食管拉网细胞端粒酶活性检测及临床应用研究
作者：杨瑞森 单春 魏树臻 邹德宏
单位：杨瑞森 单春 魏树臻 邹德宏(济南市山东省肿瘤防治研究院胸外科 250117)
关键词：食管肿瘤/诊断；食管肿瘤/拉网细胞学诊断；端粒酶活性
肿瘤防治杂志000106 【摘要】 目的：检测食管拉网细胞中端粒酶活性，探讨其在食管癌诊断及预测预后的临床应用价值。方法：应用端粒重复序列扩增法，对30例食管拉网细胞标本及相应的癌组织和癌旁正常食管组织进行检测。结果：30例食管拉网标本中端粒酶活性阳性率为83.3%(25/30)，相应癌组织中阳性率为96.7%(29/30)，14例正常食管组织中阳性率为14.3%(2/14)。拉网细胞和癌组织中端粒酶阳性率与正常组织相比较差异有显著性(P<0.005)；食管拉网细胞端粒酶活性阳性率高于拉网细胞学癌细胞检出率(73.3%)，但差异无显著性(P>0.05)；端粒酶活性与食管癌临床病理因素无关。结论：食管拉网细胞端粒酶活性检测结合细胞学检查将有助于食管癌的早期诊断。
, 百拇医药
中图分类号：R735.1；R730.43 文献标识码：A
文章编号：1009-4571(2000)01-0016-03
The Clinical Application Study of the Detection of Telomerase Activity in Esophageal Netting Cells
YANG Rui-sen SHAN Chun WEI Shu-zhen et al
(Department of Thoracic Surgery,Shandong Tumor Hospital & Institute,Jinan 250117)
【Abstract】 Objective:To detect the telomerase activity in esophageal netting cells and explore its clinical application value in the diagnosis of esophageal carcinoma.Methods: Telomerase activity was detected by Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP) assay in 30 cases of the matched tumor tissues and 14 cases of tumor adjacent tissues.Results:The positive rate of telomerase activity was 83.3% in the esophageal netting cells(25/30),96.7% in the matched tumor tissues(29/30) and 14.3% in the tumor adjacent tissues(2/14) respectively. The positive rate of telomerase activity in the netting cells and the matched tissuses was significantly higher than that in the tumor adjacent tissuses(P<0.005).The positive rate of telomerase activity is higher than that of cytology in the esophageal netting cells(83.3% to 73.3%),but the difference was not significant (P>0.05). There was no significant relation between the telomerase activity and the clinicopathological factors of esophageal carcinoma.Conclusions:Detection of telomerase activity combination with cytology in esophageal netting cells could improve the positive rate of earlier diagnosis of esophageal carcinoma.
, 百拇医药
【Key words】 esophageal netting cells；telomerase activity；esophageal carcinoma
食管拉网细胞学检查用于食管癌的临床诊断及食管癌高发区大面积普查，其阳性率可达80%～90%[1]，但由于脱落细胞学检查存在假阳性、假阴性及可疑阳性等问题。为寻找更有效的诊断食管癌的方法，作者采用端粒重复序列扩增法检测了食管拉网细胞和食管癌及正常食管组织中端粒酶活性的表达情况，旨在研究端粒酶活性检测在食管癌发生发展中的作用，并结合临床病理资料探讨端粒酶活性检测在食管癌诊断和预后方面的应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源
30例食管拉网细胞标本均取自本院1998年9月～1998年12月住院患者。采用双腔网囊食管细胞采取器，收集脱落细胞，一部分做涂片固定、巴氏染色、细胞学诊断，剩余部分于PBS缓冲液中离心弃上清液，置-80℃冰箱保存备用。30例患者均接受手术治疗。30例食管癌手术标本和14例相应的正常食管组织标本，均于离体后半小时内采集，-80℃冰箱保存。所有标本均经病理学诊断证实。
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1.2 主要仪器及试剂
PCR扩增仪(PE480)，美国；电泳仪及电泳装置，北京；端粒重复序列扩增试剂盒，山东医科大学遗传学教研室研制。
1.3 端粒酶活性检测
采用PCR-端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性[2]。取冻存的组织标本50 mg匀浆，加入1 ml PBS缓冲液，混匀后冰浴静置3～5 min，取300 μl上清液置0.5 ml离心管中，15 000 r/min离心20 s收集细胞，加入50 μl细胞裂解液，混匀后置冰浴裂解30 min。然后于4℃ 15 000 r/min离心10 min后取上清液1 μl，加入25 μl反应混合物和1 μl的Taq DNA 聚合酶，30℃ 反应30 min，再向反应管中加入引物1 μl，石蜡油20 μl，按如下条件进行PCR扩增：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30个周期。扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶(20：9)电泳分离，硝酸银染色。检测时以肿瘤细胞K562作阳性对照，裂解缓冲液为阴性对照。
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1.4 统计学处理
采用χ2检验和四格表确切概率计算法进行统计学处理。
2 结果
2.1 检测标本端粒酶活性表达状况
食管拉网细胞标本30例，端粒酶活性阳性25例，阴性5例，阳性率83.3%。食管癌组织标本30例，端粒酶活性阳性29例，阴性1例，阳性率96.7%。食管正常组织标本14例，端粒酶活性阳性2例，阴性12例，阳性率14.3%。食管拉网细胞和食管癌组织与食管正常组织相比较，端粒酶活性阳性率具有极显著差异(P<0.005)。
2.2 食管拉网细胞端粒酶活性阳性率与拉网细胞学阳性率比较
食管拉网标本30例，细胞学检查阳性18例，可疑阳性4例，阴性8例，阳性率73.3%，小于食管拉网细胞学端粒酶活性检测阳性率(83.3%)，但二者之间差异无显著性(P>0.05)。
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2.3 食管拉网细胞端粒酶活性与食管癌临床病理因素之间的关系
本组食管拉网细胞端粒酶活性阳性率在55岁以下组为72.2%(8/11)，55岁以上组为89.5%(17/19)；男性组为90.9%(20/22)，女性组62.5%(5/8)；胸下段组为85.7%(12/14)，胸中段组81.3%(13/16)；肿瘤最大直径5 cm以上组为87.5%(21/24)，5 cm以下组为66.7%(4/6)；溃疡型为90%(18/20)；髓质型83.3%(5/6)；蕈伞型50%(2/4)；在腺癌及腺鳞癌组为100%(3/3)；鳞癌组81.5%(22/27)；在组织学Ⅰ级组为55.6%(5/9)、Ⅱ级组92.9%(13/14)，Ⅰ～Ⅱ级组100%(6/6)；在Ⅱ期组为73.3%(11/15)，Ⅲ期组93.3%(14/15)；在有淋巴结转移组为92.9%(13/14)，无转移组75%(12/16)。但以上各病理因素的组间差异均无显著性(P>0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，在人类，它是由短重复序列(TTAGGG)n成。端粒随每次细胞分裂和年龄增加而进行性缩短，最终导致细胞衰老或凋亡。端粒酶是具有逆转录酶活性的核糖核蛋白，它能合成端粒DNA重复序列，并将其加到染色体末端，以维持端粒长度和染色体的稳定，允许细胞无限制的增殖。端粒酶存在于多数胚胎组织、正常成人男性生殖细胞、再生组织的增殖细胞和多数肿瘤细胞中。大量研究表明，端粒酶活性与细胞增殖、永生化、衰老和恶性肿瘤的发生发展密切相关[3，4]。
本研究结果显示，30例食管癌组织中端粒酶活性阳性率为96.7%，显著高于正常食管组织(端粒酶阳性率为14.3%)，提示其在食管癌的发生发展中可能起重要作用。14例正常食管组织中2例端粒酶活性阳性，其中1例病理证实为原位癌。
肿瘤组织中端粒酶活性与临床病理因素和预后的关系尚无定论。Cheng 等研究发现，无淋巴结转移的活检标本比有转移者端粒酶活性显著降低，提示端粒酶活性具有预后意义[5]。但本组资料表明，端粒酶活性与食管癌临床病理因素，如患者年龄、性别、大体病理类型、组织学分型、分化程度、浸润深度、临床病理分期和淋巴结转移均无相关性，提示端粒酶活性与食管癌的预后无明确关系，这与其他文献报道一致[6，7]。
, 百拇医药
对膀胱癌患者空腹尿的端粒酶检测显示，85%(88/104)的尿标本端粒酶阳性，显著高于尿细胞学的阳性检出率51%(45/88)[8]，与支气管灌洗液、乳腺细针穿刺标本、腹水、腹腔和肠腔冲洗液等脱落细胞的端粒酶活性检测结果相类似[9，10]。本研究显示，食管拉网细胞端粒酶活性阳性率为83.3%，高于本组食管拉网细胞学阳性检出率(73.3%)，且端粒酶活性检测无可疑阳性的情况。本组资料中，4例细胞学可疑阳性的标本，端粒酶检测结果均阳性。
端粒酶活性在几乎所有进展期肿瘤中均可检测到，因此已成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点[11]。随着对端粒酶结构、功能和作用机制等研究的不断深入，端粒酶抑制剂联合抗癌制剂的应用将有可能为肿瘤的临床治疗提供更有效的手段。
参考文献：
[1] 李学文，张齐峰.常见恶性肿瘤[M].北京：科学技术文献出版社，1998，11-12.
, 百拇医药
[2] Kim NM, Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266:2011-2015.
[3] Sjau JW,Bacchetti S.A Survey of telomerase in human cancer[J].Eur J.Cancer,1997,33:787-791.
[4] FENG J,Funk WD,Wang S,et al.The RNA component of human telomerase[J].Science,1995,269:1236-1241.
[5] Cheng RY,Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activation in ansopharyngeal carcinomas[J].Br J Cancer,1998,7:456-460.
, 百拇医药
[6] Takubok,Nakamura KI,Izumiyama N,et al.Telomerase activity in esophaeal carcinoma[J].J Surg Oncol,1997,66:88-92.
[7] 王淘，张伟，金顺钱，等.食管癌组织中端粒酶活性研究[J].中华医学杂志，1998，78：785-786.
[8] Kanaler E,Landman J,Chang Y,et al.Detecting human bladder carcinoma cells in voided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity[J].Cancer,1998,82:708-714.
[9] Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al. Detection of telomerse activity in exofoliated camcer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications[J].Br J Cancer,1997,75:548-553.
, 百拇医药
[10] Yahata N,Ohyshiki K,Ohya shiki JH,et al.Telomerase activity in lung cancer cells obtained from bronchial washings[J].J Natl Cancer Inst,1998,90:684-690.
[11] Shay JW.Telomerase in cancer:diagnostic,prognostic and theraputic implications[J].Cancer J Sci Am,1998,4 Supl 1:S26-34.
收稿日期：1999-12-15
修回日期：2000-01-18, http://www.100md.com
单位：杨瑞森 单春 魏树臻 邹德宏(济南市山东省肿瘤防治研究院胸外科 250117)
关键词：食管肿瘤/诊断；食管肿瘤/拉网细胞学诊断；端粒酶活性
肿瘤防治杂志000106 【摘要】 目的：检测食管拉网细胞中端粒酶活性，探讨其在食管癌诊断及预测预后的临床应用价值。方法：应用端粒重复序列扩增法，对30例食管拉网细胞标本及相应的癌组织和癌旁正常食管组织进行检测。结果：30例食管拉网标本中端粒酶活性阳性率为83.3%(25/30)，相应癌组织中阳性率为96.7%(29/30)，14例正常食管组织中阳性率为14.3%(2/14)。拉网细胞和癌组织中端粒酶阳性率与正常组织相比较差异有显著性(P<0.005)；食管拉网细胞端粒酶活性阳性率高于拉网细胞学癌细胞检出率(73.3%)，但差异无显著性(P>0.05)；端粒酶活性与食管癌临床病理因素无关。结论：食管拉网细胞端粒酶活性检测结合细胞学检查将有助于食管癌的早期诊断。
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中图分类号：R735.1；R730.43 文献标识码：A
文章编号：1009-4571(2000)01-0016-03
The Clinical Application Study of the Detection of Telomerase Activity in Esophageal Netting Cells
YANG Rui-sen SHAN Chun WEI Shu-zhen et al
(Department of Thoracic Surgery,Shandong Tumor Hospital & Institute,Jinan 250117)
【Abstract】 Objective:To detect the telomerase activity in esophageal netting cells and explore its clinical application value in the diagnosis of esophageal carcinoma.Methods: Telomerase activity was detected by Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP) assay in 30 cases of the matched tumor tissues and 14 cases of tumor adjacent tissues.Results:The positive rate of telomerase activity was 83.3% in the esophageal netting cells(25/30),96.7% in the matched tumor tissues(29/30) and 14.3% in the tumor adjacent tissues(2/14) respectively. The positive rate of telomerase activity in the netting cells and the matched tissuses was significantly higher than that in the tumor adjacent tissuses(P<0.005).The positive rate of telomerase activity is higher than that of cytology in the esophageal netting cells(83.3% to 73.3%),but the difference was not significant (P>0.05). There was no significant relation between the telomerase activity and the clinicopathological factors of esophageal carcinoma.Conclusions:Detection of telomerase activity combination with cytology in esophageal netting cells could improve the positive rate of earlier diagnosis of esophageal carcinoma.
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【Key words】 esophageal netting cells；telomerase activity；esophageal carcinoma
食管拉网细胞学检查用于食管癌的临床诊断及食管癌高发区大面积普查，其阳性率可达80%～90%[1]，但由于脱落细胞学检查存在假阳性、假阴性及可疑阳性等问题。为寻找更有效的诊断食管癌的方法，作者采用端粒重复序列扩增法检测了食管拉网细胞和食管癌及正常食管组织中端粒酶活性的表达情况，旨在研究端粒酶活性检测在食管癌发生发展中的作用，并结合临床病理资料探讨端粒酶活性检测在食管癌诊断和预后方面的应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源
30例食管拉网细胞标本均取自本院1998年9月～1998年12月住院患者。采用双腔网囊食管细胞采取器，收集脱落细胞，一部分做涂片固定、巴氏染色、细胞学诊断，剩余部分于PBS缓冲液中离心弃上清液，置-80℃冰箱保存备用。30例患者均接受手术治疗。30例食管癌手术标本和14例相应的正常食管组织标本，均于离体后半小时内采集，-80℃冰箱保存。所有标本均经病理学诊断证实。
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1.2 主要仪器及试剂
PCR扩增仪(PE480)，美国；电泳仪及电泳装置，北京；端粒重复序列扩增试剂盒，山东医科大学遗传学教研室研制。
1.3 端粒酶活性检测
采用PCR-端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性[2]。取冻存的组织标本50 mg匀浆，加入1 ml PBS缓冲液，混匀后冰浴静置3～5 min，取300 μl上清液置0.5 ml离心管中，15 000 r/min离心20 s收集细胞，加入50 μl细胞裂解液，混匀后置冰浴裂解30 min。然后于4℃ 15 000 r/min离心10 min后取上清液1 μl，加入25 μl反应混合物和1 μl的Taq DNA 聚合酶，30℃ 反应30 min，再向反应管中加入引物1 μl，石蜡油20 μl，按如下条件进行PCR扩增：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30个周期。扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶(20：9)电泳分离，硝酸银染色。检测时以肿瘤细胞K562作阳性对照，裂解缓冲液为阴性对照。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
采用χ2检验和四格表确切概率计算法进行统计学处理。
2 结果
2.1 检测标本端粒酶活性表达状况
食管拉网细胞标本30例，端粒酶活性阳性25例，阴性5例，阳性率83.3%。食管癌组织标本30例，端粒酶活性阳性29例，阴性1例，阳性率96.7%。食管正常组织标本14例，端粒酶活性阳性2例，阴性12例，阳性率14.3%。食管拉网细胞和食管癌组织与食管正常组织相比较，端粒酶活性阳性率具有极显著差异(P<0.005)。
2.2 食管拉网细胞端粒酶活性阳性率与拉网细胞学阳性率比较
食管拉网标本30例，细胞学检查阳性18例，可疑阳性4例，阴性8例，阳性率73.3%，小于食管拉网细胞学端粒酶活性检测阳性率(83.3%)，但二者之间差异无显著性(P>0.05)。
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2.3 食管拉网细胞端粒酶活性与食管癌临床病理因素之间的关系
本组食管拉网细胞端粒酶活性阳性率在55岁以下组为72.2%(8/11)，55岁以上组为89.5%(17/19)；男性组为90.9%(20/22)，女性组62.5%(5/8)；胸下段组为85.7%(12/14)，胸中段组81.3%(13/16)；肿瘤最大直径5 cm以上组为87.5%(21/24)，5 cm以下组为66.7%(4/6)；溃疡型为90%(18/20)；髓质型83.3%(5/6)；蕈伞型50%(2/4)；在腺癌及腺鳞癌组为100%(3/3)；鳞癌组81.5%(22/27)；在组织学Ⅰ级组为55.6%(5/9)、Ⅱ级组92.9%(13/14)，Ⅰ～Ⅱ级组100%(6/6)；在Ⅱ期组为73.3%(11/15)，Ⅲ期组93.3%(14/15)；在有淋巴结转移组为92.9%(13/14)，无转移组75%(12/16)。但以上各病理因素的组间差异均无显著性(P>0.05)。
3 讨论
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端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，在人类，它是由短重复序列(TTAGGG)n成。端粒随每次细胞分裂和年龄增加而进行性缩短，最终导致细胞衰老或凋亡。端粒酶是具有逆转录酶活性的核糖核蛋白，它能合成端粒DNA重复序列，并将其加到染色体末端，以维持端粒长度和染色体的稳定，允许细胞无限制的增殖。端粒酶存在于多数胚胎组织、正常成人男性生殖细胞、再生组织的增殖细胞和多数肿瘤细胞中。大量研究表明，端粒酶活性与细胞增殖、永生化、衰老和恶性肿瘤的发生发展密切相关[3，4]。
本研究结果显示，30例食管癌组织中端粒酶活性阳性率为96.7%，显著高于正常食管组织(端粒酶阳性率为14.3%)，提示其在食管癌的发生发展中可能起重要作用。14例正常食管组织中2例端粒酶活性阳性，其中1例病理证实为原位癌。
肿瘤组织中端粒酶活性与临床病理因素和预后的关系尚无定论。Cheng 等研究发现，无淋巴结转移的活检标本比有转移者端粒酶活性显著降低，提示端粒酶活性具有预后意义[5]。但本组资料表明，端粒酶活性与食管癌临床病理因素，如患者年龄、性别、大体病理类型、组织学分型、分化程度、浸润深度、临床病理分期和淋巴结转移均无相关性，提示端粒酶活性与食管癌的预后无明确关系，这与其他文献报道一致[6，7]。
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对膀胱癌患者空腹尿的端粒酶检测显示，85%(88/104)的尿标本端粒酶阳性，显著高于尿细胞学的阳性检出率51%(45/88)[8]，与支气管灌洗液、乳腺细针穿刺标本、腹水、腹腔和肠腔冲洗液等脱落细胞的端粒酶活性检测结果相类似[9，10]。本研究显示，食管拉网细胞端粒酶活性阳性率为83.3%，高于本组食管拉网细胞学阳性检出率(73.3%)，且端粒酶活性检测无可疑阳性的情况。本组资料中，4例细胞学可疑阳性的标本，端粒酶检测结果均阳性。
端粒酶活性在几乎所有进展期肿瘤中均可检测到，因此已成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点[11]。随着对端粒酶结构、功能和作用机制等研究的不断深入，端粒酶抑制剂联合抗癌制剂的应用将有可能为肿瘤的临床治疗提供更有效的手段。
参考文献：
[1] 李学文，张齐峰.常见恶性肿瘤[M].北京：科学技术文献出版社，1998，11-12.
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[2] Kim NM, Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266:2011-2015.
[3] Sjau JW,Bacchetti S.A Survey of telomerase in human cancer[J].Eur J.Cancer,1997,33:787-791.
[4] FENG J,Funk WD,Wang S,et al.The RNA component of human telomerase[J].Science,1995,269:1236-1241.
[5] Cheng RY,Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activation in ansopharyngeal carcinomas[J].Br J Cancer,1998,7:456-460.
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[6] Takubok,Nakamura KI,Izumiyama N,et al.Telomerase activity in esophaeal carcinoma[J].J Surg Oncol,1997,66:88-92.
[7] 王淘，张伟，金顺钱，等.食管癌组织中端粒酶活性研究[J].中华医学杂志，1998，78：785-786.
[8] Kanaler E,Landman J,Chang Y,et al.Detecting human bladder carcinoma cells in voided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity[J].Cancer,1998,82:708-714.
[9] Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al. Detection of telomerse activity in exofoliated camcer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications[J].Br J Cancer,1997,75:548-553.
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[11] Shay JW.Telomerase in cancer:diagnostic,prognostic and theraputic implications[J].Cancer J Sci Am,1998,4 Supl 1:S26-34.
收稿日期：1999-12-15
修回日期：2000-01-18, http://www.100md.com