灯盏花素对豚鼠单一心室肌细胞Ica的抑制作用
作者：王丽娟 王勇 邱丽萍 林宇 苏富琴 李金鸣 陈咏梅
单位：王勇(齐齐哈尔 161041 北钢医院)；李金鸣(沈阳 110001 中国医科大学)；王丽娟 邱丽萍 林宇 苏富琴 陈咏梅(齐齐哈尔 161042 齐齐哈尔医学院药理教研室)
关键词：灯盏花素；膜片钳制技术；钙通道阻滞剂；钙离子电流(ICa )
中国现代应用药学000407 摘要 目的：观察灯盏花 素对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流(ICa)的影响。方法：应用全 细胞膜片钳制技术。结果：灯盏花素能明显抑制心室肌细胞的Ca2+ 通道，使ICa减小。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而 对其反转电位无明显影响。在指令电位0mV时,0.5mg%灯盏花素使ICa减小5.4%,1mg%灯 盏花素使ICa减小22.9%(P<0.01),2mg%灯盏花素使ICa减小45.0% (P<0.01)。此作用有明显的剂量依赖性和可复性。结论： ICa灯盏花素能抑制豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流ICa。
, 百拇医药
Inhibition of breviscapine to calcium current in single ventricula r cells of guinea pigs
Wang Lijuan(Wang LJ)，Wang Yong(Wang Y)，Q iu Liping(Qiu LP)，et al
(Department of Pharmacology,Qiqihaer Midi cal Colleage,Qiqihaer 161042)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the effects of breviscapine on slow inward calcium current in single ventricular cells of guinea pigs.METHODS:The whole-cell patc h clamp methods were used.RESULTS:Breviscapine decreased Ica o bviously in a way of concentration and voltage-dependent mode,but had little ef fect on reversal potential.Breviscapine with the concentration of 0.5,1 and 2mg% decreased Ica by 5.4%,22.9% and 45.0%,respectively.CONCLUSION:Breviscapine blocked Ica.
, 百拇医药
KEY WORDS breviscapine patch clam p technique,calcium channel blockers,calcium current ICa
灯盏花素系菊科植物灯盏细辛(Eriger on breviscapus)提取的灯盏甲素、乙素的混合物，主要含有灯盏乙素。具有扩张血管、降 低血液粘滞度、改善微循环、防治血栓形成的作用，临床用于治疗缺血性脑血管病、高粘滞 血症、视网膜静脉阻塞等，疗效较好[1～3]。治疗冠心病心绞痛也取得了满意的疗 效[4]。治疗冠心病心绞痛的机制除与血管扩张有关，是否还有其他的影响因素尚 缺乏资料报道，本文应用全细胞膜片钳制技术观察了灯盏花素对豚鼠单一心室肌细胞钙离子 通道的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞分离
, 百拇医药
豚鼠 ，体重(339±29)g,雌雄兼用。用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后开胸，在人工呼吸机辅助下行 主动脉插管，迅速取出心脏，置于langandoff灌流装置上，在37℃恒温及供氧条件下，先用 普通台氏液及无钙台氏液分别灌流5min,然后换成含胶原酶(YaKult,japan,4mg/40ml)的无钙 台氏液循环灌流10～20min,再用KB液冲洗终止消化。取下心脏，剪碎心室肌并稍加振荡，经 滤过、离心、弃去上清液，便制得单一心室肌细胞，将制得的心肌细胞置于KB液中保存备用 。
1.2 溶液及药品
台氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,CaCl2 1.8 ,MgCl2 0.5,NaH2PO4 0.25,HEPES 5,Glucose 5,NaOH 24.4。无钙台氏液是将台氏液 中的CaCl2去除配制而成。KB液的组成(mmol/L):KOH 70,L-Glutamic Acid 50,KCl 40,Ta urine 20,KH2PO4 20,MgCl2 3,Glucose 10,HEPES 10,GEDTA 0.5。细胞内液组成(mmo l/L):K-asp 49.89,KCl 30.07,KH2PO4 25,HEPES 20.12,GEDTA 0.999,KOH 29.95,MgCl 2 1,CaCl2 0.2,ATP-Na2 6.8。含Cs+台氏液：加CsCl于台氏液中，使其浓度为3mm ol/L。灯盏花素(批号:971204,大连弘丰制药厂)，浓度0.25%。
, 百拇医药
1.3 ICa记录
采用全细胞方式膜片钳制方法记录ICa。 用含3mmol/L CsCl的台氏液进行灌流，将心肌细胞放于浴槽内，静止10min后用尖端直径2～ 3μm的膜片电极进行千兆封接，并形成全细胞记录方式，用CEZ-2200膜片钳放大器使保持 电位为-30mV,用SEN-7103电子刺激器使刺激时间为300ms,刺激间隔6s;用S-8300步阶脉冲 发生器使指令电位为-20mV～+60mV,间隔10mV。观察并用PLG-6201连续摄影机摄影记录，数 据以x±s表示，通过t检验比较给药前后ICa变化的显著性。
2 结 果
2.1 灯盏花素对ICa的电压依赖性作用
在上述条件下引出一慢内向离子电流，此电流可被Nifedipine所阻断，证明其为IC a。实验中以Cs+阻断Ik,观察到ICa在-20mV时已经被激活，在0mV时达最大值， 通过Ⅰ～Ⅴ关系曲线可以看出,ICa随着指令电位的变化而发生规律性的变化，其反转 电位大约为+60mV。在各指令电压下，不同浓度的灯盏花素均能明显地减小ICa，在峰 电流电压下此作用最明显，但对其反转电位无明显影响(图1)。
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2.2 灯盏花素对ICa作用的浓度依赖关系
灯盏花素对ICa 的作用具有明显的浓度依赖关系。在指令电压0mV时,0.5mg%的灯盏花素即使ICa减小5 .4%(1.3～1.23nA,n=2),1mg%的灯盏花素使ICa减小22.9%[(1.09±0.33 )nA至(0.84±0.31)nA,P<0.01,n=4],2mg%的灯盏花素使ICa减小4 5.0%[(1.09±0.33)nA至(0.60±0.19)nA,P<0.01,n=4](图2)。
图1 灯盏花素对钙离子电流的影响
, http://www.100md.com A～C-给药前，0.5mg%和2mg%灯盏花素灌流期间的电流轨迹；D-Ⅰ～Ⅴ关系曲线； 1-给药前；2-0.5mg%灯盏花素；3-2mg%灯盏花素
图2 灯盏花素与标准化ICa间的浓度-效应关系
.-平均值；Ⅰ标准差，括号内的数字为实验例数
2.3 灯盏花素对ICa作用的可复性
灯盏花素抑制Ca2+内流 的作用是可逆的,2mg%的灯盏花素作用5min后,ICa由(1.17±0.25)nA减小至(0.62±0. 18)nA，经普通台氏液冲洗10min,ICa增至(1.03±0.21)nA(n=3),恢 复至接近给药前的水平，图3为其中的1例。
, 百拇医药
图3 灯盏花素减小ICa作用的可复性
保持电位-30mV,指令电位0mV;a-给药前;b-2mg%灯盏花素作用3min;c-冲洗后10min
3 讨 论
文献报道，钙拮抗剂以电压 依赖的方式作用于ICa[5,6]。本实验结果表明：灯盏花素在不同的指令电压 下对ICa的阻断作用不同，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响 ；此作用是可逆的，且具有明显的剂量(浓度)依赖性。
灯盏花素能阻断心肌细胞的Ca 2+通道，减少Ca2+内流，可使心肌收缩力减弱，心脏作功减小，心肌耗氧量减少， 故可制止冠心病心绞痛发作。另外，在心室肌等快反应细胞，钙离子(Ca2+)内流发生 在动作电位复极化的2期。Ca2+内流增多将使心肌细胞的自律性提高，后除极及触发 活动增多，ERP缩短，折返激动形成，从而诱发心律失常。灯盏花素以电压依赖的方式阻断 心肌细胞膜上的钙离子通道，使Ca2+内流减少，从而可以使心肌细胞①后除极及触发 活动减少；②复极后的膜电位负值变大而远离阈电位，使心肌细胞的自律性降低；③ERP延长，减少折返激动，从而可能产生抗心律失常作用。有关灯盏花素的其他作 用及确切机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
致谢：本研究的实验部分系在中国医 科大学药理教研室完成的，张沈丽、赵青给予了大力协作，在此表示衷心的感谢。
参考文献
[1]陈新谦，金有豫主编.新编药物学.第14版.北京：人民卫 生出版社，1997∶277.
[2]徐庆有，李学信.灯盏细辛注射液对高粘滞血症病人血液 粘度的影响.新药与临床，1995，14(4)∶233.
[3]沈金麟.灯盏花素治疗视网膜静脉阻塞.上海医学，1995 ，18(12)∶736.
[4]徐济民，郑慧君，夏翔，等.灯盏花素片治疗冠心病心绞 痛的疗效.中国新药杂志，1993，2(5)∶46.
[5]江明性.钙拮抗药.见：江明性主编.药理学.第4版.北京 ：人民卫生出版社，1996∶140.
[6]Ehara T,Kaufmann R.The voltage and time dependent effects of (-)-verapamil on the slow inward current in isolated cat ventricula r myocardium.J Pharmcol Exp Ther,1978,207∶49.
收稿日期：1999-07-12, http://www.100md.com
单位：王勇(齐齐哈尔 161041 北钢医院)；李金鸣(沈阳 110001 中国医科大学)；王丽娟 邱丽萍 林宇 苏富琴 陈咏梅(齐齐哈尔 161042 齐齐哈尔医学院药理教研室)
关键词：灯盏花素；膜片钳制技术；钙通道阻滞剂；钙离子电流(ICa )
中国现代应用药学000407 摘要 目的：观察灯盏花 素对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流(ICa)的影响。方法：应用全 细胞膜片钳制技术。结果：灯盏花素能明显抑制心室肌细胞的Ca2+ 通道，使ICa减小。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而 对其反转电位无明显影响。在指令电位0mV时,0.5mg%灯盏花素使ICa减小5.4%,1mg%灯 盏花素使ICa减小22.9%(P<0.01),2mg%灯盏花素使ICa减小45.0% (P<0.01)。此作用有明显的剂量依赖性和可复性。结论： ICa灯盏花素能抑制豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流ICa。
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Inhibition of breviscapine to calcium current in single ventricula r cells of guinea pigs
Wang Lijuan(Wang LJ)，Wang Yong(Wang Y)，Q iu Liping(Qiu LP)，et al
(Department of Pharmacology,Qiqihaer Midi cal Colleage,Qiqihaer 161042)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the effects of breviscapine on slow inward calcium current in single ventricular cells of guinea pigs.METHODS:The whole-cell patc h clamp methods were used.RESULTS:Breviscapine decreased Ica o bviously in a way of concentration and voltage-dependent mode,but had little ef fect on reversal potential.Breviscapine with the concentration of 0.5,1 and 2mg% decreased Ica by 5.4%,22.9% and 45.0%,respectively.CONCLUSION:Breviscapine blocked Ica.
, 百拇医药
KEY WORDS breviscapine patch clam p technique,calcium channel blockers,calcium current ICa
灯盏花素系菊科植物灯盏细辛(Eriger on breviscapus)提取的灯盏甲素、乙素的混合物，主要含有灯盏乙素。具有扩张血管、降 低血液粘滞度、改善微循环、防治血栓形成的作用，临床用于治疗缺血性脑血管病、高粘滞 血症、视网膜静脉阻塞等，疗效较好[1～3]。治疗冠心病心绞痛也取得了满意的疗 效[4]。治疗冠心病心绞痛的机制除与血管扩张有关，是否还有其他的影响因素尚 缺乏资料报道，本文应用全细胞膜片钳制技术观察了灯盏花素对豚鼠单一心室肌细胞钙离子 通道的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞分离
, 百拇医药
豚鼠 ，体重(339±29)g,雌雄兼用。用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后开胸，在人工呼吸机辅助下行 主动脉插管，迅速取出心脏，置于langandoff灌流装置上，在37℃恒温及供氧条件下，先用 普通台氏液及无钙台氏液分别灌流5min,然后换成含胶原酶(YaKult,japan,4mg/40ml)的无钙 台氏液循环灌流10～20min,再用KB液冲洗终止消化。取下心脏，剪碎心室肌并稍加振荡，经 滤过、离心、弃去上清液，便制得单一心室肌细胞，将制得的心肌细胞置于KB液中保存备用 。
1.2 溶液及药品
台氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,CaCl2 1.8 ,MgCl2 0.5,NaH2PO4 0.25,HEPES 5,Glucose 5,NaOH 24.4。无钙台氏液是将台氏液 中的CaCl2去除配制而成。KB液的组成(mmol/L):KOH 70,L-Glutamic Acid 50,KCl 40,Ta urine 20,KH2PO4 20,MgCl2 3,Glucose 10,HEPES 10,GEDTA 0.5。细胞内液组成(mmo l/L):K-asp 49.89,KCl 30.07,KH2PO4 25,HEPES 20.12,GEDTA 0.999,KOH 29.95,MgCl 2 1,CaCl2 0.2,ATP-Na2 6.8。含Cs+台氏液：加CsCl于台氏液中，使其浓度为3mm ol/L。灯盏花素(批号:971204,大连弘丰制药厂)，浓度0.25%。
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1.3 ICa记录
采用全细胞方式膜片钳制方法记录ICa。 用含3mmol/L CsCl的台氏液进行灌流，将心肌细胞放于浴槽内，静止10min后用尖端直径2～ 3μm的膜片电极进行千兆封接，并形成全细胞记录方式，用CEZ-2200膜片钳放大器使保持 电位为-30mV,用SEN-7103电子刺激器使刺激时间为300ms,刺激间隔6s;用S-8300步阶脉冲 发生器使指令电位为-20mV～+60mV,间隔10mV。观察并用PLG-6201连续摄影机摄影记录，数 据以x±s表示，通过t检验比较给药前后ICa变化的显著性。
2 结 果
2.1 灯盏花素对ICa的电压依赖性作用
在上述条件下引出一慢内向离子电流，此电流可被Nifedipine所阻断，证明其为IC a。实验中以Cs+阻断Ik,观察到ICa在-20mV时已经被激活，在0mV时达最大值， 通过Ⅰ～Ⅴ关系曲线可以看出,ICa随着指令电位的变化而发生规律性的变化，其反转 电位大约为+60mV。在各指令电压下，不同浓度的灯盏花素均能明显地减小ICa，在峰 电流电压下此作用最明显，但对其反转电位无明显影响(图1)。
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2.2 灯盏花素对ICa作用的浓度依赖关系
灯盏花素对ICa 的作用具有明显的浓度依赖关系。在指令电压0mV时,0.5mg%的灯盏花素即使ICa减小5 .4%(1.3～1.23nA,n=2),1mg%的灯盏花素使ICa减小22.9%[(1.09±0.33 )nA至(0.84±0.31)nA,P<0.01,n=4],2mg%的灯盏花素使ICa减小4 5.0%[(1.09±0.33)nA至(0.60±0.19)nA,P<0.01,n=4](图2)。
图1 灯盏花素对钙离子电流的影响
, http://www.100md.com A～C-给药前，0.5mg%和2mg%灯盏花素灌流期间的电流轨迹；D-Ⅰ～Ⅴ关系曲线； 1-给药前；2-0.5mg%灯盏花素；3-2mg%灯盏花素
图2 灯盏花素与标准化ICa间的浓度-效应关系
.-平均值；Ⅰ标准差，括号内的数字为实验例数
2.3 灯盏花素对ICa作用的可复性
灯盏花素抑制Ca2+内流 的作用是可逆的,2mg%的灯盏花素作用5min后,ICa由(1.17±0.25)nA减小至(0.62±0. 18)nA，经普通台氏液冲洗10min,ICa增至(1.03±0.21)nA(n=3),恢 复至接近给药前的水平，图3为其中的1例。
, 百拇医药
图3 灯盏花素减小ICa作用的可复性
保持电位-30mV,指令电位0mV;a-给药前;b-2mg%灯盏花素作用3min;c-冲洗后10min
3 讨 论
文献报道，钙拮抗剂以电压 依赖的方式作用于ICa[5,6]。本实验结果表明：灯盏花素在不同的指令电压 下对ICa的阻断作用不同，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响 ；此作用是可逆的，且具有明显的剂量(浓度)依赖性。
灯盏花素能阻断心肌细胞的Ca 2+通道，减少Ca2+内流，可使心肌收缩力减弱，心脏作功减小，心肌耗氧量减少， 故可制止冠心病心绞痛发作。另外，在心室肌等快反应细胞，钙离子(Ca2+)内流发生 在动作电位复极化的2期。Ca2+内流增多将使心肌细胞的自律性提高，后除极及触发 活动增多，ERP缩短，折返激动形成，从而诱发心律失常。灯盏花素以电压依赖的方式阻断 心肌细胞膜上的钙离子通道，使Ca2+内流减少，从而可以使心肌细胞①后除极及触发 活动减少；②复极后的膜电位负值变大而远离阈电位，使心肌细胞的自律性降低；③ERP延长，减少折返激动，从而可能产生抗心律失常作用。有关灯盏花素的其他作 用及确切机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
致谢：本研究的实验部分系在中国医 科大学药理教研室完成的，张沈丽、赵青给予了大力协作，在此表示衷心的感谢。
参考文献
[1]陈新谦，金有豫主编.新编药物学.第14版.北京：人民卫 生出版社，1997∶277.
[2]徐庆有，李学信.灯盏细辛注射液对高粘滞血症病人血液 粘度的影响.新药与临床，1995，14(4)∶233.
[3]沈金麟.灯盏花素治疗视网膜静脉阻塞.上海医学，1995 ，18(12)∶736.
[4]徐济民，郑慧君，夏翔，等.灯盏花素片治疗冠心病心绞 痛的疗效.中国新药杂志，1993，2(5)∶46.
[5]江明性.钙拮抗药.见：江明性主编.药理学.第4版.北京 ：人民卫生出版社，1996∶140.
[6]Ehara T,Kaufmann R.The voltage and time dependent effects of (-)-verapamil on the slow inward current in isolated cat ventricula r myocardium.J Pharmcol Exp Ther,1978,207∶49.
收稿日期：1999-07-12, http://www.100md.com