建立斑点金免疫渗滤法检测O157：H7型肠出血性大肠杆菌
作者：钟彦伟 汪力亚 周继文 夏光明 杨守纯
单位：钟彦伟(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；汪力亚(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；周继文(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；夏光明(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；杨守纯(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)
关键词：O157：H7型肠出血性大肠埃希氏菌；胶体金；免疫渗滤法
细胞与分子免疫学杂志000131
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0083-84
肠出血性大肠杆菌(EHEC)被公认为是一种最重要的人类肠道致病菌。EHEC O157：H7是产生Vero细胞毒素(VT)的常见血清型，除引起血性腹泻外，还可引起溶血性尿毒综合症(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜而危及生命。其临床症状易与肠套叠、溃疡性结肠炎及艰难梭菌感染所致的结肠炎混淆，且近年来，由其引起的感染性腹泻有明显上升的趋势。为此，建立一种快速、敏感、简便检测粪便标本中EHEC O157：H7的方法是当务之急。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 EHEC O157：H7标准株和分离株(日本分离株6株，长春牛肉及牛粪分离株各1株)，由解放军农牧大学赠送；金黄色葡萄球菌Cowan I(2611)，表皮葡萄球菌Cood 46(26107)株；大肠杆菌(ATCC 25922株)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC LT 44813，ST 44814及LT/ST44816株)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC 44852株)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)及弗劳地枸橼酸杆菌，均购于中国医学细菌保藏管理中心。兔抗EHEC O157：H7 IgG本室自制。该抗体的纯化及效价测定按常规方法进行。氯金酸(HAuCl.Cl3.4H2O)为北京化学试剂厂产品。硝酸纤维素膜购于北京北方同正公司。胶体金用柠檬酸三钠还原法制备。取0.1 g/L氯金酸100 mL煮沸后，加入1.5 mL(10 g/L)柠檬酸三钠水溶液；待溶液变为橙红色时，继续煮沸15 min，冷却后置4℃保存。胶体金-抗EHEC O157：H7结合物的制备用0.2 mol/L K2CO3调pH至8.0，快速搅拌下加入抗EHEC O157：H7 IgG 2 mg，并继续搅拌15 min，加入BSA 240 mg。再搅拌5 min，加入100 g/L NaCl使其终质量浓度为10 g/L，混匀，用离心法纯化胶体金溶液。于室温2000 r/min离心10 min，取上清液，再以10 000 r/min离心60 min。沉淀物即为初步纯化的金-抗O157：H7结合物。溶于含0.4 g/L PEG20 000，500 mL/L甘油和0.2 g/L NaN3的0.02 mol/L pH7.4 TrisCl中即为工作液，4℃保存。
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1.2 方法 斑点金免疫渗滤法的建立：1小盒为长4 cm，宽3 cm，高0.6 cm的塑料盒，盒盖上有直径为0.5 cm的小孔。将市售的卫生纸折叠作为吸水填料，硝酸纤维素膜覆盖其上。2标本制备：待测菌溶 于生理盐水中，于100℃煮沸10 min，以10 000 r/min离心10 min，取上清供实验用。3操作步骤：在硝酸纤维素膜(孔径0.65 μm)上加抗O157：H7抗体(2 g/L)1 μL，自然干燥后，滴加100 μL含10 mL/L小牛血清的0.02 mol/L，pH7.4 PBS ，待渗入；于小孔中依次加入待测标本100 μL ，金-抗O157：H7结合物100 μL及0.02 mol/L，pH7.4 PBS(含0.5 g/L Tween-20)洗涤液100 μL。每次加入的液体需完全渗入后，再滴加后一种液体。在白色的纤维素膜背景上，15 min内呈红色斑点者为阳性，没有斑点者为阴性。为证实上述建立的斑点金免疫渗滤法的可靠性及实用性，还做了性能鉴定。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 特异性 用ETEC(LT44813，ST44814，LT/ST44816)，EIEC(44852)，EPEC，福氏志贺菌、宋内志贺菌、普通变形杆菌、伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌和弗劳地枸橼酸杆菌，分别进行斑点金免疫渗滤试验，结果均呈阴性；而用已知大肠杆菌O157：H7菌株所做的对照试验，结果为阳性。
2.2 敏感性 用无菌生理盐水配制EHEC O157：H7菌悬液至8.0，2.0和0.5麦氏比浊度(菌数为8×1011/L)，再倍比系列稀释后，各取100 μL菌悬液做斑点金免疫渗滤试验。结果在100万个细菌时，仍能显示肉眼可鉴别的淡红色斑点。
2.3 稳定性 将新制备的与放置4℃冰箱保存3 mo的金-抗O157：H7结合物，同已知大肠杆菌O157：H7菌株同时进行斑点金免疫渗滤试验，结果完全一致。
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3 讨 论
目前，多数实验室检测EHEC时，常规应用山梨醇-麦康凯琼脂(SMAC)培养基，选山梨醇发酵阴性的大肠杆菌，然后用生化和血清学试验做鉴定，需要24～48 h。Park等〔1〕用免疫荧光法检测EHEC O157：H7，可在2 h内完成。另外，还有免疫磁化分离法(IMS)〔2〕、ELISA及PCR〔3〕等，但这些方法需要较昂贵的仪器，且操作繁杂，不便单份测定，我们建立的斑点金免疫渗滤法，不需要任何特殊仪器设备，但操作简便快速，所用国产试剂价廉，且可单份测定，结果易于观察，可尽快报告结果，有助于及时诊断并确定治疗方案，尤其适于基层医疗单位使用。
作者简介：钟彦伟，女，33岁，硕士；助理研究员
北京市丰台路26号,Tel.(010)66933391
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Park CH, Hixon DL, Morrison WL, et al. Rapid diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal specimens using immunofluorescence stain 〔J〕 . Am J Clin Pathol, 1994;101(1):91- 94.
〔2〕 Helge K, Mittmnn CJ, Aleksic S, et al. Isolation of enterohemorrhagic Escherochia coli O157： H7 strain from patients with hemolytic- uremic syndrome by using immunomagnetic separation, DNA based methods, and direct culture〔J〕 . J Clin Microbiol, 1996;34(3):516- 519.
〔3〕徐建国，黄力保，吴纪民.聚合酶链反应检测出血性大肠埃希氏菌〔J〕.中华医学检验杂志，1995；18(4)：225-228.
收稿日期：1999-05-07
修回日期：1999-08-16, http://www.100md.com
单位：钟彦伟(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；汪力亚(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；周继文(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；夏光明(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)；杨守纯(解放军302医院微生物学研究室，北京100039)
关键词：O157：H7型肠出血性大肠埃希氏菌；胶体金；免疫渗滤法
细胞与分子免疫学杂志000131
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0083-84
肠出血性大肠杆菌(EHEC)被公认为是一种最重要的人类肠道致病菌。EHEC O157：H7是产生Vero细胞毒素(VT)的常见血清型，除引起血性腹泻外，还可引起溶血性尿毒综合症(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜而危及生命。其临床症状易与肠套叠、溃疡性结肠炎及艰难梭菌感染所致的结肠炎混淆，且近年来，由其引起的感染性腹泻有明显上升的趋势。为此，建立一种快速、敏感、简便检测粪便标本中EHEC O157：H7的方法是当务之急。
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1 材料和方法
1.1 材料 EHEC O157：H7标准株和分离株(日本分离株6株，长春牛肉及牛粪分离株各1株)，由解放军农牧大学赠送；金黄色葡萄球菌Cowan I(2611)，表皮葡萄球菌Cood 46(26107)株；大肠杆菌(ATCC 25922株)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC LT 44813，ST 44814及LT/ST44816株)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC 44852株)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)及弗劳地枸橼酸杆菌，均购于中国医学细菌保藏管理中心。兔抗EHEC O157：H7 IgG本室自制。该抗体的纯化及效价测定按常规方法进行。氯金酸(HAuCl.Cl3.4H2O)为北京化学试剂厂产品。硝酸纤维素膜购于北京北方同正公司。胶体金用柠檬酸三钠还原法制备。取0.1 g/L氯金酸100 mL煮沸后，加入1.5 mL(10 g/L)柠檬酸三钠水溶液；待溶液变为橙红色时，继续煮沸15 min，冷却后置4℃保存。胶体金-抗EHEC O157：H7结合物的制备用0.2 mol/L K2CO3调pH至8.0，快速搅拌下加入抗EHEC O157：H7 IgG 2 mg，并继续搅拌15 min，加入BSA 240 mg。再搅拌5 min，加入100 g/L NaCl使其终质量浓度为10 g/L，混匀，用离心法纯化胶体金溶液。于室温2000 r/min离心10 min，取上清液，再以10 000 r/min离心60 min。沉淀物即为初步纯化的金-抗O157：H7结合物。溶于含0.4 g/L PEG20 000，500 mL/L甘油和0.2 g/L NaN3的0.02 mol/L pH7.4 TrisCl中即为工作液，4℃保存。
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1.2 方法 斑点金免疫渗滤法的建立：1小盒为长4 cm，宽3 cm，高0.6 cm的塑料盒，盒盖上有直径为0.5 cm的小孔。将市售的卫生纸折叠作为吸水填料，硝酸纤维素膜覆盖其上。2标本制备：待测菌溶 于生理盐水中，于100℃煮沸10 min，以10 000 r/min离心10 min，取上清供实验用。3操作步骤：在硝酸纤维素膜(孔径0.65 μm)上加抗O157：H7抗体(2 g/L)1 μL，自然干燥后，滴加100 μL含10 mL/L小牛血清的0.02 mol/L，pH7.4 PBS ，待渗入；于小孔中依次加入待测标本100 μL ，金-抗O157：H7结合物100 μL及0.02 mol/L，pH7.4 PBS(含0.5 g/L Tween-20)洗涤液100 μL。每次加入的液体需完全渗入后，再滴加后一种液体。在白色的纤维素膜背景上，15 min内呈红色斑点者为阳性，没有斑点者为阴性。为证实上述建立的斑点金免疫渗滤法的可靠性及实用性，还做了性能鉴定。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 特异性 用ETEC(LT44813，ST44814，LT/ST44816)，EIEC(44852)，EPEC，福氏志贺菌、宋内志贺菌、普通变形杆菌、伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌和弗劳地枸橼酸杆菌，分别进行斑点金免疫渗滤试验，结果均呈阴性；而用已知大肠杆菌O157：H7菌株所做的对照试验，结果为阳性。
2.2 敏感性 用无菌生理盐水配制EHEC O157：H7菌悬液至8.0，2.0和0.5麦氏比浊度(菌数为8×1011/L)，再倍比系列稀释后，各取100 μL菌悬液做斑点金免疫渗滤试验。结果在100万个细菌时，仍能显示肉眼可鉴别的淡红色斑点。
2.3 稳定性 将新制备的与放置4℃冰箱保存3 mo的金-抗O157：H7结合物，同已知大肠杆菌O157：H7菌株同时进行斑点金免疫渗滤试验，结果完全一致。
, http://www.100md.com
3 讨 论
目前，多数实验室检测EHEC时，常规应用山梨醇-麦康凯琼脂(SMAC)培养基，选山梨醇发酵阴性的大肠杆菌，然后用生化和血清学试验做鉴定，需要24～48 h。Park等〔1〕用免疫荧光法检测EHEC O157：H7，可在2 h内完成。另外，还有免疫磁化分离法(IMS)〔2〕、ELISA及PCR〔3〕等，但这些方法需要较昂贵的仪器，且操作繁杂，不便单份测定，我们建立的斑点金免疫渗滤法，不需要任何特殊仪器设备，但操作简便快速，所用国产试剂价廉，且可单份测定，结果易于观察，可尽快报告结果，有助于及时诊断并确定治疗方案，尤其适于基层医疗单位使用。
作者简介：钟彦伟，女，33岁，硕士；助理研究员
北京市丰台路26号,Tel.(010)66933391
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Park CH, Hixon DL, Morrison WL, et al. Rapid diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal specimens using immunofluorescence stain 〔J〕 . Am J Clin Pathol, 1994;101(1):91- 94.
〔2〕 Helge K, Mittmnn CJ, Aleksic S, et al. Isolation of enterohemorrhagic Escherochia coli O157： H7 strain from patients with hemolytic- uremic syndrome by using immunomagnetic separation, DNA based methods, and direct culture〔J〕 . J Clin Microbiol, 1996;34(3):516- 519.
〔3〕徐建国，黄力保，吴纪民.聚合酶链反应检测出血性大肠埃希氏菌〔J〕.中华医学检验杂志，1995；18(4)：225-228.
收稿日期：1999-05-07
修回日期：1999-08-16, http://www.100md.com