表皮生长因子对游离毛囊生长的影响
作者：杨淑霞 钟志红 秦俭 马圣清 武玲慎
单位：杨淑霞(100034 北京医科大学第一医院皮肤科)；钟志红 秦俭 马圣清 武玲慎(100034 北京医科大学第一医院皮肤科)
关键词：毛囊；器官培养；表皮生长因子-尿抑胃素
中华皮肤科杂志000209
【摘要】目的 通过毛囊器官培养观察表皮生长因子(EGF)对人头皮毛囊生长的影响。方法 用WilliamsE无血清培养基进行人头皮毛囊游离培养，分为2组，EGF组(43根)和对照组(43根)。结果 EGF20μg/L组在加药后1～3d毛干平均生长0.22mm/d，对照组平均生长0.16mm/d，两组差异有显著性(P<0.05)，EGF对毛囊生长有更明显的促进作用。但EGF组毛囊于培养的第4～6天即出现退行期的形态改变并发生扭曲，毛干停止生长，对照组于培养第10天后才发生形态变化。组织学上，培养第10天EGF组毛囊下部外毛根鞘增厚，杵状结构形成，而对照组仍为生长期形态。3H-亮氨酸掺入实验显示EGF组毛囊上皮中的放射活性(370c/min)高于对照组(271.14c/min)(P<0.05)，而毛干中的放射活性(173.19c/min)与对照组(158.49c/min)无明显差异。结论 EGF对毛囊的生长有促进作用，主要是促进毛囊上皮的生长，并且诱导毛囊提前由生长期进入退行期。
, 百拇医药
Effects of Epidermal Growth Factor on Human Hair Follicle Growth in vitro
YANG Shuxia,ZHONG Zhihong,QIN Jian, et al.
(Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034)
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on hair follicle growth. Methods Cultured human hair follicles were divided into two groups: EGF-treated group (EGF 20 ng/mL) and control group. The length and morphology of follicles were measured by inverted microscope daily. 3H-leucine incorporation and histologic studies were applied. Results The rates of hair shaft and hair follicle elongation significantly increased in the EGF-treated group during day 1 to day 3 in comparison with the control group. Histologically, the cells of the lower outer root sheath were thickened and club hair-like structure was formed. 3H-leucine incorporation showed that the radioactivity in hair follicle epithelium was higher in EG-treated group (370 c/min)than that in control group(271.14 c/min) (P<0.05). No difference was found in terms of the radioactivity in hair shaft between EGF-treated group(173.19 c/min) and control group(158.49 c/min). Conclusion It is suggested that EGF might stimulate the growth of hair follicle epithelium, and induce anagen transforming into catagen prematurely.
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【 Key words】 Hair follicle Organ culture Epidermal growth factor-urogastrone
毛发生长周期的调节是一个复杂的生理生化过程，该过程尚不完全清楚。现有的研究表明在毛囊的发生和生长过程中，表皮与间质间的相互作用是十分重要的，而这种相互作用可能是通过可弥散的分子，细胞与细胞间相互作用和细胞外基质介导的[1,2]。表皮生长因子(EGF)可能参与毛发生长与生长周期的调节[3,4]。我们采用游离毛囊培养和3H-亮氨酸掺入实验探讨EGF对人头皮毛囊的生长、形态和蛋白质合成的影响。
材料和方法
(一)材料：
1.标本来源：18～35岁新鲜尸体头皮。
2.仪器：解剖显微镜(北京泰克仪器有限公司)，倒置显微镜(Olympus)，CO2孵箱(Queue)。
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3.培养基与试剂：WilliamsE培养基(Gibco)加谷氨酰胺2mmol/L，Hepes2mmol/L，氢化可的松10μg/L，牛胰岛素(Sigma)10mg/L，转铁蛋白(Sigma)10mg/L，亚硒酸钠(北京朝阳中联化工试剂厂)10μg/L，青霉素10×104U/L，链霉素100mg/L。EGF(Sigma)20μg/L。
(二)方法：
1.毛囊器官培养：参照Philpott[5]的方法。选生长期毛囊分置于24孔板中，每孔1根，WilliamsE无血清培养基中培养。于培养第1天选取形态完好、生长速度与生理生长速度相似的毛囊(即1d内生长约0.3mm以上的毛囊)86根，分成两组：EGF组和对照组各43根，EGF组培养基中加入EGF(20μg/L)。每组各16根毛囊每天在倒置显微镜下观察毛囊形态并测量毛囊长度。游离培养的毛囊两端的最远距离记为毛囊长度，从毛干基底到毛干游离端记为毛干长度。
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2.组织学检查：培养第10天，EGF组和对照组各取2根毛囊，10%福尔马林固定24h，石蜡包埋，切片，HE染色，观察毛囊组织学形态。
3.3H-亮氨酸掺入：参照Harmon[6]的方法，于加入EGF培养24h后，EGF组和对照组各选取25根毛囊，每5根置于1个孔中，加入3H-亮氨酸2μCi/mL，继续培养48h后将毛囊移至1mL离心管中，分别用PBS和5%三氯醋酸(TCA)洗2次，蒸馏水洗1次，然后加入1mL0.3NNaOH37℃孵化18h。离心取上清液，测定可溶于碱蛋白(ASP)部分，即毛囊上皮成分的放射活性。沉淀主要为未溶解的毛干，用0.3NNaOH洗4次，然后与0.5mol/LNaBH4+1NNaOH50℃孵化48h，待毛干完全溶解，加入适量盐酸中和，用以测定毛干蛋白(HFP)中的放射活性。使用液闪计数仪进行放射活性测定。
5.统计学分析：采用SPSS统计软件进行t检验。
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结果
(一)毛囊生长情况：(图1)EGF(20μg/L)组于加药后第1～3天毛干平均生长0.22mm/d，对照组平均生长0.16mm/d，两组比较差异有显著性(P<0.05)。EGF组毛干第4天后生长速度明显减慢，第5天时61.5%停止生长，平均总生长天数为7.6d，而对照组直至第10天后还在继续生长，平均总生长天数为14d。EGF组毛囊和毛干的延长不完全一致，毛囊保持较快的延长速度至第6天，然后生长减慢，第8天时61.5%停止生长，平均生长天数为9.8d，培养10d总生长长度为1.28mm，比毛干(0.82mm)多(P<0.05)。而对照组毛囊与毛干的生长基本是一致的，培养第1～3天平均生长速度分别为0.15mm和0.16mm，培养10d平均总生长长度分别为0.96mm和1.02mm。
图1 表皮生长因子对毛囊及毛干生长的影响
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图2 EGF对毛囊形态的影响.a培养第5天对照组毛囊形态,b培养第5天EGF组毛囊形态，c培养第8天ECF组毛囊形态，同时可见贴壁生长的上皮细胞
图3 ECF对毛囊形态的影响。a:对照组毛囊b:ECF组毛囊(×250)
(二)毛囊形态：倒置显微镜下观察，EGF组毛囊形态在培养第1、2天未见明显改变，第4～6天出现退行期改变，毛干基底向上移，与毛乳头距离拉长，形成杵状发，与毛乳头间有一细胞索相连，第5天后部分毛囊下部出现弯折扭曲，并缩短。外毛根鞘细胞常贴壁生长(见图2b和c)。对照组毛囊直至培养第10天后才出现形态改变，未发现外毛根鞘细胞贴壁生长。
组织学表现：培养第10天EGF组示毛母质中黑素明显减少，毛囊下部外毛根鞘增厚，毛干基底杵状结构形成,并与毛乳头间拉开距离(见图3b)。对照组毛囊结构清晰，毛母质包裹毛乳头，未见外毛根鞘增厚(见图3a)。
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(三)毛囊蛋白质合成：液闪计数仪计数，可溶于碱蛋白部分(毛囊上皮)放射性活性，EGF组平均为370.00c/min，对照组平均为271.14c/min，两组差异有显著性(P<0.05)，说明EGF组毛囊上皮蛋白质的合成较对照组高；毛干蛋白部分放射性活性，EGF组平均为173.19c/min，对照组平均为158.49c/min，两组差异无显著性。
讨论
众多的生长因子中，EGF倍受关注。研究证明EGF不仅在毛囊的形成和发育中有重要作用，还可能参与了毛发生长和生长周期的调节[1-3]。利用免疫组织化学染色和放射自显影研究显示成熟的毛囊外毛根鞘(ORS)内有EGF和大量EGF受体存在[2]。也有实验显示EGF可以诱导体外游离培养的人头皮毛囊或羊的毛囊发生类似于动物实验中羊毛的改变，使毛囊提前停止生长，进入退行期[3,4,7]，而且使DNA的合成模式发生变化，对外毛根鞘细胞的DNA合成有明显的促进作用[3,7]。
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本实验中，形态学和组织学检查显示EGF组毛囊提前发生退行期样改变，毛干基底和毛乳头的距离拉长，杵状发形成，毛囊下段发生弯折扭曲，部分毛囊下段缩短；而对照组未发生典型的退行期样改变。这显示，毛囊的退行变和EGF的作用是直接相关的。因为EGF受体主要位于毛囊的外毛根鞘内，故EGF可能是与外毛根鞘细胞上的受体结合后，引起外毛根鞘细胞的生长、合成与分泌活动的变化，从而干扰毛囊的正常生长，导致退行变。本实验结果中，EGF组毛囊与对照组不同，毛囊的延长超过毛干的延长，毛囊上皮中蛋白质的合成明显多于对照组，说明EGF对毛囊上皮成分有明显的促进作用，与文献相符。但本实验未证明EGF是否影响毛囊外毛根鞘细胞的合成、分泌等功能。由于EGF诱导体外培养毛囊的退行期改变与生理状态的退行期改变不完全相同，如看不到玻璃膜的增厚等，故毛发周期的调节是由EGF和其他众多因素共同参与的复杂经过。本实验说明EGF促进毛囊的生长，主要是毛囊上皮细胞的生长，并能诱导毛囊提前由生长期进入退行期。
宝洁公司资助课题
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参 考 文 献
1，Messenger AG. The control of hair growth : an overview. J Invest Dermatol, 1993, 101(Suppl): 4S- 9S.
2，Moore GPM, Du Cross DL, Isaacs K, et al. Hair growth induction: roles of growth factors. Ann NY Acad Sci, 1991, 642:308- 325.
3，Philpott MP, Kealey T. Effects of EGF on the morphology and patterns of DNA synthesis in isolated human hair follicles, J Invest Dermatol, 1994, 102: 186- 191.
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4，Hoffmann R, Eicheler W, Huth A,et al. Cytokines and growth factors influence hair growth in vitro. Possible implications for the pathogenesis and treatment of alopecia areata. Arch Dermatol Res, 1996, 288:153- 156.
5，Philpott MP, Green MR, Kealey T. Human hair growth in vitro. J Cell Sci, 1990, 97: 463- 471.
6，Harmon CS, Nevins TD. Hair fibre production by human hair follicles in whole- organ culture. Br J Dermatol, 1994,130: 415- 423.
7，Bond JJ, Wynn PC, Moore GP. Effects of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha on the function of wool follicles in culture. Arch Dermatol Res, 1996, 288:373- 382.
收稿日期：1999-05-31, http://www.100md.com
单位：杨淑霞(100034 北京医科大学第一医院皮肤科)；钟志红 秦俭 马圣清 武玲慎(100034 北京医科大学第一医院皮肤科)
关键词：毛囊；器官培养；表皮生长因子-尿抑胃素
中华皮肤科杂志000209
【摘要】目的 通过毛囊器官培养观察表皮生长因子(EGF)对人头皮毛囊生长的影响。方法 用WilliamsE无血清培养基进行人头皮毛囊游离培养，分为2组，EGF组(43根)和对照组(43根)。结果 EGF20μg/L组在加药后1～3d毛干平均生长0.22mm/d，对照组平均生长0.16mm/d，两组差异有显著性(P<0.05)，EGF对毛囊生长有更明显的促进作用。但EGF组毛囊于培养的第4～6天即出现退行期的形态改变并发生扭曲，毛干停止生长，对照组于培养第10天后才发生形态变化。组织学上，培养第10天EGF组毛囊下部外毛根鞘增厚，杵状结构形成，而对照组仍为生长期形态。3H-亮氨酸掺入实验显示EGF组毛囊上皮中的放射活性(370c/min)高于对照组(271.14c/min)(P<0.05)，而毛干中的放射活性(173.19c/min)与对照组(158.49c/min)无明显差异。结论 EGF对毛囊的生长有促进作用，主要是促进毛囊上皮的生长，并且诱导毛囊提前由生长期进入退行期。
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Effects of Epidermal Growth Factor on Human Hair Follicle Growth in vitro
YANG Shuxia,ZHONG Zhihong,QIN Jian, et al.
(Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034)
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on hair follicle growth. Methods Cultured human hair follicles were divided into two groups: EGF-treated group (EGF 20 ng/mL) and control group. The length and morphology of follicles were measured by inverted microscope daily. 3H-leucine incorporation and histologic studies were applied. Results The rates of hair shaft and hair follicle elongation significantly increased in the EGF-treated group during day 1 to day 3 in comparison with the control group. Histologically, the cells of the lower outer root sheath were thickened and club hair-like structure was formed. 3H-leucine incorporation showed that the radioactivity in hair follicle epithelium was higher in EG-treated group (370 c/min)than that in control group(271.14 c/min) (P<0.05). No difference was found in terms of the radioactivity in hair shaft between EGF-treated group(173.19 c/min) and control group(158.49 c/min). Conclusion It is suggested that EGF might stimulate the growth of hair follicle epithelium, and induce anagen transforming into catagen prematurely.
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【 Key words】 Hair follicle Organ culture Epidermal growth factor-urogastrone
毛发生长周期的调节是一个复杂的生理生化过程，该过程尚不完全清楚。现有的研究表明在毛囊的发生和生长过程中，表皮与间质间的相互作用是十分重要的，而这种相互作用可能是通过可弥散的分子，细胞与细胞间相互作用和细胞外基质介导的[1,2]。表皮生长因子(EGF)可能参与毛发生长与生长周期的调节[3,4]。我们采用游离毛囊培养和3H-亮氨酸掺入实验探讨EGF对人头皮毛囊的生长、形态和蛋白质合成的影响。
材料和方法
(一)材料：
1.标本来源：18～35岁新鲜尸体头皮。
2.仪器：解剖显微镜(北京泰克仪器有限公司)，倒置显微镜(Olympus)，CO2孵箱(Queue)。
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3.培养基与试剂：WilliamsE培养基(Gibco)加谷氨酰胺2mmol/L，Hepes2mmol/L，氢化可的松10μg/L，牛胰岛素(Sigma)10mg/L，转铁蛋白(Sigma)10mg/L，亚硒酸钠(北京朝阳中联化工试剂厂)10μg/L，青霉素10×104U/L，链霉素100mg/L。EGF(Sigma)20μg/L。
(二)方法：
1.毛囊器官培养：参照Philpott[5]的方法。选生长期毛囊分置于24孔板中，每孔1根，WilliamsE无血清培养基中培养。于培养第1天选取形态完好、生长速度与生理生长速度相似的毛囊(即1d内生长约0.3mm以上的毛囊)86根，分成两组：EGF组和对照组各43根，EGF组培养基中加入EGF(20μg/L)。每组各16根毛囊每天在倒置显微镜下观察毛囊形态并测量毛囊长度。游离培养的毛囊两端的最远距离记为毛囊长度，从毛干基底到毛干游离端记为毛干长度。
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2.组织学检查：培养第10天，EGF组和对照组各取2根毛囊，10%福尔马林固定24h，石蜡包埋，切片，HE染色，观察毛囊组织学形态。
3.3H-亮氨酸掺入：参照Harmon[6]的方法，于加入EGF培养24h后，EGF组和对照组各选取25根毛囊，每5根置于1个孔中，加入3H-亮氨酸2μCi/mL，继续培养48h后将毛囊移至1mL离心管中，分别用PBS和5%三氯醋酸(TCA)洗2次，蒸馏水洗1次，然后加入1mL0.3NNaOH37℃孵化18h。离心取上清液，测定可溶于碱蛋白(ASP)部分，即毛囊上皮成分的放射活性。沉淀主要为未溶解的毛干，用0.3NNaOH洗4次，然后与0.5mol/LNaBH4+1NNaOH50℃孵化48h，待毛干完全溶解，加入适量盐酸中和，用以测定毛干蛋白(HFP)中的放射活性。使用液闪计数仪进行放射活性测定。
5.统计学分析：采用SPSS统计软件进行t检验。
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结果
(一)毛囊生长情况：(图1)EGF(20μg/L)组于加药后第1～3天毛干平均生长0.22mm/d，对照组平均生长0.16mm/d，两组比较差异有显著性(P<0.05)。EGF组毛干第4天后生长速度明显减慢，第5天时61.5%停止生长，平均总生长天数为7.6d，而对照组直至第10天后还在继续生长，平均总生长天数为14d。EGF组毛囊和毛干的延长不完全一致，毛囊保持较快的延长速度至第6天，然后生长减慢，第8天时61.5%停止生长，平均生长天数为9.8d，培养10d总生长长度为1.28mm，比毛干(0.82mm)多(P<0.05)。而对照组毛囊与毛干的生长基本是一致的，培养第1～3天平均生长速度分别为0.15mm和0.16mm，培养10d平均总生长长度分别为0.96mm和1.02mm。
图1 表皮生长因子对毛囊及毛干生长的影响
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图2 EGF对毛囊形态的影响.a培养第5天对照组毛囊形态,b培养第5天EGF组毛囊形态，c培养第8天ECF组毛囊形态，同时可见贴壁生长的上皮细胞
图3 ECF对毛囊形态的影响。a:对照组毛囊b:ECF组毛囊(×250)
(二)毛囊形态：倒置显微镜下观察，EGF组毛囊形态在培养第1、2天未见明显改变，第4～6天出现退行期改变，毛干基底向上移，与毛乳头距离拉长，形成杵状发，与毛乳头间有一细胞索相连，第5天后部分毛囊下部出现弯折扭曲，并缩短。外毛根鞘细胞常贴壁生长(见图2b和c)。对照组毛囊直至培养第10天后才出现形态改变，未发现外毛根鞘细胞贴壁生长。
组织学表现：培养第10天EGF组示毛母质中黑素明显减少，毛囊下部外毛根鞘增厚，毛干基底杵状结构形成,并与毛乳头间拉开距离(见图3b)。对照组毛囊结构清晰，毛母质包裹毛乳头，未见外毛根鞘增厚(见图3a)。
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(三)毛囊蛋白质合成：液闪计数仪计数，可溶于碱蛋白部分(毛囊上皮)放射性活性，EGF组平均为370.00c/min，对照组平均为271.14c/min，两组差异有显著性(P<0.05)，说明EGF组毛囊上皮蛋白质的合成较对照组高；毛干蛋白部分放射性活性，EGF组平均为173.19c/min，对照组平均为158.49c/min，两组差异无显著性。
讨论
众多的生长因子中，EGF倍受关注。研究证明EGF不仅在毛囊的形成和发育中有重要作用，还可能参与了毛发生长和生长周期的调节[1-3]。利用免疫组织化学染色和放射自显影研究显示成熟的毛囊外毛根鞘(ORS)内有EGF和大量EGF受体存在[2]。也有实验显示EGF可以诱导体外游离培养的人头皮毛囊或羊的毛囊发生类似于动物实验中羊毛的改变，使毛囊提前停止生长，进入退行期[3,4,7]，而且使DNA的合成模式发生变化，对外毛根鞘细胞的DNA合成有明显的促进作用[3,7]。
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本实验中，形态学和组织学检查显示EGF组毛囊提前发生退行期样改变，毛干基底和毛乳头的距离拉长，杵状发形成，毛囊下段发生弯折扭曲，部分毛囊下段缩短；而对照组未发生典型的退行期样改变。这显示，毛囊的退行变和EGF的作用是直接相关的。因为EGF受体主要位于毛囊的外毛根鞘内，故EGF可能是与外毛根鞘细胞上的受体结合后，引起外毛根鞘细胞的生长、合成与分泌活动的变化，从而干扰毛囊的正常生长，导致退行变。本实验结果中，EGF组毛囊与对照组不同，毛囊的延长超过毛干的延长，毛囊上皮中蛋白质的合成明显多于对照组，说明EGF对毛囊上皮成分有明显的促进作用，与文献相符。但本实验未证明EGF是否影响毛囊外毛根鞘细胞的合成、分泌等功能。由于EGF诱导体外培养毛囊的退行期改变与生理状态的退行期改变不完全相同，如看不到玻璃膜的增厚等，故毛发周期的调节是由EGF和其他众多因素共同参与的复杂经过。本实验说明EGF促进毛囊的生长，主要是毛囊上皮细胞的生长，并能诱导毛囊提前由生长期进入退行期。
宝洁公司资助课题
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1，Messenger AG. The control of hair growth : an overview. J Invest Dermatol, 1993, 101(Suppl): 4S- 9S.
2，Moore GPM, Du Cross DL, Isaacs K, et al. Hair growth induction: roles of growth factors. Ann NY Acad Sci, 1991, 642:308- 325.
3，Philpott MP, Kealey T. Effects of EGF on the morphology and patterns of DNA synthesis in isolated human hair follicles, J Invest Dermatol, 1994, 102: 186- 191.
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4，Hoffmann R, Eicheler W, Huth A,et al. Cytokines and growth factors influence hair growth in vitro. Possible implications for the pathogenesis and treatment of alopecia areata. Arch Dermatol Res, 1996, 288:153- 156.
5，Philpott MP, Green MR, Kealey T. Human hair growth in vitro. J Cell Sci, 1990, 97: 463- 471.
6，Harmon CS, Nevins TD. Hair fibre production by human hair follicles in whole- organ culture. Br J Dermatol, 1994,130: 415- 423.
7，Bond JJ, Wynn PC, Moore GP. Effects of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha on the function of wool follicles in culture. Arch Dermatol Res, 1996, 288:373- 382.
收稿日期：1999-05-31, http://www.100md.com