不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞表达p21WAF1的影响
作者：杨琼琼 李志坚 叶任高 陈永雄 许韩师 孔庆瑜 余学清
单位：中山医科大学附属第一医院肾内科，广东 广州 510080
关键词：腹膜间皮细胞；葡萄糖；细胞周期；细胞周期蛋白；腹膜透析
中山医科大学学报000311
摘 要：【目的】观察不同浓度的葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响。【方法】大鼠腹膜间皮细胞在含糖13.8 g/L和38.6 g/L的无血清培养基培养24 h后，用流式细胞仪分析细胞周期分布，用RT-PCR法测定p21WAF1的表达水平。【结果】经含糖13.8 g/L和38.6 g/L培养基培养24 h后腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期，以38.6 g/L组明显。高浓度葡萄糖刺激p21WAF1 mRNA表达，38.6 g/L组表达明显增高(P<0.05)；无血清常规培养基组和甘露醇组几乎无表达。【结论】高糖可刺激间皮细胞p21WAF1的表达，且可能与高糖作用下细胞肥大及G1期阻滞有关。
, 百拇医药
中图分类号：R 692.5；R 329.24；R 342.23；Q 253 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)03-0196-03
Effect of Different Concentrated Glucose on the p21WAF1 Expression in Rat Peritoneal Mesothelial Cells
YANG Qiong-qiong,LI Zhi-jian,YE Ren-gao,CHEN Yong-xiong,XU Han-shi,KONG Qing-yu,YU Xue-qing
(Department of Nephology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
Abstract:【Objective】To investigate the effect of different concentrated glucose on the p21WAF1 expression in rat peritoneal mesothelial cells.【Methods】Rat peritoneal mesothelial cells were cultured with serum-free DMEM medium containing different glucose concentrations (13.8 g/L and 38.6 g/L) for 24 hours.The cell cycle distribution was then investigated by flow cytometry.The expression of p21WAF1 was detected by RT-PCR.【Results】In the presence of 13.8 g/L and 38.6 g/L glucose concentrations,most of the cells became hypertrophic,and were arrested in G1 phase of cell cycle,which were obvious in the 38.6 g/L.High glucose stimulated expression of p21WAF1 mRNA,which was significantly higher in the 3.86%(P<0.05).p21WAF1 mRNA expressions were absent in serum-free normal glucose concentration groups and the D-mannitol groups.【Conclusion】High glucose stimulated expression of p21WAF1,which might be related to the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells by high glucose.
, 百拇医药
Key words:peritoneal mesothelial cells; glucose; cell cycle; cell cycle protein; peritoneal dialysis
腹膜纤维化而致的腹膜功能衰竭是腹膜透析发展长期受限的主要原因。目前使用的腹膜透析液是以高浓度葡萄糖为渗透剂的非生理性液体。已有研究发现[1，2]高糖可使间皮细胞肥大、再生修复障碍，使早期腹膜间皮细胞层受损或缺失，腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，最终导致腹膜纤维化和腹膜功能丧失。细胞周期调控蛋白p21WAF1是近年分离得到的一种细胞周期抑制蛋白，其过度表达与细胞肥大和复制停滞有关[3～5]。是否高糖作用下腹膜间皮细胞的肥大与p21WAF1表达有关，至今国内外尚未有报道。我们用半定量RT-PCR法，观察不同浓度葡萄糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响，从细胞周期角度探讨早期腹膜纤维化的分子机制。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定
大鼠腹膜间皮细胞按Hjelle等[6]建立的方法培养。融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用抗大鼠Cytokeritin、抗大鼠Vimentin和抗Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体(美国Dako公司)做免疫组化(用SP试剂盒，北京中山公司)鉴定细胞，结果抗cytokeritin和抗vimentin抗原阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。
1.2 间皮细胞在不同浓度葡萄糖作用下的形态
将融合后的大鼠腹膜间皮细胞消化后用含100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养基制成细胞悬液接种于6孔培养板中，细胞密度为107/孔，培养至亚融合后加入无血清培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同浓度的葡萄糖，(13.8，38.6 g/L)的培养基培养24 h后在倒置显微镜下观察细胞形态。每个浓度组设一个与葡萄糖组相同渗透压的甘露醇(浓度为13.8，38.6 g/L)为对照组，另设无血清DMEM-F12培养基(含生理浓度的葡萄糖)为空白对照组。
, 百拇医药
1.3 流式细胞仪分析不同浓度葡萄糖作用间皮细胞的周期分布
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后用1.25 g/L胰蛋白酶轻消化，PBS洗后用700 mL/L乙醇4 ℃固定过夜。次日用PBS洗脱乙醇，制成单细胞悬液。PI染色后用流式细胞仪(美国Coulter公司)分析，并以相对细胞数为Y轴，相对的DNA量为X轴作一曲线。细胞周期G1期的细胞数百分比从图中通过电脑分析得出。
1.4 间皮细胞RNA提取
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用胰酶消化细胞并收集于无RNA酶的1.5 mL离心管中。用RNeasyMini Kit一步法试剂盒(美国基因公司)提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，重复3次。样品A260nm/A280nm比值在1.8～2.0之间。
, 百拇医药
1.5 RT-PCR法检测p21WAF1 mRNA表达
逆转录：采用THERMOSCIPTTM逆转录试剂盒(美国Gibco公司)。取1 μg总RNA加入1 μL oligo dT引物，65 ℃变性5 min，依次加入10 mol/L dNTP 2 μL、0.1 MDTT 1 μL、40 U/μL RNase OUT 1 μL、5×cDNA合成缓冲液4 μL和Thermoscript反转录酶(15 U/ μL) 1 μL，总反应体积20 μL。50 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min后终止反应。最后加入1 μL RNase H 37 ℃孵育20 min。
半定量PCR：取反转录后所得的cDNA模板2 μL，分别加入10×PCR缓冲液5 μL、2.5 nmol/L dNTP混合物5 μL、10 μmol/L上游及下游引物各1 μL和Taq DNA聚合酶2 μL(美国Promega公司)，总反应体积为50 μL。PCR反应所需的变性、退火和延伸温度为94 ℃、61 ℃、72 ℃，反应时间45 s、45 s、1 min，共循环30次。取15 μL反应液在20 g/L琼脂糖凝胶(含0.2 μg/mL EB)电泳后在紫外灯下用凝胶成像系统成像及分析，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参照，计算每一样本的p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。以血管紧张素Ⅱ刺激24 h后的肾小管上皮细胞为阳性对照[7]。
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引物设计和合成
p21WAF1(310 bp)[8]
上游引物 AGTATGCCGTCGTCTGTTCG
下游引物 GAGTGCAAGACAGCGACAAG
GAPDH (230 bp)
上游引物 ACCACAGTCCATGAAATCAC
下游引物 AGGTTTCTCCAGGCGGCATG
1.6 统计学处理
全部数据采用SPSS6.0医用统计软件进行处理，结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间差异以F检验和Q检验作统计学处理。
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2 结 果
2.1 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞形态的影响
在倒置显微镜下可观察到大鼠腹膜间皮细胞在含葡萄糖38.6 g/L和13.6 g/L组的培养条件出现两种明显的形态学改变：一是细胞肥大，核仁明显，呈“牛眼”征；二是可见许多细胞的胞核增多，细胞分裂停止。以上改变在38.6 g/L组中更为明显(见图1)。在甘露醇组仅有轻度细胞肥大，但未见类似高糖组的多核细胞的改变。
图1 在含糖38.6 g/L培养基培养24 h后大鼠腹膜间皮细胞的形态改变
Fig.1 The morphology of rat mesothelial cells cultured in the 38.6 g/L glucose medium for 24 h
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(HM 10×40)
2.2 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞细胞周期数的影响
用流式细胞仪分析细胞周期G1期分布比例发现，在无血清的常规培养基(空白对照组)培养24 h的间皮细胞G1期细胞比例为62.7%±3.4%，而在含糖13.8 g/L和38.6 g/L组G1期细胞比例明显增高，为73.1%±3.5%和81.5%±2.3%，其中含葡萄糖38.6 g/L组显著高于空白对照组(P<0.05)。含甘露醇13.8 g/L和38.6 g/L组G1期细胞比例为64.6%±5.5%和68.5%±7.3%，与空白对照组之间无显著差异。
2.3 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1基因表达的影响
图2可见在无血清常规培养基培养下，静止期的间皮细胞几乎无p21WAF1 mRNA的表达，但在含糖13.8 g/L和38.6 g/L组可见p21WAF1表达，其中38.6 g/L组(p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值为0.50±0.07)显著高于13.8 g/L组(0.36±0.04)，P<0.05，含甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA的表达。
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图2 RT-PCR法检测大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1 mRNA的表达
Fig.2 Measurement of the p21WAF1 mRNA expression in rat peritoneal mesothelial cells by RT-PCR
1: 13.8 g/L glucose,2: 38.6 g/L glucose,3: serum-free medium,4:positive control,5: 13.8 g/L mannitol,6: 38.6 g/L mannitol,A:p21WAF1 B: GAPDH
3 讨 论
腹膜透析是治疗终末期肾脏病的主要替代疗法。腹膜结构和生理功能的稳定是腹膜透析能长期有效进行的关键。腹膜间皮细胞是构成腹膜的最重要的细胞群体，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用。在长期腹透中腹膜间皮细胞可因持续暴露于高糖腹透液中出现细胞肥大、胞核增多、细胞分裂停滞等表现[1，2]。我们的实验也发现同样现象。近期有学者提出间皮细胞上述改变可能与高糖对细胞周期的影响有关[2]。在本实验中我们也发现高浓度葡萄糖促使间皮细胞停滞于细胞周期的G1期，并随着葡萄糖浓度的增高而明显，而与渗透压的关系不大。但是高糖如何促使腹膜间皮细胞肥大并停滞于G1期，目前机制未明。
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目前认为细胞肥大可能是细胞受细胞内外信号刺激后进入G1期时，DNA合成被抑制同时蛋白和RNA合成增加，细胞生长停滞于G1期[9]。细胞周期抑制蛋白p21WAF1是近年分离得到的一类细胞周期调控蛋白，它能广泛抑制G1期和S期的周期素(cyclin)与细胞周期激酶(CDK)结合，使视网膜瘤蛋白(Rb)不能磷酸化，从而不能释放转录因子E2F，使G1期过度延长，细胞增殖抑制，细胞呈肥大状态。目前推测它是细胞周期G1/S期转换过程的关键[9]。已有许多研究表明p21WAF1的过度表达与细胞肥大、G1期停滞有关[3～5，9]。近期Kuan CJ等[5]研究发现高浓度葡萄糖诱导系膜细胞肥大与p21WAF1表达水平增高有关。是否高糖作用下间皮细胞的肥大和G1期停滞也与细胞内p21WAF1表达增高有关，目前国内外尚未见报道。我们用RT-PCR法检测不同浓度葡萄糖对p21WAF1 mRNA表达的影响，发现空白对照组和甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA的表达，而高浓度葡萄糖可刺激间皮细胞p21WAF1 mRNA的表达，且随着含糖浓度增高而表达增高。这初步提示高糖可刺激间皮细胞表达p21WAF1，这一作用与葡萄糖的浓度有关，而与葡萄糖产生的渗透压关系不大。本文研究结果初步提示高糖对间皮细胞增殖和形态学的改变可能与细胞周期的调控失衡有关。
, 百拇医药
基金项目：卫生部临床重点攻关项目基金资助(97040228)
作者简介：杨琼琼(1971-)，女，福建龙岩人，在职博士生，讲师.
参考文献：
[1]Gotloib L,Wajsbrot V,Shostak A,et al.Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucose-enriched,lactated,buffered dialysis solutions[J].Nephron,1995,70(2):446.
[2]Gotloib L,Shostak A,Wajsbist V,et al.High glucose induced a hypertrophic,senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure[J].Nephron,1999,82(1):164.
, 百拇医药
[3]Shankland S J.Cell-cycle control and renal disease[J].Kid Int,1997,52(2):294.
[4]Sheikh M S,Rochefort H,Gracia M,et al.Overexpression of p21WAF1/cipl induces growth arrest,giant cell formation and apotosis in human breast carcinoma cell lines[J].Oncogene,1995,11(9):1899.
[5]Kuan C J,A1-Douahh M,Shankland S.The cyclin kinase inhibitor p21WAF1,cipl is increased in experimental diabetic nephropathy:potential role in glomerular hypertrophy[J].J Am Soc Nephrol,1998,9(3):986.
, 百拇医药
[6]Hjelle J H,Golinska B T,Waters D C,et al.Isolation and propagation in ivtro of peritoneal mesothelial cells.Perit Dial Int,1989,9(2):341.
[7]Terada Y,Yanada T,Nakashima O,et al.Angiotension-Ⅱ induced p21cip1 via JAK2-STAT1 pathway and caused hypertrophy in proximal tubular cells[J].J Am Soc Nephrol,1996,7(10):1776.
[8]Sugiyama A,Nagaki M,Shido ji Y,et al.Regulator of cell cycle-related genes in rat hepatocytes by transforming growth factor β-1[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,238(2):539.
[9]Shankland S J.Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease[J].Kid Int,1999,56(10):1208.
收稿日期：1999-12-10, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第一医院肾内科，广东 广州 510080
关键词：腹膜间皮细胞；葡萄糖；细胞周期；细胞周期蛋白；腹膜透析
中山医科大学学报000311
摘 要：【目的】观察不同浓度的葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响。【方法】大鼠腹膜间皮细胞在含糖13.8 g/L和38.6 g/L的无血清培养基培养24 h后，用流式细胞仪分析细胞周期分布，用RT-PCR法测定p21WAF1的表达水平。【结果】经含糖13.8 g/L和38.6 g/L培养基培养24 h后腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期，以38.6 g/L组明显。高浓度葡萄糖刺激p21WAF1 mRNA表达，38.6 g/L组表达明显增高(P<0.05)；无血清常规培养基组和甘露醇组几乎无表达。【结论】高糖可刺激间皮细胞p21WAF1的表达，且可能与高糖作用下细胞肥大及G1期阻滞有关。
, 百拇医药
中图分类号：R 692.5；R 329.24；R 342.23；Q 253 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)03-0196-03
Effect of Different Concentrated Glucose on the p21WAF1 Expression in Rat Peritoneal Mesothelial Cells
YANG Qiong-qiong,LI Zhi-jian,YE Ren-gao,CHEN Yong-xiong,XU Han-shi,KONG Qing-yu,YU Xue-qing
(Department of Nephology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
Abstract:【Objective】To investigate the effect of different concentrated glucose on the p21WAF1 expression in rat peritoneal mesothelial cells.【Methods】Rat peritoneal mesothelial cells were cultured with serum-free DMEM medium containing different glucose concentrations (13.8 g/L and 38.6 g/L) for 24 hours.The cell cycle distribution was then investigated by flow cytometry.The expression of p21WAF1 was detected by RT-PCR.【Results】In the presence of 13.8 g/L and 38.6 g/L glucose concentrations,most of the cells became hypertrophic,and were arrested in G1 phase of cell cycle,which were obvious in the 38.6 g/L.High glucose stimulated expression of p21WAF1 mRNA,which was significantly higher in the 3.86%(P<0.05).p21WAF1 mRNA expressions were absent in serum-free normal glucose concentration groups and the D-mannitol groups.【Conclusion】High glucose stimulated expression of p21WAF1,which might be related to the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells by high glucose.
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Key words:peritoneal mesothelial cells; glucose; cell cycle; cell cycle protein; peritoneal dialysis
腹膜纤维化而致的腹膜功能衰竭是腹膜透析发展长期受限的主要原因。目前使用的腹膜透析液是以高浓度葡萄糖为渗透剂的非生理性液体。已有研究发现[1，2]高糖可使间皮细胞肥大、再生修复障碍，使早期腹膜间皮细胞层受损或缺失，腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，最终导致腹膜纤维化和腹膜功能丧失。细胞周期调控蛋白p21WAF1是近年分离得到的一种细胞周期抑制蛋白，其过度表达与细胞肥大和复制停滞有关[3～5]。是否高糖作用下腹膜间皮细胞的肥大与p21WAF1表达有关，至今国内外尚未有报道。我们用半定量RT-PCR法，观察不同浓度葡萄糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响，从细胞周期角度探讨早期腹膜纤维化的分子机制。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定
大鼠腹膜间皮细胞按Hjelle等[6]建立的方法培养。融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用抗大鼠Cytokeritin、抗大鼠Vimentin和抗Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体(美国Dako公司)做免疫组化(用SP试剂盒，北京中山公司)鉴定细胞，结果抗cytokeritin和抗vimentin抗原阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。
1.2 间皮细胞在不同浓度葡萄糖作用下的形态
将融合后的大鼠腹膜间皮细胞消化后用含100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养基制成细胞悬液接种于6孔培养板中，细胞密度为107/孔，培养至亚融合后加入无血清培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同浓度的葡萄糖，(13.8，38.6 g/L)的培养基培养24 h后在倒置显微镜下观察细胞形态。每个浓度组设一个与葡萄糖组相同渗透压的甘露醇(浓度为13.8，38.6 g/L)为对照组，另设无血清DMEM-F12培养基(含生理浓度的葡萄糖)为空白对照组。
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1.3 流式细胞仪分析不同浓度葡萄糖作用间皮细胞的周期分布
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后用1.25 g/L胰蛋白酶轻消化，PBS洗后用700 mL/L乙醇4 ℃固定过夜。次日用PBS洗脱乙醇，制成单细胞悬液。PI染色后用流式细胞仪(美国Coulter公司)分析，并以相对细胞数为Y轴，相对的DNA量为X轴作一曲线。细胞周期G1期的细胞数百分比从图中通过电脑分析得出。
1.4 间皮细胞RNA提取
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用胰酶消化细胞并收集于无RNA酶的1.5 mL离心管中。用RNeasyMini Kit一步法试剂盒(美国基因公司)提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，重复3次。样品A260nm/A280nm比值在1.8～2.0之间。
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1.5 RT-PCR法检测p21WAF1 mRNA表达
逆转录：采用THERMOSCIPTTM逆转录试剂盒(美国Gibco公司)。取1 μg总RNA加入1 μL oligo dT引物，65 ℃变性5 min，依次加入10 mol/L dNTP 2 μL、0.1 MDTT 1 μL、40 U/μL RNase OUT 1 μL、5×cDNA合成缓冲液4 μL和Thermoscript反转录酶(15 U/ μL) 1 μL，总反应体积20 μL。50 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min后终止反应。最后加入1 μL RNase H 37 ℃孵育20 min。
半定量PCR：取反转录后所得的cDNA模板2 μL，分别加入10×PCR缓冲液5 μL、2.5 nmol/L dNTP混合物5 μL、10 μmol/L上游及下游引物各1 μL和Taq DNA聚合酶2 μL(美国Promega公司)，总反应体积为50 μL。PCR反应所需的变性、退火和延伸温度为94 ℃、61 ℃、72 ℃，反应时间45 s、45 s、1 min，共循环30次。取15 μL反应液在20 g/L琼脂糖凝胶(含0.2 μg/mL EB)电泳后在紫外灯下用凝胶成像系统成像及分析，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参照，计算每一样本的p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。以血管紧张素Ⅱ刺激24 h后的肾小管上皮细胞为阳性对照[7]。
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引物设计和合成
p21WAF1(310 bp)[8]
上游引物 AGTATGCCGTCGTCTGTTCG
下游引物 GAGTGCAAGACAGCGACAAG
GAPDH (230 bp)
上游引物 ACCACAGTCCATGAAATCAC
下游引物 AGGTTTCTCCAGGCGGCATG
1.6 统计学处理
全部数据采用SPSS6.0医用统计软件进行处理，结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间差异以F检验和Q检验作统计学处理。, 百拇医药
2 结 果
2.1 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞形态的影响
在倒置显微镜下可观察到大鼠腹膜间皮细胞在含葡萄糖38.6 g/L和13.6 g/L组的培养条件出现两种明显的形态学改变：一是细胞肥大，核仁明显，呈“牛眼”征；二是可见许多细胞的胞核增多，细胞分裂停止。以上改变在38.6 g/L组中更为明显(见图1)。在甘露醇组仅有轻度细胞肥大，但未见类似高糖组的多核细胞的改变。
图1 在含糖38.6 g/L培养基培养24 h后大鼠腹膜间皮细胞的形态改变
Fig.1 The morphology of rat mesothelial cells cultured in the 38.6 g/L glucose medium for 24 h
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(HM 10×40)
2.2 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞细胞周期数的影响
用流式细胞仪分析细胞周期G1期分布比例发现，在无血清的常规培养基(空白对照组)培养24 h的间皮细胞G1期细胞比例为62.7%±3.4%，而在含糖13.8 g/L和38.6 g/L组G1期细胞比例明显增高，为73.1%±3.5%和81.5%±2.3%，其中含葡萄糖38.6 g/L组显著高于空白对照组(P<0.05)。含甘露醇13.8 g/L和38.6 g/L组G1期细胞比例为64.6%±5.5%和68.5%±7.3%，与空白对照组之间无显著差异。
2.3 不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1基因表达的影响
图2可见在无血清常规培养基培养下，静止期的间皮细胞几乎无p21WAF1 mRNA的表达，但在含糖13.8 g/L和38.6 g/L组可见p21WAF1表达，其中38.6 g/L组(p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值为0.50±0.07)显著高于13.8 g/L组(0.36±0.04)，P<0.05，含甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA的表达。
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图2 RT-PCR法检测大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1 mRNA的表达
Fig.2 Measurement of the p21WAF1 mRNA expression in rat peritoneal mesothelial cells by RT-PCR
1: 13.8 g/L glucose,2: 38.6 g/L glucose,3: serum-free medium,4:positive control,5: 13.8 g/L mannitol,6: 38.6 g/L mannitol,A:p21WAF1 B: GAPDH
3 讨 论
腹膜透析是治疗终末期肾脏病的主要替代疗法。腹膜结构和生理功能的稳定是腹膜透析能长期有效进行的关键。腹膜间皮细胞是构成腹膜的最重要的细胞群体，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用。在长期腹透中腹膜间皮细胞可因持续暴露于高糖腹透液中出现细胞肥大、胞核增多、细胞分裂停滞等表现[1，2]。我们的实验也发现同样现象。近期有学者提出间皮细胞上述改变可能与高糖对细胞周期的影响有关[2]。在本实验中我们也发现高浓度葡萄糖促使间皮细胞停滞于细胞周期的G1期，并随着葡萄糖浓度的增高而明显，而与渗透压的关系不大。但是高糖如何促使腹膜间皮细胞肥大并停滞于G1期，目前机制未明。
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目前认为细胞肥大可能是细胞受细胞内外信号刺激后进入G1期时，DNA合成被抑制同时蛋白和RNA合成增加，细胞生长停滞于G1期[9]。细胞周期抑制蛋白p21WAF1是近年分离得到的一类细胞周期调控蛋白，它能广泛抑制G1期和S期的周期素(cyclin)与细胞周期激酶(CDK)结合，使视网膜瘤蛋白(Rb)不能磷酸化，从而不能释放转录因子E2F，使G1期过度延长，细胞增殖抑制，细胞呈肥大状态。目前推测它是细胞周期G1/S期转换过程的关键[9]。已有许多研究表明p21WAF1的过度表达与细胞肥大、G1期停滞有关[3～5，9]。近期Kuan CJ等[5]研究发现高浓度葡萄糖诱导系膜细胞肥大与p21WAF1表达水平增高有关。是否高糖作用下间皮细胞的肥大和G1期停滞也与细胞内p21WAF1表达增高有关，目前国内外尚未见报道。我们用RT-PCR法检测不同浓度葡萄糖对p21WAF1 mRNA表达的影响，发现空白对照组和甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA的表达，而高浓度葡萄糖可刺激间皮细胞p21WAF1 mRNA的表达，且随着含糖浓度增高而表达增高。这初步提示高糖可刺激间皮细胞表达p21WAF1，这一作用与葡萄糖的浓度有关，而与葡萄糖产生的渗透压关系不大。本文研究结果初步提示高糖对间皮细胞增殖和形态学的改变可能与细胞周期的调控失衡有关。
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基金项目：卫生部临床重点攻关项目基金资助(97040228)
作者简介：杨琼琼(1971-)，女，福建龙岩人，在职博士生，讲师.
参考文献：
[1]Gotloib L,Wajsbrot V,Shostak A,et al.Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucose-enriched,lactated,buffered dialysis solutions[J].Nephron,1995,70(2):446.
[2]Gotloib L,Shostak A,Wajsbist V,et al.High glucose induced a hypertrophic,senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure[J].Nephron,1999,82(1):164.
, 百拇医药
[3]Shankland S J.Cell-cycle control and renal disease[J].Kid Int,1997,52(2):294.
[4]Sheikh M S,Rochefort H,Gracia M,et al.Overexpression of p21WAF1/cipl induces growth arrest,giant cell formation and apotosis in human breast carcinoma cell lines[J].Oncogene,1995,11(9):1899.
[5]Kuan C J,A1-Douahh M,Shankland S.The cyclin kinase inhibitor p21WAF1,cipl is increased in experimental diabetic nephropathy:potential role in glomerular hypertrophy[J].J Am Soc Nephrol,1998,9(3):986.
, 百拇医药
[6]Hjelle J H,Golinska B T,Waters D C,et al.Isolation and propagation in ivtro of peritoneal mesothelial cells.Perit Dial Int,1989,9(2):341.
[7]Terada Y,Yanada T,Nakashima O,et al.Angiotension-Ⅱ induced p21cip1 via JAK2-STAT1 pathway and caused hypertrophy in proximal tubular cells[J].J Am Soc Nephrol,1996,7(10):1776.
[8]Sugiyama A,Nagaki M,Shido ji Y,et al.Regulator of cell cycle-related genes in rat hepatocytes by transforming growth factor β-1[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,238(2):539.
[9]Shankland S J.Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease[J].Kid Int,1999,56(10):1208.
收稿日期：1999-12-10, 百拇医药