膀胱癌中碱性成纤维细胞生长因子和血管形成的研究
作者：谢庆祥 孟家榕 林福地 汪鸿 缪友仁 李金雨
单位：谢庆祥(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；孟家榕(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；林福地(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；汪鸿(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；缪友仁(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；李金雨(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)
关键词：膀胱肿瘤；成纤维细胞生长因子，碱性；新生血管化；免疫组织化学
湖南医学000201【摘 要】目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管形成与膀胱癌的发病及生物学行为之间关系。方法采用免疫组化法检测72例膀胱癌组织和21例正常膀胱组织中bFGF和第Ⅷ因子相关抗原的表达。结果膀胱癌组织中bFGF表达和微血管密度(MVD)均显著高于正常膀胱组织，而且两者与肿瘤病理分级分期密切相关。肿瘤复发者的bFGF表达和MVD均显著高于无复发者；bFGF强阳性表达者的MVD值显著高于阴性及弱阳性表达者。结论bFGF通过促进血管形成而在膀胱癌的发生发展过程中起着重要作用；bFGF和MVD检测可作为膀胱癌生物学行为和预后判别的评估指标。
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【中图分类号】 R737.14，R364.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0081-03
Study on Basic Fibroblast Growth Factor and Angiogenesis in Bladder Cancer
XIE Qingxiang MENG Jiarong LIN Fudi
(Department of Urology,The 175th Central Hospital of PLA,Fujian Province,Zhangzhou,363000,China)
【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationships of basic fibroblast growth factor (bFGF) and angiogenesis with the development and biological behaviors of bladder cancer.MethodsThe immunohistochemical methods were adopted to examine the expression of bFGF and factor Ⅷ-related antigen in tissues of 72 cases with bladder cancer and 21 specimens of normal bladder tissues.ResultsThe bFGF expression and microvessel density (MVD) in tissues of bladder cancer were higher than those in normal tissues,respectively.Both criteria were closely correlated with pathological stages and periods of the tumors.bFGF expression and MVD in recurrence cases were significantly higher than those in non-recurrence ones.The MVD in bladder cancer patients with bFGF-intense-positive expression was significantly higher than that in those with bFGF-negative and weakly positive expression.ConclusionsThe bFGF plays an important role in the development and progression of bladder cancer by promoting tumor angiogenesis.bFGF and MVD may be used as indices for discrimination of the tumor biological behaviors and its prognosis.
, 百拇医药
【Key words】 bladder neoplasms; fibroblast growth factor,basic; neovascularization; immunohistochemistry
肿瘤的生长乃至浸润转移依赖于血管形成；肿瘤组织诱导的血管形成是一复杂的多因素调节过程，涉及到多种血管形成因子，其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用[1～3]。作者等采用免疫组化方法检测正常和癌变膀胱组织中bFGF表达和微血管密度(MVD)的变化，以探讨两者相互关系及其与膀胱癌病理特征及其预后之间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本 收集膀胱移行细胞癌手术标本72例，平均年龄49.3(29～78)岁，男56例、女16例。64例行肿瘤切除或膀胱部分切除，8例行全膀胱切除。按WHO分级标准：Ⅰ级20例、Ⅱ级31例、Ⅲ级21例；按UICC分期：T0～T1期46例，T2～T4期26例。61例
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获随访1年以上，复发15例。所示标本均经病理组织学证实。
1.2 试剂 bFGF为多克隆抗体(1：50)，Sant a.Cruz公司产品；第Ⅷ因子相关抗原也为多克隆抗体(1：100)以及SP试剂盒为Zymed公司产品。
1.3 方法 免疫组化采用SP方法。标本以10%甲醛或中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4 μm，DAB显色，苏木素复染。另取21例正常膀胱组织作为对照组，其中12例来源于健康成人、5例为癌旁≤2 cm和4例为癌旁>5 cm的正常膀胱组织。
1.4 结果判断 ①bFGF结果评估：阳性细胞数≤10%为阴性(-)，>10%为阳性，其中10%～30%为(+)，30%～60%为(++)、>60%为(+++)。②MVD的计数：第Ⅷ因子相关抗原阳性染色的微血管呈棕黄色至深棕色，按Weinder法[4]并稍改进计数MVD，即先在低倍镜(×100)下观察并选择5个MVD最多的区域(热点，hotspot)，而后在高倍镜(×400)下计数，取平均值。
, 百拇医药
1.5 统计方法 采用t检验，完全随机方差分析、χ2检验、Ridit分析。
2 结果
2.1 bFGF表达 膀胱癌中bFGF阳性率为84.7%(61/72)，明显高于正常组织(33.3%，7/21)，P<0.001。其中来源于健康人的正常膀胱组织bFGF阳性率为16.7%(2/12)、癌旁≤2 cm为60.0%(3/5)、癌旁>5 cm为50.0%(2/4)，三者相比差异无显著性(P>0.05)。
2.2 MVD表达 膀胱癌的MVD为(33.4±15.3)，显著高于正常组织的(13.6±9.7)，P<0.001。癌旁的正常膀胱组织MVD为(15.9±11.2)，健康人组为(11.9±8.6)，两者比较无统计学意义(P>0.05)。
2.3 bFGF和MVD与膀胱癌病理特征的关系 由附表可见，bFGF呈现弱阳性表达(-～+)与强阳性表达(～)。其强度比较Ⅰ级与Ⅲ级间差异有显著性(P<0.05)；而MVD随着病理级别增加其均数也明显递增(P<0.05～0.01)。同样，T0～1与T2～4比较bFGF表达明显减弱(P<0.05)；MVD均值降低(P<0.05)；复发病例bFGF表达也明显增强(P<0.05)，MVD均值增高较无复发者差异有极显著性(P<0.01)。
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附表 bFGF和MVD与膀胱癌临床病理特征的关系(例) 临床病
理特征
n
bFGF
MVD
(
±s)
-
+
++
+++
Ⅰ级
20
, http://www.100md.com
7
5
5
3
23.7±13.5
Ⅱ级
31
3
8
11
9
31.1±15.3
Ⅲ级
, 百拇医药 21
1
5
6
9
46.0±15.71)2)
T0～1
46
10
12
13
11
29.8±16.1
, 百拇医药
T2～4
26
1
6
9
10
39.8±15.93)
无复发
46
8
14
13
11
, 百拇医药
29.1±16.3
有复发
15
0
2
7
6
44.1±14.74)
1)与Ⅰ级比较：P<0.01；2)与Ⅱ级比较：P<0.05
3)与T0～1比较：P<0.05；4)与无复发比较：P<0.01
2.4 bFGF表达与MVD的关系 膀胱癌组织中，29例bFGF阴性及弱阳性表达者的MVD为(27.9±14.6)，43例bFGF强阳性表达者的MVD为(37.1±17.0)，两者相比差异有显著性(P<0.05)。正常膀胱组织中两者之间比较差异并无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
bFGF是由146个氨基酸组成的多肽物质，是细胞生长、分化和血管形成的重要促进因子[2，3]。体外实验已表明bFGF异常高表达能够促进细胞恶性转化，而且与一些肿瘤的发生发展有密切关系[2，3]。但在膀胱癌中的作用如何研究甚少。Chodak等[5]报道了膀胱癌病人尿bFGF水平明显高于正常对照者。本组结果显示膀胱癌bFGF表达显著高于正常组织，而且在癌组织中主要分布于癌细胞，少数可见基底膜阳性表达，提示膀胱癌中bFGF可能通过自分泌及旁分泌途径而起作用，其异常表达在膀胱癌的发病过程中起着重要作用。
Allen等[6]发现浸润性膀膀癌细胞株阳性表达bFGF，而非浸润性癌细胞株bFGF阴性表达；Miyake等[7]对膀胱癌细胞体外实验发现细胞导入bFGF基因后基质金属蛋白酶(MMP)水平显著增高而且细胞侵袭活性也增高，而加入bFGF反义寡核苷酸则降低了MMP水平及细胞侵袭活性，表明bFGF在膀胱癌侵润、转移过程中起着重要作用。本组结果也显示bFGF表达随着膀胱癌病理分级分期上升而增强，而且肿瘤复发者bFGF表达显著增高，提示bFGF能够反映膀胱癌生物学特性，其高表达是肿瘤恶性度高、浸润深及易复发的标记之一。
, 百拇医药
自从Folkman等1971年提出肿瘤生长依赖血管形成的观点以来，越来越多的研究结果支持这一论点，肿瘤在发生发展过程中伴随着血管生成增多，而且研究表明许多肿瘤的转移及预后与MVD密切相关[1]。已有报道MVD与浸润性膀胱癌预后密切相关[8]。本组结果显示膀胱癌中MVD显著高于正常组织，这表明血管形成增多与膀胱肿瘤发生发展有密切关系。同时本组结果也显示MVD随着膀胱癌病理分级分期上升而增多，复发者MVD表达也增多，提示MVD可以作为反映膀胱癌生物学行为的指标之一。
本组资料显示虽然癌旁的正常膀胱粘膜中bFGF表达和MVD与健康人的正常膀胱粘膜相比无显著差异，但前者均呈表达增高的趋势，这可能与两组例数相对较少有关。鉴于两组人群的膀胱癌发生(再发)率存有一定差异，因此bFGF和MVD表达增高是否是促进细胞恶性转化的早期因子，有待于深入研究。
bFGF和血管内皮细胞生长因子是血管形成的主要促进因子，体外实验已证实bFGF能够促进血管内皮细胞形成血管[9]。本组发现部分膀胱癌组织中血管内皮细胞bFGF也阳性表达，而且膀胱癌bFGF强阳性表达者的MVD显著高于阴性及弱阳性表达者，而正常组织中两者之间无明显关系，提示bFGF能够促进膀胱癌的血管形成，推测bFGF主要通过影响血管形成而促进膀胱癌的发生发展。
, 百拇医药
【作者简介】 谢庆祥(1967～)，男，福建浦田人，医学硕士。主要研究方向：膀胱癌和前列腺增生的发病机制。
【参 考 文 献】
[1] Campbell SC.Advances in angiogenesis research:relevance to urological oncology[J].J Urol,1997,158:1663-15674
[2] Rogelj S,Weinberg RA,Fanning P,et al.Basic fibroblast growth factor fused to a signal peptide transforms cells[J].Nature,1988,331:173-175
[3] Steiner MS.Review of peptide growth factors in benign prostatic hyperplasia and urological malignancy[J].J Urol,1995,153:1085-1096
, http://www.100md.com
[4] Weidnner N,Carroll PR,Flax J,et al.Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostae carcinoma[J].Am J Pathol,1993,143:401-409
[5] Chodak GW,Hospelhomrn V,Judge SM,et al.Increased levels of fibroblast growth factor-like activity in urine from patients with bladder or kidney cancer[J].Cancer Res,1988,48:2083
[6] Allen LE,Maker PA.Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor in an invasive bladder carcinoma cell line[J].J Cell Physiol,1993,155:368
, 百拇医药
[7] Miyake H,Yoshimura K,Hara I,et al.Basic fibroblast growth factor regulates matrix metalloproteinases production and in vitro invasiveness in human bladder cancer cell lines[J].J Urol,1997,157:2351-2355
[8] Bochner BH,Cote RJ,Weidner N,et al.Angiogenesis in bladder cancer:relationship bewteen microvessel density and tumor prognosis[J].J Nat Cancer Inst,1995,87:1603
[9] Emoto A,Nakagawa M,Wakabayashi Y,et al.Induction of tubulogenesis of microvascular endothelial cells by basic fibroblast growth factor from human SN12C renal cancer cells[J].J Urol,1997,157:699-703
【收稿日期】 1999-03-20, 百拇医药
单位：谢庆祥(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；孟家榕(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；林福地(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；汪鸿(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；缪友仁(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)；李金雨(中国人民解放军第175中心医院 漳州 363000)
关键词：膀胱肿瘤；成纤维细胞生长因子，碱性；新生血管化；免疫组织化学
湖南医学000201【摘 要】目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管形成与膀胱癌的发病及生物学行为之间关系。方法采用免疫组化法检测72例膀胱癌组织和21例正常膀胱组织中bFGF和第Ⅷ因子相关抗原的表达。结果膀胱癌组织中bFGF表达和微血管密度(MVD)均显著高于正常膀胱组织，而且两者与肿瘤病理分级分期密切相关。肿瘤复发者的bFGF表达和MVD均显著高于无复发者；bFGF强阳性表达者的MVD值显著高于阴性及弱阳性表达者。结论bFGF通过促进血管形成而在膀胱癌的发生发展过程中起着重要作用；bFGF和MVD检测可作为膀胱癌生物学行为和预后判别的评估指标。
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【中图分类号】 R737.14，R364.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0081-03
Study on Basic Fibroblast Growth Factor and Angiogenesis in Bladder Cancer
XIE Qingxiang MENG Jiarong LIN Fudi
(Department of Urology,The 175th Central Hospital of PLA,Fujian Province,Zhangzhou,363000,China)
【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationships of basic fibroblast growth factor (bFGF) and angiogenesis with the development and biological behaviors of bladder cancer.MethodsThe immunohistochemical methods were adopted to examine the expression of bFGF and factor Ⅷ-related antigen in tissues of 72 cases with bladder cancer and 21 specimens of normal bladder tissues.ResultsThe bFGF expression and microvessel density (MVD) in tissues of bladder cancer were higher than those in normal tissues,respectively.Both criteria were closely correlated with pathological stages and periods of the tumors.bFGF expression and MVD in recurrence cases were significantly higher than those in non-recurrence ones.The MVD in bladder cancer patients with bFGF-intense-positive expression was significantly higher than that in those with bFGF-negative and weakly positive expression.ConclusionsThe bFGF plays an important role in the development and progression of bladder cancer by promoting tumor angiogenesis.bFGF and MVD may be used as indices for discrimination of the tumor biological behaviors and its prognosis.
, 百拇医药
【Key words】 bladder neoplasms; fibroblast growth factor,basic; neovascularization; immunohistochemistry
肿瘤的生长乃至浸润转移依赖于血管形成；肿瘤组织诱导的血管形成是一复杂的多因素调节过程，涉及到多种血管形成因子，其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用[1～3]。作者等采用免疫组化方法检测正常和癌变膀胱组织中bFGF表达和微血管密度(MVD)的变化，以探讨两者相互关系及其与膀胱癌病理特征及其预后之间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本 收集膀胱移行细胞癌手术标本72例，平均年龄49.3(29～78)岁，男56例、女16例。64例行肿瘤切除或膀胱部分切除，8例行全膀胱切除。按WHO分级标准：Ⅰ级20例、Ⅱ级31例、Ⅲ级21例；按UICC分期：T0～T1期46例，T2～T4期26例。61例
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获随访1年以上，复发15例。所示标本均经病理组织学证实。
1.2 试剂 bFGF为多克隆抗体(1：50)，Sant a.Cruz公司产品；第Ⅷ因子相关抗原也为多克隆抗体(1：100)以及SP试剂盒为Zymed公司产品。
1.3 方法 免疫组化采用SP方法。标本以10%甲醛或中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4 μm，DAB显色，苏木素复染。另取21例正常膀胱组织作为对照组，其中12例来源于健康成人、5例为癌旁≤2 cm和4例为癌旁>5 cm的正常膀胱组织。
1.4 结果判断 ①bFGF结果评估：阳性细胞数≤10%为阴性(-)，>10%为阳性，其中10%～30%为(+)，30%～60%为(++)、>60%为(+++)。②MVD的计数：第Ⅷ因子相关抗原阳性染色的微血管呈棕黄色至深棕色，按Weinder法[4]并稍改进计数MVD，即先在低倍镜(×100)下观察并选择5个MVD最多的区域(热点，hotspot)，而后在高倍镜(×400)下计数，取平均值。
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1.5 统计方法 采用t检验，完全随机方差分析、χ2检验、Ridit分析。
2 结果
2.1 bFGF表达 膀胱癌中bFGF阳性率为84.7%(61/72)，明显高于正常组织(33.3%，7/21)，P<0.001。其中来源于健康人的正常膀胱组织bFGF阳性率为16.7%(2/12)、癌旁≤2 cm为60.0%(3/5)、癌旁>5 cm为50.0%(2/4)，三者相比差异无显著性(P>0.05)。
2.2 MVD表达 膀胱癌的MVD为(33.4±15.3)，显著高于正常组织的(13.6±9.7)，P<0.001。癌旁的正常膀胱组织MVD为(15.9±11.2)，健康人组为(11.9±8.6)，两者比较无统计学意义(P>0.05)。
2.3 bFGF和MVD与膀胱癌病理特征的关系 由附表可见，bFGF呈现弱阳性表达(-～+)与强阳性表达(～)。其强度比较Ⅰ级与Ⅲ级间差异有显著性(P<0.05)；而MVD随着病理级别增加其均数也明显递增(P<0.05～0.01)。同样，T0～1与T2～4比较bFGF表达明显减弱(P<0.05)；MVD均值降低(P<0.05)；复发病例bFGF表达也明显增强(P<0.05)，MVD均值增高较无复发者差异有极显著性(P<0.01)。
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附表 bFGF和MVD与膀胱癌临床病理特征的关系(例) 临床病
理特征
n
bFGF
MVD
(
±s)-
+
++
+++
Ⅰ级
20
, http://www.100md.com
7
5
5
3
23.7±13.5
Ⅱ级
31
3
8
11
9
31.1±15.3
Ⅲ级
, 百拇医药 21
1
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46.0±15.71)2)
T0～1
46
10
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29.8±16.1
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T2～4
26
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39.8±15.93)
无复发
46
8
14
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11
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29.1±16.3
有复发
15
0
2
7
6
44.1±14.74)
1)与Ⅰ级比较：P<0.01；2)与Ⅱ级比较：P<0.05
3)与T0～1比较：P<0.05；4)与无复发比较：P<0.01
2.4 bFGF表达与MVD的关系 膀胱癌组织中，29例bFGF阴性及弱阳性表达者的MVD为(27.9±14.6)，43例bFGF强阳性表达者的MVD为(37.1±17.0)，两者相比差异有显著性(P<0.05)。正常膀胱组织中两者之间比较差异并无显著性(P>0.05)。
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3 讨论
bFGF是由146个氨基酸组成的多肽物质，是细胞生长、分化和血管形成的重要促进因子[2，3]。体外实验已表明bFGF异常高表达能够促进细胞恶性转化，而且与一些肿瘤的发生发展有密切关系[2，3]。但在膀胱癌中的作用如何研究甚少。Chodak等[5]报道了膀胱癌病人尿bFGF水平明显高于正常对照者。本组结果显示膀胱癌bFGF表达显著高于正常组织，而且在癌组织中主要分布于癌细胞，少数可见基底膜阳性表达，提示膀胱癌中bFGF可能通过自分泌及旁分泌途径而起作用，其异常表达在膀胱癌的发病过程中起着重要作用。
Allen等[6]发现浸润性膀膀癌细胞株阳性表达bFGF，而非浸润性癌细胞株bFGF阴性表达；Miyake等[7]对膀胱癌细胞体外实验发现细胞导入bFGF基因后基质金属蛋白酶(MMP)水平显著增高而且细胞侵袭活性也增高，而加入bFGF反义寡核苷酸则降低了MMP水平及细胞侵袭活性，表明bFGF在膀胱癌侵润、转移过程中起着重要作用。本组结果也显示bFGF表达随着膀胱癌病理分级分期上升而增强，而且肿瘤复发者bFGF表达显著增高，提示bFGF能够反映膀胱癌生物学特性，其高表达是肿瘤恶性度高、浸润深及易复发的标记之一。
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自从Folkman等1971年提出肿瘤生长依赖血管形成的观点以来，越来越多的研究结果支持这一论点，肿瘤在发生发展过程中伴随着血管生成增多，而且研究表明许多肿瘤的转移及预后与MVD密切相关[1]。已有报道MVD与浸润性膀胱癌预后密切相关[8]。本组结果显示膀胱癌中MVD显著高于正常组织，这表明血管形成增多与膀胱肿瘤发生发展有密切关系。同时本组结果也显示MVD随着膀胱癌病理分级分期上升而增多，复发者MVD表达也增多，提示MVD可以作为反映膀胱癌生物学行为的指标之一。
本组资料显示虽然癌旁的正常膀胱粘膜中bFGF表达和MVD与健康人的正常膀胱粘膜相比无显著差异，但前者均呈表达增高的趋势，这可能与两组例数相对较少有关。鉴于两组人群的膀胱癌发生(再发)率存有一定差异，因此bFGF和MVD表达增高是否是促进细胞恶性转化的早期因子，有待于深入研究。
bFGF和血管内皮细胞生长因子是血管形成的主要促进因子，体外实验已证实bFGF能够促进血管内皮细胞形成血管[9]。本组发现部分膀胱癌组织中血管内皮细胞bFGF也阳性表达，而且膀胱癌bFGF强阳性表达者的MVD显著高于阴性及弱阳性表达者，而正常组织中两者之间无明显关系，提示bFGF能够促进膀胱癌的血管形成，推测bFGF主要通过影响血管形成而促进膀胱癌的发生发展。
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【作者简介】 谢庆祥(1967～)，男，福建浦田人，医学硕士。主要研究方向：膀胱癌和前列腺增生的发病机制。
【参 考 文 献】
[1] Campbell SC.Advances in angiogenesis research:relevance to urological oncology[J].J Urol,1997,158:1663-15674
[2] Rogelj S,Weinberg RA,Fanning P,et al.Basic fibroblast growth factor fused to a signal peptide transforms cells[J].Nature,1988,331:173-175
[3] Steiner MS.Review of peptide growth factors in benign prostatic hyperplasia and urological malignancy[J].J Urol,1995,153:1085-1096
, http://www.100md.com
[4] Weidnner N,Carroll PR,Flax J,et al.Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostae carcinoma[J].Am J Pathol,1993,143:401-409
[5] Chodak GW,Hospelhomrn V,Judge SM,et al.Increased levels of fibroblast growth factor-like activity in urine from patients with bladder or kidney cancer[J].Cancer Res,1988,48:2083
[6] Allen LE,Maker PA.Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor in an invasive bladder carcinoma cell line[J].J Cell Physiol,1993,155:368
, 百拇医药
[7] Miyake H,Yoshimura K,Hara I,et al.Basic fibroblast growth factor regulates matrix metalloproteinases production and in vitro invasiveness in human bladder cancer cell lines[J].J Urol,1997,157:2351-2355
[8] Bochner BH,Cote RJ,Weidner N,et al.Angiogenesis in bladder cancer:relationship bewteen microvessel density and tumor prognosis[J].J Nat Cancer Inst,1995,87:1603
[9] Emoto A,Nakagawa M,Wakabayashi Y,et al.Induction of tubulogenesis of microvascular endothelial cells by basic fibroblast growth factor from human SN12C renal cancer cells[J].J Urol,1997,157:699-703
【收稿日期】 1999-03-20, 百拇医药