively and FIC index ≤0.5. Conclusion: β-lactam binding various PBPs sites in combination have a synergism and don′t induce over expression of PBP2a.
, 百拇医药
Subject headings protein binding/drug effects; methicillin resistance,staphylococcus aureus/drug effects; anti-biotics, lactoun/therapeutic use
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)致病性与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus,MSSA)相似，是医院内感染的重要致病菌之一[1]。它几乎对包括甲氧西林在内的所有抗生素耐药，目前只有万古霉素有效，而且已出现对万古霉素中度敏感的MRSA。因此，寻找可能的抗菌途径有重要意义，本实验就作用于不同青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)靶位点的β-内酰胺抗生素联合用药对MRSA的抗菌活性，以及对低亲和性青霉素结合蛋白(penicillin binding protein2a, PBP2a)的诱导作用进行探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂
MRSA20株MSSA10株为1995～1997年住院病人痰检标本中分离。L-Broth培养基(修改)：NaCl 40 g，酵母浸膏5 g，胰蛋白胨10 g，pH 7.2。Maeller Hinton培养基：牛肉浸膏2 g，水解酪蛋白17.5 g，淀粉1.5 g，加蒸馏水1 L。细菌膜蛋白提取试剂：lyostaphin 50 mg/L(Sigma)，脱氧胆酸钠10 g/L，磷酸钠缓冲液(Na3PO4) 50 mmol/L，氯化镁(MgCl2)10 mmol/L，pH 7.2。凝胶储备液：300 g/L，丙烯酰胺 80 g/L，N，N-亚甲双丙酰胺 0.6 g/L。蛋白质分子标准品(上海生化试剂厂)。头孢拉啶(cephradine)(中美上海施贵宝制药有限公司)；头孢氨噻肟(cefotaxime)(德国赫斯特公司)。
, http://www.100md.com
1.2 MRSA鉴定方法
琼脂板稀释法：参照NCCLS标准，从临床痰标本分离的金葡菌转种至L-B培养基，培养24 h，配成1010CFU/L的细菌悬液，沾取1.2 μL接种至M-H琼脂板上(M-H平板含40 g/L NaCl，对倍稀释的Oxacillin)直径约5～8 mm的圆形区，32 ℃孵育24 h，MIC≥4 mg/L为MRSA。 MRSA特异性MecA基因的PCR检测：按常规方法抽提细菌DNA， PCR循环条件参照詹文华等[2]，在20 g/L琼脂糖上电泳，623 bp处出现强荧光带为耐药株MRSA，并设阴性及阳性对照。
1.3 体外药物敏感实验
头孢拉啶和头孢氨噻肟按对倍稀释法加入pH 7.2，40 g/L NaCl的M-H琼脂板中，借用多点接种仪，接种20株MRSA和10株MSSA， 32 ℃培养24 h观察结果，测定MIC50、MIC90。
, http://www.100md.com
1.4 体外联合抑菌实验
首先分别测定拟联合的抗生素，头孢拉啶和头孢氨噻肟对MRSA，MSSA的MIC。根据两药的MIC确定药物联合抑菌的8个稀释度，按棋盘法对倍稀释，从高到低得到两药各种浓度配对。用多点接种仪分别接种MRSA、MSSA(1010 CFU/L)至不同浓度M-H平板中。测定FIC50、FIC90和FIC指数[3]。
1.5 PBP2a的诱导
从L-B平板挑单个MRSA菌落至15 mL L-B液体培养基振荡16 h至对数生长期，转种至300 mL改良的L-B培养基(接种量50 mL/L)32 ℃震荡过夜，细菌收获前1.5 h加入β-内酰胺抗生素作为诱导剂，离心获取细菌，加入lysostaphin 30 ℃孵育30 min，超声粉碎细菌，上清100 000×g， 4 ℃离心1 h，沉淀加10 g/L脱氧胆酸钠游离膜蛋白。用80 g/L丙烯酰胺及0.6 g/L单丙烯酰胺行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色。参照分子量标志物同步电泳所制的对数曲线图，根据PBP2a相对分子质量78 ku及被β-内酰胺抗生素诱导来确定PBP2a在凝胶板的位置，用分光光度扫描仪测定PBP2a的相对含量[4]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 头孢拉啶(PBP3)和头孢氨噻肟(PBP2)联合用药对MRSA体外抗菌活性
头孢拉啶联合时对MRSA的MIC50即FIC50为4 mg/L,FIC90 64 mg/L,而单独用药MIC50为128 mg/L，MIC90 512 mg/L；头孢氨噻肟联合时对MRSA的FIC50为2 mg/L，FIC90 32 mg/L，单独用药MIC50为16 mg/L，MIC90 256 mg/L，两药联合时各自的最小抑菌浓度均明显低于单独用药。两种抗生素对MSSA和MRSA的FIC指数均≤0.5，有良好的协同作用。由于耐药蛋白PBP2a对MRSA的保护作用，两药对MRSA抑菌浓度明显高于MSSA，结果见表1。
, http://www.100md.com
2.2 头孢拉啶和头孢氨噻肟单独应用能诱导耐药蛋白PBP2a的大量表达
头孢拉啶和头孢氨噻肟分别以不同浓度作用于10株MRSA，其中7株在相对分子质量78 ku处出现明显的蓝色蛋白浓集带为PBP2a，分光光密度扫描仪测定其相对含量显示，随着药物浓度递增PBP2a的平均相对含量增多，头孢拉啶的最佳诱导浓度1 mg/L，此时诱导的PBP2a平均相对含量(19.4±2.9)%明显高于无药对照组(12.0±1.5)%(P<0.01)，随后开始下降，但仍然高于无药组。头孢氨噻肟浓度达到0.2 mg/L时，诱导PBP2a最多(20.9±1.9)% (P<0.01)，，药物最佳诱导浓度峰值前移，显示较头孢拉啶更强的诱导活性，见图1。
图1 头孢拉啶和头孢氨噻肟单独或联合对MRSA PBP2a表达的诱导作用
, 百拇医药
Fig.1 Inducing effects of cephradine and cefotaxime alone
or in combination on PBP2a expression in MRSA
Cephradine and cefotaxime alone induced different amount of PBP2a at 5-fold dilution of MICs. The relative amount of PBP2a increased along with their higher MICs before the optimum inducing concentration, but the two drugs combined did not induce over expression of PBP2a
, http://www.100md.com
2.3 头孢拉啶和头孢氨噻肟联合应用不诱导MRSA耐药蛋白PBP2a的表达
联合用药后各个浓度梯度均不能诱导PBP2a表达增加，与单独用药比较，有8株MRSA出现相对分子质量78 ku的蓝色蛋白带即PBP2a淡染和变细，在两药合用的药物浓度上升致25 mg/L之前，PBP2a平均相对含量与对照组比较无显著差异(P>0.05)，当药物浓度增加到25 mg/L PBP2a表达减少(9.8±1.8)%，低于无药对照组(11.9±1.6)% (P<0.01)。联合用药高浓度时对PBP2a产生了破坏作用。从图1可以看出两药单独应用时PBP2a随药物浓度增加而上升，达到最高时开始下降，两药联合时则呈一平缓曲线。
表1 头孢拉啶和头孢氨噻肟联合对MRSA的体外抗菌活性
, http://www.100md.com
Table 1 Antimicrobial activities of cephradine and cefotaxime in combination against MRSA in vitro (c/mg.L-1) Antibiotics
Range
MIC(FIC)50
MIC(FIC)90
MSSA
MRSA
MSSA
MRSA
MSSA
, 百拇医药
MRSA
Cephradine
0.5～2.0
64～1024
1.0
128
2.0
512
Cefotaxime
0.25～1.0
8～512
1.0
16
, http://www.100md.com
1.0
256
Cephradine
0.06～0.5
0.5～125
0.25
4
0.5
64
(combination)
Cefotaxime
0.03～0.25
, 百拇医药
1～64
0.125
2
0.125
32
(combinatioin)
1) FIC index≤0.5; against 20 strains of MRSA and 10 of MSSA3 讨论
本实验应用作用不同PBPs靶位点的头孢拉啶和头孢氨噻肟对PBP2a的诱导作用，探讨临床上MRSA的广泛耐药与β-内酰胺抗生素应用关系和可能的抗菌途径。有报道，在一定剂量β-内酰胺抗生素作用下MRSA表达大量PBP2a，并且证实诱导增多的PBP2a在相对长的时间内保护细菌避免抗生素的攻击，抗生素浓度不同诱导的PBP2a含量不同，不同抗生素最佳诱导浓度亦不相同[4，5]。本实验发现头孢拉啶最佳诱导浓度为1.0 mg/L，而头孢氨噻肟为0.2 mg/L，达到最佳浓度后进一步增加抗生素剂量PBP2a开始下降。从两药最佳诱导浓度可以看出头孢氨噻肟更容易诱导MRSA高度耐药。在最佳诱导浓度前，随抗生素浓度增加PBP2a的含量亦增加(P<0.01)，与国外的报道相近[4]，提示盲目增加抗生素剂量会诱导严重耐药的MRSA出现。
, 百拇医药
抗生素必须与PBP结合才能破坏该蛋白酶的肽聚糖转肽功能，产生抗菌作用，耐酶的β-内酰胺抗生素广泛使用诱导MRSA产生低亲合性PBP2a，PBP2a与所有β-内酰胺抗生素亲合性极低，但具有其它PBP的生物学功能，能维持细菌胞壁肽聚糖的正常代谢，从而使MRSA逃避抗生素攻击[5]。作用不同PBPs的β-内酰胺抗生素联合会产生多靶蛋白的破坏作用。由于头孢拉啶主要作用于PBP3，头孢氨噻肟作用于PBP2，前者影响细菌分裂，后者参与胞壁肽聚糖合成，因此两药合用抗菌性增强。
本研究显示头孢拉啶和头孢氨噻肟单独应用时，对MRSA和MSSA的MIC50、MIC90均明显高于两药联合使用，单独用药对MRSA的抗菌活性较差，但对MSSA显示较强的抗菌作用，两种药物对耐药菌与敏感菌的MIC50分别相差近10～100倍以上。头孢拉啶和头孢氨噻肟联合用药时对耐药菌和敏感菌的抗菌活性均明显增强，其FIC指数均≤0.5，具有良好的协同作用。就高度耐药的MRSA而言，由于PBP3和PBP2为金黄色葡萄球菌存活所必需，特异性作用于此类PBP靶位点的抗生素具有联合应用的前景。结果亦表明两种药物联合时各个浓度对PBP2a均无诱导作用(P>0.05)，并且当抗生素浓度升至25 mg/L时PBP2a含量则减少，(9.8±1.8)%，低于对照组(11.9±1.6)%(P<0.01)。因此不仅具有良好的协同作用，而且不会诱导MRSA耐药增强。Uete T,Matsuda K等证实，作用于金黄色葡萄球菌PBP4的头霉素与作用于其它PBPs的β-内酰胺抗生素联合应用具有良好的协同作用，推测可能对PBP2a的影响有关[3，7]。β-内酰胺抗生素联合应用在临床上已经取得了良好的效果，如青霉素类与2、3代头孢菌素合用治疗严重革兰阴性杆菌感染。这种联合减少了与氨基甙类联用的毒副作用，但作用方式或机制相同的抗生素以不合用为宜[6]，象作用于同一PBPs靶位点的抗生素合用会产生相互拮抗作用。
, 百拇医药
临床可以用两药联合来治疗MSSA感染，并可预防尚未确诊的MRSA感染，以防单独用药耐药性进一步增强，为种种原因不适合使用万古霉素或出现万古霉素耐药时提供一种新的抗菌途径。
参考文献
1.Mulligan M E, Murray leisure K A, Ribner R S. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus:A consensus review of the microbiology, pathogenesis, and epidemiology mith implications for prevention and management. Am J Med, 1993,94(3):313
2.詹文华，竹村弘，东山康仁，等. PCR 法检测耐甲氧苯青霉素金葡菌的MecA基因. 中山医科大学学报，1995，16(3)：35
, http://www.100md.com
3.Uete T, Matsuo K. Synergistic enhancement of in vitro antimicrobial activity of Cefmetazole and cefazolin, cefotiam, cefamandole or cefoperazone in combination against methicillin-sensitive and resistant Staphylococcus aureus. Jap J Antibiotics, 1995,553(113):48
4.Tomasz A, Drugeon H B, Lencastre H M P. New mechanism for methicillin-resistance in Staphylococcus aureus: Clinical isolates that lack the PBP2a gene and contain normal penicillin-binding proteins with modified penicillin-binding capacity.Antimicrob Agents Chemother, 1989,33(11):1869
, 百拇医药
5.Murakami K, Nomurak K, Doi M, et al. Production of low-affinity penicillin-binding pretein by low and high-resistance groups of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother,1987,31(9):1307
6.戴自英. 抗菌药物的治疗性应用. 见：戴自英主编. 实用抗菌药物学. 上海：上海科学技术出版社， 1992. 74～75
8.Matsuda K, Nakamura K, Adachi Y, et al. Autolysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus is involved in synergism between impenem and cefotiam. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39(12):2631
1998 - 10 - 07收稿
1999 - 04 - 23修回
, 百拇医药