层粘连蛋白对体外角膜上皮细胞凋亡的保护
作者：吴静 徐锦堂
单位：510632 广州，暨南大学医学院眼科
关键词：层粘连蛋白；凋亡；角膜上皮细胞；培养
眼科研究000206 摘要 目的观察层粘连蛋白(LN)对离体角膜上皮细胞存亡的影响，以寻找预防角膜上皮细胞凋亡的途径。方法应用流式细胞仪(FACStarplus)检测凋亡细胞的亚2倍体DNA的方法，对基础培养的、与LN共育的以及阻断LN受体后的兔角膜上皮细胞的凋亡情况进行了对比观察及分析。结果基础培养的第6代角膜上皮细胞出现明显的细胞凋亡；与LN共育的角膜上皮细胞凋亡不明显；阻断LN受体后，角膜上皮细胞出现显著的凋亡现象。结论LN对离体培养的角膜上皮细胞的凋亡有保护作用。
分类号 R 772
Laminin prevents apoptosis of corneal epithelial cells in vitro
, http://www.100md.com
Wu Jing，Xu Jintang.
Department of Ophthalmology，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632
Abstract ObjectiveTo prevent apoptosis of corneal epithelial cells cultured in vitro，the effects of laminin upon cell survival was studied.MethodsCorneal epithelial cells from New Zealand white rabbits were cultured respectively in basic culture medium (DMEM-Ham’s F-12 medium 1∶1)，in basic culture medium in which laminin was added and in basic culture medium in which antibody against laminin was added.The cells were passaged every 48 h.The cells form passages 1 to 6 were fixed with 70% ethanol after cultured for 48 h.After staining with propidium iodide(PI)，apoptosis was measured by the presence of degraded DNA(< 2 n DNA) in a flow cytometric assay.ResultsFlow-cytometric analysis of propidium iodide-stained cells indicated that 7.00%±2.23% of the primary cells contained < 2 n DNA while cultured in basic culture medium.Sixth passage cells grown in basic culture medium showed significantly increased amounts of degraded DNA (18.74%±3.93%，P<0.01).A significantly higher percentage of cells survived in the 6th passage when cells were cultured in the presence of laminin.In contrast，an increased amount of apoptosis(30.80%±7.90%)was found when cells were cultured in the presence of with anti-laminin antibody.ConclusionLaminin can prevent apoptosis of corneal epithelial cells cultured in vitro.
, 百拇医药
Key word slaminin apoptosis corneal epithelial cell culture
利用培养的角膜上皮行角膜移植以改善眼表，是治疗角膜表面疾患的新尝试。体外能获得长期存活并增殖的角膜上皮细胞是此方法实施的前提，可是在我们对角膜缘上皮细胞进行离体培养时，历经几次细胞传代培养，上皮细胞的增殖力逐渐减弱，最后停止增殖而死亡。为探索细胞死亡的原因，我们应用基础培养、与层粘连蛋白(laminin，LN)共育以及阻断LN受体法，对离体角膜缘上皮细胞的存活情况进行了观察及对比分析，以寻找预防细胞凋亡的途径。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞培养法
1.1.1 基础培养法 取新鲜兔眼球，无菌处理后，取浅层带有角膜上皮的角膜缘组织，以质量浓度0.25%胰蛋白酶-0.01 mol/L EDTA孵育消化法获取角膜上皮细胞(1×106/ml)，在含有10%小牛血清的F12-DMEM(Gibco，USA)培养液中，5% CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养。48 h 传代1次。
, 百拇医药
1.1.2 与LN共育法 将96孔培养板底涂一层LN液(25 μg/cm2)，-70℃冻干后，将角膜上皮细胞(1×106/ml)种于上。5% CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养48 h。
1.1.3 阻断LN受体法 将角膜上皮细胞种植在含有10 μg/ml抗-LN单克隆抗(Sigma，USA)培养液中，5% CO2，37℃，培养48 h。
1.2 细胞凋亡的流式细胞仪检测法
用质量浓度0.25%胰蛋白酶、0.01 mol/L EDTA消化培养48 h后的各组角膜上皮细胞，收集细胞，调细胞浓度在1×106个/ml；取1 ml细胞悬液，离心800～1 000 r/ min，10 min，弃上清；重悬细胞于100 μl的PBS中；慢慢滴注细胞悬液 到(事先预冷-20℃)5 ml的70%的乙醇中固定；放置4℃中待用。用前离心去除固定液；加PNAase 200 μl 37 ℃水浴30 min；再加入800 μl碘化丙啶(prooidium iodide，PI)染色液，混匀，4 ℃，避光30 min；在FACStarplus流式细胞仪上分析细胞凋亡(亚2倍体DNA)的情况。实验获取的数据经SPSS 4.0统计学软件处理分析。
, 百拇医药
2 结果与分析
2.1 离体角膜上皮细胞在基础条件培养下的细胞凋亡检测结果 角膜原代上皮细胞被检测出7.00%±2.23%的凋亡细胞。第1代到第5代各组细胞与原代相比，细胞凋亡率并无明显变化(P>0.01)；从第6代开始，角膜上皮细胞凋亡率为18.74%±3.93%，与原代相比，细胞凋亡率有显著升高(P<0.01)。
2.2 与LN共育的第6代角膜上皮细胞凋亡率明显低于基础条件培养下的同代细胞(P<0.01)，见表1。
表1 LN对离体培养的角膜上皮细胞
凋亡率的影响(
±s，n＝5)
Tab.1 The effect of laminin on the apoptosis rate of corneal
, 百拇医药
epithelial cells cultured in vitro(±s，n＝5)
Apoptosis rate(%)
t
P
Passage 6 (control)
18.82±3.91
Passage 6 in LN
7.4±1.49
6.106 9
0.002 92
, 百拇医药
t test P<0.012.3 阻断LN受体后，角膜上皮细胞贴壁障碍，原代细胞即被检测出30.80%±7.90%的凋亡DNA。见表2。
表2 阻断LN受体对离体培养的角膜上皮细胞
凋亡率的影响(±s，n＝5)
Tab.1 The effect of anti-laminin receptors on the apoptosis rate
of corneal epithelial cells cultured in vitro(±s，n＝5)
Apoptosis rate(%)
, 百拇医药
t
P
Passage 0 (control)
6.3±1.7
Passage 0 in ant i-LN
30.8±7.9
6.779 6
0.001 9
t test P<0.01
3 讨论
细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内外多种因素均可影响细胞凋亡的发生[1]。角膜上皮组织在生理状况下存在着一定数量细胞凋亡，所丢失的细胞由角膜缘干细胞的增殖来补充，维持着角膜上皮的完整[2]。角膜缘干细胞在理论上应该是具有无限潜在的增殖能力，可是在我们对角膜缘上皮细胞进行体外培养时，发现在一般培养条件下，第6代角膜缘上皮细胞出现了显著的细胞凋亡现象，不足10代时，细胞出现了集体“自杀”现象。这与角膜缘上皮细胞在体内的代谢情况相差甚远，这种离体后细胞的凋亡无疑与体外细胞生长环境的改变相关。
, 百拇医药
LN是基底膜的特异的和主要的蛋白组成成分，它突出的生物作用就是促进细胞的粘附和运动。近年来，发现LN生物效应远比目前定义的要复杂得多，虽然现在还不能很明确地定义LN的功能，但是许多研究的确发现LN与众多的细胞生物现象相关[3]。多年来，在治疗角膜上皮疾患中发现：长期不愈的角膜上皮缺损都伴有角膜基底膜的异常及缺失[4]。基底膜中的LN除了促进细胞粘附的重要功能之外，它的成分及空间结构决定着角膜上皮的分裂、增殖及分化[5]。因而，LN应是与上皮细胞存活最为密切的相关因素之一。我们用抗LN抗体完全封闭内源及外源性LN对离体的角膜上皮的作用时发现细胞贴壁障碍，几乎不增殖，原代细胞就出现大量的细胞凋亡，由此可见LN的缺乏可诱导细胞凋亡的发生。相反，我们用外源性LN来增进培养细胞的粘附及增殖可明显地减少细胞的凋亡。因此，在预防角膜上皮细胞凋亡的措施中，LN应是不可缺少的重要因素之一。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39870855)和广东省科学基金资助(基金编号：930443)
, http://www.100md.com
1，石运伯，王若翔，时玉舫.细胞凋亡的分子机理.生命科学，1996，8(3)∶8
2，孙秉基，徐锦堂.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社，1994.10-16
3，Mercurio AM.Laminin receptors：achieving specificity through cooperation.Trends in Cell Biology，1995，5∶419
4，Gipson I，Friend J，Spurr SJ.Transplant of corneal epithelium to rabbit corneal wounds in vivo.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26∶425
5，Ljubimor AV.Human corneal basement membrane heterogeneity：topographical differences in the expression of type IV collagen and laminin isoforms.Lab Invest，1995，72(4)∶461
(收稿：1999-03-09 修回：1999-11-10), http://www.100md.com
单位：510632 广州，暨南大学医学院眼科
关键词：层粘连蛋白；凋亡；角膜上皮细胞；培养
眼科研究000206 摘要 目的观察层粘连蛋白(LN)对离体角膜上皮细胞存亡的影响，以寻找预防角膜上皮细胞凋亡的途径。方法应用流式细胞仪(FACStarplus)检测凋亡细胞的亚2倍体DNA的方法，对基础培养的、与LN共育的以及阻断LN受体后的兔角膜上皮细胞的凋亡情况进行了对比观察及分析。结果基础培养的第6代角膜上皮细胞出现明显的细胞凋亡；与LN共育的角膜上皮细胞凋亡不明显；阻断LN受体后，角膜上皮细胞出现显著的凋亡现象。结论LN对离体培养的角膜上皮细胞的凋亡有保护作用。
分类号 R 772
Laminin prevents apoptosis of corneal epithelial cells in vitro
, http://www.100md.com
Wu Jing，Xu Jintang.
Department of Ophthalmology，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632
Abstract ObjectiveTo prevent apoptosis of corneal epithelial cells cultured in vitro，the effects of laminin upon cell survival was studied.MethodsCorneal epithelial cells from New Zealand white rabbits were cultured respectively in basic culture medium (DMEM-Ham’s F-12 medium 1∶1)，in basic culture medium in which laminin was added and in basic culture medium in which antibody against laminin was added.The cells were passaged every 48 h.The cells form passages 1 to 6 were fixed with 70% ethanol after cultured for 48 h.After staining with propidium iodide(PI)，apoptosis was measured by the presence of degraded DNA(< 2 n DNA) in a flow cytometric assay.ResultsFlow-cytometric analysis of propidium iodide-stained cells indicated that 7.00%±2.23% of the primary cells contained < 2 n DNA while cultured in basic culture medium.Sixth passage cells grown in basic culture medium showed significantly increased amounts of degraded DNA (18.74%±3.93%，P<0.01).A significantly higher percentage of cells survived in the 6th passage when cells were cultured in the presence of laminin.In contrast，an increased amount of apoptosis(30.80%±7.90%)was found when cells were cultured in the presence of with anti-laminin antibody.ConclusionLaminin can prevent apoptosis of corneal epithelial cells cultured in vitro.
, 百拇医药
Key word slaminin apoptosis corneal epithelial cell culture
利用培养的角膜上皮行角膜移植以改善眼表，是治疗角膜表面疾患的新尝试。体外能获得长期存活并增殖的角膜上皮细胞是此方法实施的前提，可是在我们对角膜缘上皮细胞进行离体培养时，历经几次细胞传代培养，上皮细胞的增殖力逐渐减弱，最后停止增殖而死亡。为探索细胞死亡的原因，我们应用基础培养、与层粘连蛋白(laminin，LN)共育以及阻断LN受体法，对离体角膜缘上皮细胞的存活情况进行了观察及对比分析，以寻找预防细胞凋亡的途径。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞培养法
1.1.1 基础培养法 取新鲜兔眼球，无菌处理后，取浅层带有角膜上皮的角膜缘组织，以质量浓度0.25%胰蛋白酶-0.01 mol/L EDTA孵育消化法获取角膜上皮细胞(1×106/ml)，在含有10%小牛血清的F12-DMEM(Gibco，USA)培养液中，5% CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养。48 h 传代1次。
, 百拇医药
1.1.2 与LN共育法 将96孔培养板底涂一层LN液(25 μg/cm2)，-70℃冻干后，将角膜上皮细胞(1×106/ml)种于上。5% CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养48 h。
1.1.3 阻断LN受体法 将角膜上皮细胞种植在含有10 μg/ml抗-LN单克隆抗(Sigma，USA)培养液中，5% CO2，37℃，培养48 h。
1.2 细胞凋亡的流式细胞仪检测法
用质量浓度0.25%胰蛋白酶、0.01 mol/L EDTA消化培养48 h后的各组角膜上皮细胞，收集细胞，调细胞浓度在1×106个/ml；取1 ml细胞悬液，离心800～1 000 r/ min，10 min，弃上清；重悬细胞于100 μl的PBS中；慢慢滴注细胞悬液 到(事先预冷-20℃)5 ml的70%的乙醇中固定；放置4℃中待用。用前离心去除固定液；加PNAase 200 μl 37 ℃水浴30 min；再加入800 μl碘化丙啶(prooidium iodide，PI)染色液，混匀，4 ℃，避光30 min；在FACStarplus流式细胞仪上分析细胞凋亡(亚2倍体DNA)的情况。实验获取的数据经SPSS 4.0统计学软件处理分析。
, 百拇医药
2 结果与分析
2.1 离体角膜上皮细胞在基础条件培养下的细胞凋亡检测结果 角膜原代上皮细胞被检测出7.00%±2.23%的凋亡细胞。第1代到第5代各组细胞与原代相比，细胞凋亡率并无明显变化(P>0.01)；从第6代开始，角膜上皮细胞凋亡率为18.74%±3.93%，与原代相比，细胞凋亡率有显著升高(P<0.01)。
2.2 与LN共育的第6代角膜上皮细胞凋亡率明显低于基础条件培养下的同代细胞(P<0.01)，见表1。
表1 LN对离体培养的角膜上皮细胞
凋亡率的影响(
±s，n＝5)Tab.1 The effect of laminin on the apoptosis rate of corneal
, 百拇医药
epithelial cells cultured in vitro(
±s，n＝5)Apoptosis rate(%)
t
P
Passage 6 (control)
18.82±3.91
Passage 6 in LN
7.4±1.49
6.106 9
0.002 92
, 百拇医药
t test P<0.012.3 阻断LN受体后，角膜上皮细胞贴壁障碍，原代细胞即被检测出30.80%±7.90%的凋亡DNA。见表2。
表2 阻断LN受体对离体培养的角膜上皮细胞
凋亡率的影响(
±s，n＝5)Tab.1 The effect of anti-laminin receptors on the apoptosis rate
of corneal epithelial cells cultured in vitro(
±s，n＝5)Apoptosis rate(%)
, 百拇医药
t
P
Passage 0 (control)
6.3±1.7
Passage 0 in ant i-LN
30.8±7.9
6.779 6
0.001 9
t test P<0.01
3 讨论
细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内外多种因素均可影响细胞凋亡的发生[1]。角膜上皮组织在生理状况下存在着一定数量细胞凋亡，所丢失的细胞由角膜缘干细胞的增殖来补充，维持着角膜上皮的完整[2]。角膜缘干细胞在理论上应该是具有无限潜在的增殖能力，可是在我们对角膜缘上皮细胞进行体外培养时，发现在一般培养条件下，第6代角膜缘上皮细胞出现了显著的细胞凋亡现象，不足10代时，细胞出现了集体“自杀”现象。这与角膜缘上皮细胞在体内的代谢情况相差甚远，这种离体后细胞的凋亡无疑与体外细胞生长环境的改变相关。
, 百拇医药
LN是基底膜的特异的和主要的蛋白组成成分，它突出的生物作用就是促进细胞的粘附和运动。近年来，发现LN生物效应远比目前定义的要复杂得多，虽然现在还不能很明确地定义LN的功能，但是许多研究的确发现LN与众多的细胞生物现象相关[3]。多年来，在治疗角膜上皮疾患中发现：长期不愈的角膜上皮缺损都伴有角膜基底膜的异常及缺失[4]。基底膜中的LN除了促进细胞粘附的重要功能之外，它的成分及空间结构决定着角膜上皮的分裂、增殖及分化[5]。因而，LN应是与上皮细胞存活最为密切的相关因素之一。我们用抗LN抗体完全封闭内源及外源性LN对离体的角膜上皮的作用时发现细胞贴壁障碍，几乎不增殖，原代细胞就出现大量的细胞凋亡，由此可见LN的缺乏可诱导细胞凋亡的发生。相反，我们用外源性LN来增进培养细胞的粘附及增殖可明显地减少细胞的凋亡。因此，在预防角膜上皮细胞凋亡的措施中，LN应是不可缺少的重要因素之一。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39870855)和广东省科学基金资助(基金编号：930443)
, http://www.100md.com
1，石运伯，王若翔，时玉舫.细胞凋亡的分子机理.生命科学，1996，8(3)∶8
2，孙秉基，徐锦堂.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社，1994.10-16
3，Mercurio AM.Laminin receptors：achieving specificity through cooperation.Trends in Cell Biology，1995，5∶419
4，Gipson I，Friend J，Spurr SJ.Transplant of corneal epithelium to rabbit corneal wounds in vivo.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26∶425
5，Ljubimor AV.Human corneal basement membrane heterogeneity：topographical differences in the expression of type IV collagen and laminin isoforms.Lab Invest，1995，72(4)∶461
(收稿：1999-03-09 修回：1999-11-10), http://www.100md.com