表皮生长因子对气道上皮细胞VIP分泌及VIPR表达的影响①
作者：秦晓群 孙秀泓 罗自强 管茶香 张长青
单位：生理学教研室 长沙 410078
关键词：表皮生长因子；上皮细胞；支气管；血管活性肠肽
湖南医科大学学报990202 提 要 用放射免疫法检测支气管上皮细胞(BEC)和肺泡巨噬细胞(AM)血管活性肠肽(VIP)的分泌，放射配基法测定BEC的VIP受体(VIPR)表达，观察表皮生长因子(EGF)的调控效应。结果示：①电镜下，BEC细胞内有神经肽分泌颗粒特征，BEC及AM均有VIP基础分泌；②EGF呈剂量依赖性促进BEC的VIP分泌，并促进AM分泌VIP；③EGF呈剂量依赖性上调BEC的VIPR表达。提示气道上皮存在VIP的自分泌或旁分泌，其保护效应受局部生长因子的调控。
Affection of epidermal growth factor on VIP secretion
, http://www.100md.com
and VIPR expression in airway epithelial cellsQin Xiaoqun Sun Xiuhong Luo Ziqiang Guan Chaxiang Zhang Changqing
(Department of Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to confirm the essential role of vasoactive invtestinal peptide(VIP) on protection of local airway epithelium and investigate the modulation of the protective effect of VIP, secretion of VIP and expression of VIP receptor(VIPR) were studied in bronchial epithelial cells(BEC), and alveolar macrophages(AM). The radioimmunoassay was used for determining VIP secretion and the radio-ligand affinity analysis for VIPR expression. The effect of epidermal growth factor(EGF) was observed. The results showed that: ①Both BEC and AM secreted VIP basically without remarkable stimulus, and some vesicles with electron-dense core which usually exist specifically in neuropeptide secreting cells were found in plasma of BEC; ②In a dose-dependent manner, EGF promoted BEC to secrete VIP(r=0.84,P<0.05), and it was found that VIP secretion from AM was also elevated in EGF pretreated group(P<0.05); ③EGF exhibited a dose-dependent up-regulatory effect on the expression of VIPR in BEC(r=0.95,P<0.01). These results indicate that VIP may play an essential role in the protection at local airway by autocrine or paracrine, and the protective effect can be modulated by growth factors.
, 百拇医药
Key words epidermal growth factor; epithelial cells; bronchial; vasoactive intestinal peptide
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是肺内广泛存在的神经肽，具有扩张肺血管、减轻炎症反应等多种生物活性[1，2]。气道上皮细胞有VIP受体(VIPR)表达，提示气道上皮细胞是VIP调节作用的靶细胞。哮喘病人常伴有气道上皮损伤脱落同时血浆VIP水平降低[3]，提示VIP水平可能与气道上皮细胞的功能有关。本组曾观察到VIP减轻臭氧对支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, BEC)的损伤[4]。除由神经末梢释放或神经内分泌细胞分泌外，气道上皮局部高浓度的VIP还可能有其它来源。VIP的保护效应决定于局部的浓度和靶细胞表达的受体密度，可能受局部微环境的影响。为探讨VIP在气道局部的保护作用地位及保护效应的调节，本文用放射免疫方法(放免法)测定原代培养的BEC和肺泡巨噬细胞(alveolar marcophages, AM)的VIP分泌，用放射配基法测定BEC的VIPR表达，观察表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的调控效应。
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1 材料与方法1.1 主要试剂和仪器 胰蛋白酶购自Sigma公司；RPMI 1640培养基购自日本；抗角蛋白免疫组化试剂盒购自华美公司；EGF由日本东京大学赠送；VIP放免测定试剂盒购自海科锐公司；离心涂片机产自Eppendorf；γ计数仪产自Beckman。
1.2 BEC的分离和培养 新西兰兔，雌雄不拘，体重1.5±0.3kg。25%氨基甲酸乙酯耳缘静脉麻醉，股动脉放血处死。取出气管及支气管，仔细去除结缔组织，纵行剪开气管和支气管，在0.05%胰蛋白酶中37℃消化1h，乳胶刷刷取上皮细胞，1?!000r*min-1离心5min，冼涤三次后用台盼蓝排斥法计数成活率83±5%，在不含血清的RPMI 1640培养液中培养。
1.3 BEC细胞形态学鉴定 培养细胞离心洗涤后，用Hanks液悬浮细胞浓度成5×105*ml-1；离心涂片，经冷丙酮固定后，采用抗角蛋白(cytokeratin)的免疫组化试剂盒，DAB显色，阳性为上皮细胞。同时进行电镜观察，证实纤毛上皮细胞和基细胞纯度为91±3%。
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1.4 大鼠AM分离培养 Wistar大鼠，雌雄不拘，体重为250±50g。腹腔注射25%氨基甲酸乙酯，动物全身麻醉后股动脉放血处死。用生理盐水进行支气管肺灌洗，收集灌洗液离心洗涤，台盼蓝排斥法计数细胞成活率为96±5%，涂片瑞特氏染色AM纯度为97±3%，1640液悬浮细胞成2×106*ml-1浓度，37℃培养。
1.5 VIP分泌量测定 用1640液悬浮洗涤后的BEC或AM成2×106*ml-1，37℃，空气孵育稳定2h；经不同浓度的EGF预处理后，37℃空气培养16h，离心，收集上清液；用VIP放免药盒按操作程序反应，γ-计数，测定VIP标准品绘制标准线，计算各样品的VIP含量。
1.6 VIPR表达测定 细胞分组及处理同前，处理后37℃培养16h，加入125I标记VIP于4℃孵育48h，离心洗涤，弃上清。细胞部分测γ-计数，计算吸附率，反映细胞表面的VIPR数量。
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1.7 实验结果数据统计 数据用均数±标准差(
±s)表示；统计学处理用方差分析。
2 结果
2.1 BEC的免疫细胞化学及电镜观察 抗角蛋白抗体的免疫细胞化学显示，细胞阳性染色率为91±3%(图1)。
图1 兔支气管上皮细胞的角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学鉴定
Fig. 1Immunocytochemistry identification for rabbit bronchial epithelial cells with monoclonic antibody to cytokeratin
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细胞形态呈柱状或锥状等，部分有纤毛，为典型的支气管纤毛上皮细胞。有些上皮呈分散态，有些呈簇分布，亦系气道上皮细胞的特征之一[5]。电镜下观察到纤毛细胞的“9+2”纤毛结构及胞浆内“牛眼样”分泌颗粒(图2)。
图2 纤毛上皮细胞的超微结构
Fig. 2 Ultrastructure of ciliated cells (10 000×)
2.2 兔BEC分泌的VIP含量 用浓度分别为3，7，10，20(ng.ml-1)的EGF处理BEC，图3观察到EGF促进VIP分泌的量-效关系，显示VIP分泌量随EGF浓度增加而增加(r=0.84,P<0.05)。
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图3EGF促BEC细胞分泌VIP的剂量依赖性效应(n=5)
Fig. 3 The dose-dependent effect of EGF on VIP secretion from BEC(n=5)
2.3 大鼠AM的VIP分泌 图4示，大鼠AM的VIP基础分泌量为38.7±9.68，经EGF(20ng.ml-1)处理后，VIP分泌量增多，达52.01±15.67(P<0.05)。
图4 EGF对肺泡巨噬细胞分泌VIP的影响(n=5) ①vs control P<0.05
Fig.4 Effect of EGF(20ng*ml-1) on VIP secretion from alveolar macrophage (n=5) ①vs control P<0.05
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2.4 兔BEC上的VIPR表达 测定BEC对125I-VIP的结合率，图5可观察到EGF明显促进VIP在BEC的表达，且其促进效应呈剂量依赖性(r=0.95,P<0.05)。
图5 EGF上调兔支气管上皮细胞表达VIPR的剂量依赖性效应(n=5)
Fig.5 Dose-dependent upregulatory effect of EGF on VIPR expression of rabbit BEC(n=5)
3 讨论
BEC细胞包括纤毛细胞、分泌细胞及基细胞，呈柱状、锥形等多种细胞形态，一般不难辨认。体外培养时其细胞形状可发生改变，如成为梭形或球形，但都能稳定地表达角蛋白，故可用抗角蛋白的免疫细胞化学进行细胞学鉴定。本实验用酶消化法结合刷取法获得高纯度的气道上皮细胞，形态学观察及免疫学细胞化学鉴定显示具有气道纤毛上皮细胞的典型特征，收获量可满足实验需要而无须传代。上皮细胞的纯度及成活率与国外同类研究报道接近[5]。电镜下观察到纤毛上皮细胞内线粒体和内质网发达，提示有活跃的代谢和分泌活动。纤毛细胞内还发现有APUD细胞所特有的“牛眼样”分泌颗粒。此类颗粒内主要含肽类神经递质[6]。这一形态学结构提示气道纤毛上皮细胞可能具有分泌神经肽的活性。
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曾观察到VIP可促进BEC的GSH合成，提高过氧化氢酶活性，增强细胞的抗氧化能力，减轻臭氧对BEC的损伤[4]。VIP的保护作用对于维护上皮完整、维持气道局部微环境稳态具有重要意义。VIP的血浆浓度较低且半衰期短，人血浆VIP浓度为20.3±18.3pg*ml-1[7]。因此，VIP对气道上皮保护作用的有效程度依赖于气道局部的VIP浓度及VIPR表达密度。本实验检测到常驻肺内的肺泡巨噬细胞及支气管上皮细胞均可释放VIP，提示在气道上皮局部可能存在VIP的自分泌和旁分泌调节作用，形成以VIP为信号分子的保护网络。
气道局部的VIP保护效应可因内外环境因素的变动而产生适应性改变，VIP有经常性的基础分泌。当肺内炎症或免疫反应时，支气管灌洗液中的VIP含量增多[1，2]，气道上皮及局部炎症细胞的VIPR分布也增多[8]。本组前期研究显示[4，9]，EGF，VIP等肺内调节肽可提高BEC对臭氧攻击的抵抗力。EGF是维持气道上皮更新和修复损伤的重要的调节肽，在调控细胞生长等方面与VIP可发生协同作用。本实验观察到EGF呈剂量依赖性促进BEC分泌VIP及表达VIPR，还可促进肺泡巨噬细胞分泌VIP。此结果提示EGF在气道上皮局部可放大VIP的保护效应，是有效而重要的调控机制。哮喘等气道高反应性疾病患者血浆及肺灌洗液中的VIP水平降低，似与该机制的削弱有关。
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①国家自然科学基金资助项目(39770635)
中国图书分类号 R329.25
参考文献
[1]Said SI. VIP as a modulator of lung inflammation and airway constriction. Am Rev Respir Dis, 1991,143:S22-24
[2]Berisha H, Foda H, Sakakibara H, et al. Vasoactive intestinal peptide prevents lung injury due to xanthine/xanthine oxidase. Am J Physiol, 1990,259:L151-155
, 百拇医药
[3]邓翱，李平升，张志基，等.哮喘患者血浆血管活性肠肽测定及其意义.中华内科杂志，1993，32：165-166
[4]秦晓群，孙秀泓，张长青.血管活性肠肽对兔支气管上皮细胞抗臭氧损伤的保护作用.中国应用生理学杂志，1998，14：250-253
[5]Vignola AM, Campbell AM, Chanez P, et al. HLA-DR and ICAM-1 expression on bronchial epithelial cells in asthma and chronic bronchitis. Am Rev Respir Dis, 1993,148:689-694
[6]Junqueira LC, Carneiro J, Long JA. Basic Histology. 5th ed, Los Altos California: Longe Medical Publications, 1986:379-398
, 百拇医药
[7]陈方元，陆国钧，侯雪，等.血管活性肠肽的放射免疫分析.中华核医学杂志，1996，6：18-20
[8]Kaltreider HB, Ichikawa S, Byrd PK, et al. Upregulation of neuropeptides and neuropeptide receptors in a murine model of immune inflammation in lung parenchyma. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:133-144
[9]秦晓群，孙秀泓，罗自强，等.表皮生长因子对培养的气道上皮细胞抗臭氧损伤的保护作用.生理学报，1996，48：190-194
收稿日期：1998-08-25, 百拇医药
单位：生理学教研室 长沙 410078
关键词：表皮生长因子；上皮细胞；支气管；血管活性肠肽
湖南医科大学学报990202 提 要 用放射免疫法检测支气管上皮细胞(BEC)和肺泡巨噬细胞(AM)血管活性肠肽(VIP)的分泌，放射配基法测定BEC的VIP受体(VIPR)表达，观察表皮生长因子(EGF)的调控效应。结果示：①电镜下，BEC细胞内有神经肽分泌颗粒特征，BEC及AM均有VIP基础分泌；②EGF呈剂量依赖性促进BEC的VIP分泌，并促进AM分泌VIP；③EGF呈剂量依赖性上调BEC的VIPR表达。提示气道上皮存在VIP的自分泌或旁分泌，其保护效应受局部生长因子的调控。
Affection of epidermal growth factor on VIP secretion
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and VIPR expression in airway epithelial cellsQin Xiaoqun Sun Xiuhong Luo Ziqiang Guan Chaxiang Zhang Changqing
(Department of Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to confirm the essential role of vasoactive invtestinal peptide(VIP) on protection of local airway epithelium and investigate the modulation of the protective effect of VIP, secretion of VIP and expression of VIP receptor(VIPR) were studied in bronchial epithelial cells(BEC), and alveolar macrophages(AM). The radioimmunoassay was used for determining VIP secretion and the radio-ligand affinity analysis for VIPR expression. The effect of epidermal growth factor(EGF) was observed. The results showed that: ①Both BEC and AM secreted VIP basically without remarkable stimulus, and some vesicles with electron-dense core which usually exist specifically in neuropeptide secreting cells were found in plasma of BEC; ②In a dose-dependent manner, EGF promoted BEC to secrete VIP(r=0.84,P<0.05), and it was found that VIP secretion from AM was also elevated in EGF pretreated group(P<0.05); ③EGF exhibited a dose-dependent up-regulatory effect on the expression of VIPR in BEC(r=0.95,P<0.01). These results indicate that VIP may play an essential role in the protection at local airway by autocrine or paracrine, and the protective effect can be modulated by growth factors.
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Key words epidermal growth factor; epithelial cells; bronchial; vasoactive intestinal peptide
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是肺内广泛存在的神经肽，具有扩张肺血管、减轻炎症反应等多种生物活性[1，2]。气道上皮细胞有VIP受体(VIPR)表达，提示气道上皮细胞是VIP调节作用的靶细胞。哮喘病人常伴有气道上皮损伤脱落同时血浆VIP水平降低[3]，提示VIP水平可能与气道上皮细胞的功能有关。本组曾观察到VIP减轻臭氧对支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, BEC)的损伤[4]。除由神经末梢释放或神经内分泌细胞分泌外，气道上皮局部高浓度的VIP还可能有其它来源。VIP的保护效应决定于局部的浓度和靶细胞表达的受体密度，可能受局部微环境的影响。为探讨VIP在气道局部的保护作用地位及保护效应的调节，本文用放射免疫方法(放免法)测定原代培养的BEC和肺泡巨噬细胞(alveolar marcophages, AM)的VIP分泌，用放射配基法测定BEC的VIPR表达，观察表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的调控效应。
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1 材料与方法1.1 主要试剂和仪器 胰蛋白酶购自Sigma公司；RPMI 1640培养基购自日本；抗角蛋白免疫组化试剂盒购自华美公司；EGF由日本东京大学赠送；VIP放免测定试剂盒购自海科锐公司；离心涂片机产自Eppendorf；γ计数仪产自Beckman。
1.2 BEC的分离和培养 新西兰兔，雌雄不拘，体重1.5±0.3kg。25%氨基甲酸乙酯耳缘静脉麻醉，股动脉放血处死。取出气管及支气管，仔细去除结缔组织，纵行剪开气管和支气管，在0.05%胰蛋白酶中37℃消化1h，乳胶刷刷取上皮细胞，1?!000r*min-1离心5min，冼涤三次后用台盼蓝排斥法计数成活率83±5%，在不含血清的RPMI 1640培养液中培养。
1.3 BEC细胞形态学鉴定 培养细胞离心洗涤后，用Hanks液悬浮细胞浓度成5×105*ml-1；离心涂片，经冷丙酮固定后，采用抗角蛋白(cytokeratin)的免疫组化试剂盒，DAB显色，阳性为上皮细胞。同时进行电镜观察，证实纤毛上皮细胞和基细胞纯度为91±3%。
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1.4 大鼠AM分离培养 Wistar大鼠，雌雄不拘，体重为250±50g。腹腔注射25%氨基甲酸乙酯，动物全身麻醉后股动脉放血处死。用生理盐水进行支气管肺灌洗，收集灌洗液离心洗涤，台盼蓝排斥法计数细胞成活率为96±5%，涂片瑞特氏染色AM纯度为97±3%，1640液悬浮细胞成2×106*ml-1浓度，37℃培养。
1.5 VIP分泌量测定 用1640液悬浮洗涤后的BEC或AM成2×106*ml-1，37℃，空气孵育稳定2h；经不同浓度的EGF预处理后，37℃空气培养16h，离心，收集上清液；用VIP放免药盒按操作程序反应，γ-计数，测定VIP标准品绘制标准线，计算各样品的VIP含量。
1.6 VIPR表达测定 细胞分组及处理同前，处理后37℃培养16h，加入125I标记VIP于4℃孵育48h，离心洗涤，弃上清。细胞部分测γ-计数，计算吸附率，反映细胞表面的VIPR数量。
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1.7 实验结果数据统计 数据用均数±标准差(
±s)表示；统计学处理用方差分析。2 结果
2.1 BEC的免疫细胞化学及电镜观察 抗角蛋白抗体的免疫细胞化学显示，细胞阳性染色率为91±3%(图1)。
图1 兔支气管上皮细胞的角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学鉴定
Fig. 1Immunocytochemistry identification for rabbit bronchial epithelial cells with monoclonic antibody to cytokeratin
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细胞形态呈柱状或锥状等，部分有纤毛，为典型的支气管纤毛上皮细胞。有些上皮呈分散态，有些呈簇分布，亦系气道上皮细胞的特征之一[5]。电镜下观察到纤毛细胞的“9+2”纤毛结构及胞浆内“牛眼样”分泌颗粒(图2)。
图2 纤毛上皮细胞的超微结构
Fig. 2 Ultrastructure of ciliated cells (10 000×)
2.2 兔BEC分泌的VIP含量 用浓度分别为3，7，10，20(ng.ml-1)的EGF处理BEC，图3观察到EGF促进VIP分泌的量-效关系，显示VIP分泌量随EGF浓度增加而增加(r=0.84,P<0.05)。
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图3EGF促BEC细胞分泌VIP的剂量依赖性效应(n=5)
Fig. 3 The dose-dependent effect of EGF on VIP secretion from BEC(n=5)
2.3 大鼠AM的VIP分泌 图4示，大鼠AM的VIP基础分泌量为38.7±9.68，经EGF(20ng.ml-1)处理后，VIP分泌量增多，达52.01±15.67(P<0.05)。
图4 EGF对肺泡巨噬细胞分泌VIP的影响(n=5) ①vs control P<0.05
Fig.4 Effect of EGF(20ng*ml-1) on VIP secretion from alveolar macrophage (n=5) ①vs control P<0.05
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2.4 兔BEC上的VIPR表达 测定BEC对125I-VIP的结合率，图5可观察到EGF明显促进VIP在BEC的表达，且其促进效应呈剂量依赖性(r=0.95,P<0.05)。
图5 EGF上调兔支气管上皮细胞表达VIPR的剂量依赖性效应(n=5)
Fig.5 Dose-dependent upregulatory effect of EGF on VIPR expression of rabbit BEC(n=5)
3 讨论
BEC细胞包括纤毛细胞、分泌细胞及基细胞，呈柱状、锥形等多种细胞形态，一般不难辨认。体外培养时其细胞形状可发生改变，如成为梭形或球形，但都能稳定地表达角蛋白，故可用抗角蛋白的免疫细胞化学进行细胞学鉴定。本实验用酶消化法结合刷取法获得高纯度的气道上皮细胞，形态学观察及免疫学细胞化学鉴定显示具有气道纤毛上皮细胞的典型特征，收获量可满足实验需要而无须传代。上皮细胞的纯度及成活率与国外同类研究报道接近[5]。电镜下观察到纤毛上皮细胞内线粒体和内质网发达，提示有活跃的代谢和分泌活动。纤毛细胞内还发现有APUD细胞所特有的“牛眼样”分泌颗粒。此类颗粒内主要含肽类神经递质[6]。这一形态学结构提示气道纤毛上皮细胞可能具有分泌神经肽的活性。
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曾观察到VIP可促进BEC的GSH合成，提高过氧化氢酶活性，增强细胞的抗氧化能力，减轻臭氧对BEC的损伤[4]。VIP的保护作用对于维护上皮完整、维持气道局部微环境稳态具有重要意义。VIP的血浆浓度较低且半衰期短，人血浆VIP浓度为20.3±18.3pg*ml-1[7]。因此，VIP对气道上皮保护作用的有效程度依赖于气道局部的VIP浓度及VIPR表达密度。本实验检测到常驻肺内的肺泡巨噬细胞及支气管上皮细胞均可释放VIP，提示在气道上皮局部可能存在VIP的自分泌和旁分泌调节作用，形成以VIP为信号分子的保护网络。
气道局部的VIP保护效应可因内外环境因素的变动而产生适应性改变，VIP有经常性的基础分泌。当肺内炎症或免疫反应时，支气管灌洗液中的VIP含量增多[1，2]，气道上皮及局部炎症细胞的VIPR分布也增多[8]。本组前期研究显示[4，9]，EGF，VIP等肺内调节肽可提高BEC对臭氧攻击的抵抗力。EGF是维持气道上皮更新和修复损伤的重要的调节肽，在调控细胞生长等方面与VIP可发生协同作用。本实验观察到EGF呈剂量依赖性促进BEC分泌VIP及表达VIPR，还可促进肺泡巨噬细胞分泌VIP。此结果提示EGF在气道上皮局部可放大VIP的保护效应，是有效而重要的调控机制。哮喘等气道高反应性疾病患者血浆及肺灌洗液中的VIP水平降低，似与该机制的削弱有关。
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①国家自然科学基金资助项目(39770635)
中国图书分类号 R329.25
参考文献
[1]Said SI. VIP as a modulator of lung inflammation and airway constriction. Am Rev Respir Dis, 1991,143:S22-24
[2]Berisha H, Foda H, Sakakibara H, et al. Vasoactive intestinal peptide prevents lung injury due to xanthine/xanthine oxidase. Am J Physiol, 1990,259:L151-155
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[3]邓翱，李平升，张志基，等.哮喘患者血浆血管活性肠肽测定及其意义.中华内科杂志，1993，32：165-166
[4]秦晓群，孙秀泓，张长青.血管活性肠肽对兔支气管上皮细胞抗臭氧损伤的保护作用.中国应用生理学杂志，1998，14：250-253
[5]Vignola AM, Campbell AM, Chanez P, et al. HLA-DR and ICAM-1 expression on bronchial epithelial cells in asthma and chronic bronchitis. Am Rev Respir Dis, 1993,148:689-694
[6]Junqueira LC, Carneiro J, Long JA. Basic Histology. 5th ed, Los Altos California: Longe Medical Publications, 1986:379-398
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[7]陈方元，陆国钧，侯雪，等.血管活性肠肽的放射免疫分析.中华核医学杂志，1996，6：18-20
[8]Kaltreider HB, Ichikawa S, Byrd PK, et al. Upregulation of neuropeptides and neuropeptide receptors in a murine model of immune inflammation in lung parenchyma. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:133-144
[9]秦晓群，孙秀泓，罗自强，等.表皮生长因子对培养的气道上皮细胞抗臭氧损伤的保护作用.生理学报，1996，48：190-194
收稿日期：1998-08-25, 百拇医药