表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定
作者：邓安梅 仲人前 孔宪涛
单位：邓安梅(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)；仲人前(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)；孔宪涛(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)
关键词：SSA/Ro60抗原；cDNA克隆；重组体
中国免疫学杂志000312 摘 要：目的：构建表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体，为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法：采用逆转录-PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro60 cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并经酶切电泳，DNA测序鉴定分析。结果：经鉴定，证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体。结论：SSA/Ro60表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro60的大量生产并用于诊断。
中国图书分类号：R392.11
, 百拇医药
Construction of recombinant expressing autoantigen SSA/Ro60
DENG An-Mei ZHONG Ren-Qian KONG Xian-Tao
(Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003)
Abstract：Objective:In view of constructing recombinant expressing plasmid of autoantigen SSA/Ro.Methods:The SSA/Ro60 cDNA was cloned by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-2T.Results:The recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Conclusion:The recombinant expressing plasmid of autoantigen SSA/Ro is useful for diagnosi.
, 百拇医药
Key words：SSA/Ro autoantigen Recombinant cDNA clone
系统性自身免疫病的特征之一是循环中出现一些抗核蛋白的自身抗体。多数自身抗体，除抗DNA抗体外，在自身免疫病的病理机制中并无直接作用。然而，特异性自身抗体与相应的自身免疫病病情高度相关。探讨自身免疫病中的抗原抗体作用有助于我们了解自身免疫病的发病机制，为疾病的早期诊断及治疗打下基础。
自身抗原SSA/Ro60可与干燥综合征(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫疾病患者的血清反应[1]，但其抗原表位精确定位、表位与疾病相关性的分析等方面尚存在分歧[2，3]。本课题旨在构建表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体，进一步在大肠杆菌中表达重组抗原，为深入研究疾病的发病机制奠定了基础。
1 材料与方法
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1. 1 材料
1.1.1 质粒、菌株、酶及所用试剂 PGEX-2T质粒；JM109菌株(本中心保存)；AMV逆转录酶；Taq DNA多聚酶、EcoRI内切酶、BamHI 内切酶、T4 DNA连接酶 (Pharmacia)。
1. 2 用逆转录-PCR方法克隆SSA/Ro60的cDNA
1.2.1 PCR引物的设计与合成 检索EMBL库，根据引物设计的主要标准设计用于特异性扩增SSA/Ro60的一对引物。引物交中国科学院细胞研究所合成、纯化[4]。5'端引物为：
5’AAGGGATCCATGGAGGAATCTGTAAACCAA 3’，BamHI
3'端引物为：
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5’AAAGAATTCTCAAATGATTTATTTAGT 3’。
EcoRI
1.2.2 Hela细胞培养及其RNA的抽提 参照异硫氰酸胍酸法进行[5]。
1.2.3 逆转录反应 取细胞总RNA 10 mg，3'端引物0.8 μmol/L(终浓度，以下同)，70℃加热5 min，然后依次加入RNasin 20 μl，4种dNTP各1 mmol/L，AMV逆转录酶25 μl以及逆转录反应缓冲液，总体积25 μl，42℃保温1 h。
1.2.4 PCR扩增cDNA PCR反应体系：在上述逆转录反应产物25 μl中加入MgSO4 6 mmol/L，4种dNTP各200 mmol/L，5'端引物0.2 μmol/L以及Taq DNA聚合酶缓冲液，混匀后100℃加热5 min。冷却至72℃加入Taq DNA聚合酶2U。PCR热循环条件：变性94℃持续30 s，退火65℃持续30 s，延伸72℃持续2 min，共计30个循环；最后在72℃中延伸10 min。扩增产物经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳检测。
, 百拇医药
1.2.5 PCR产物酶切及回收 将PCR产物24 μl用BamHI内切酶进行单酶切，37℃2 h。加入EcoRI内切酶进行酶切37℃2 h。将经2次酶切产物经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，并用胶抽提试剂盒回收、纯化。
1.3 SSA/Ro60重组体的构建与鉴定
1.3.1 SSA/Ro60重组体的构建 用BamHI和EcoRI内切酶双酶切表达载体PGEX-2T(同1.2.5),并将上述SSA/Ro60 cDNA和PGEX-2T酶切回收产物经T4DNA连接酶作用，连接反应于室温过夜。
将上述连接产物9 μl用CaCl2法转导入JM109 菌株中。并涂布于Amp平板,37℃孵育过夜。
1.3.2 重组质粒的鉴定 挑取Amp平板上菌落于5 ml LB/Amp体液培养基中，37℃振摇过夜，次日提取质粒，并进行溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，以PGEX-2T质粒为对照，挑取重组克隆。
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将重组克隆的质粒用BamHI和EcoRI内酶切双酶切，并经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，鉴定出能切出1.58 kb酶切小片段的重组克隆。
1.3.3 DNA测序 将上述所选克隆用Taq酶Sanger双脱氧链末端终止法测序[5]。
2 结果
2.1 SSA/Ro60 cDNA的克隆 逆转录-PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约为1.58 kb的位置可见清晰的特异性扩增条带(图1)。
图1 SSA/Ro60重组克隆DNA电泳图
Fig.1 SSA/Ro60 recombinant DNA
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Note: 1.DNA marker;2. restriction map of the recombinant;3. vector PGEX-2T； 4.PCR product
2.2 酶切法和PCR法鉴定重组质粒 本研究用酶切法和PCR法证实载体PGEX-2T中含有以正确方向嵌入，符合预期长度的目的基因SSA/Ro60 cDNA(图1)。
2.3 DNA序列测定 DNA测序结果表明该克隆为SSA/Ro60 cDNA，与EMBL库中检索到的一致。
3 讨论
本课题在对靶基因(SSA/Ro60的核苷酸序列)进行cDNA克隆中，采取逆转录-PCR这一简捷有效途径代替以往用自身抗体或合成寡核苷酸探针筛选cDNA文章的较繁琐的经典基因克隆[5]。
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设计引物时采用计算机软件进行辅助分析，选择了SSA/Ro60 cDNA中没有的，而表达载体PGEX-2T内有的单个酶切位点EcoRI和BamHI,利用双酶切位点将SSA/Ro60 cDNA定向插入PGEA-2T，避免了DNA插入的反向或串联、自联等问题。
选用PGEX-2T作为表达载体，其优点是：将目的基因与PGEX-2T定向克隆并导入大肠杆菌表达，可产生GST和Ro60的融合蛋白，分离纯化简便，可用谷胱甘肽亲合层析柱分离融合蛋白；而在GST和Ro60之间有凝血酶酶切位点，在体外可切除GST而得到Ro60抗原，可用于抗原表位研究，消除GST对Ro60抗原性检测的干扰。而细菌蛋白酶对重组抗原降解减少，因而表达产量较高。
据报道，重组SSA/Ro60抗原能特异识别病人抗血清，因而可用重组抗原作检测以辅助诊断，也可分析其片段的抗原性以了解其抗原表位。
下一步，我们将对构建的重组体诱导表达蛋白，并对其理化性质和生物学活性进行鉴定。我们希望通过对SSA/Ro60重组抗原的精确定位分析，从分子免疫学角度为某些自身免疫病的诊断和鉴别诊断提供依据；为制备重组抗原用于临床检测奠定基础。
, 百拇医药
作者简介：邓安梅，女，27岁，博士生，主要研究临床免疫学；
仲人前，男，34岁，博士，副研究员，主要研究临床免疫学；
孔宪涛，男，64岁，教授，主要研究临床免疫学
参考文献：
[1]Buyon J P. Neonatal Lupus:Bedside to bench and back.Scand J Rheumatol，1996;25(5):271
[2]Wahren M,Mellquist E,Vene S et al. Nuclear colocalization of the Ro 60 kDa autoantigen and a subset of U snRNP domains. Eur J Cell Biol，1996;70(3):189
, http://www.100md.com
[3]Routsias J G, Sakarellos D M, Tsikaris V et al. Structure, molecular and immunological properties of linear B-cell epitopes of Ro60 kD autoantigen. Scand J Immunol，1998; 47(3):280
[4]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993: 412-413
[5]金冬雁，黎孟枫，侯云德 et al译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1995: 629-640
收稿日期：1998-09-12
修改日期：1999-11-02, 百拇医药
单位：邓安梅(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)；仲人前(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)；孔宪涛(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)
关键词：SSA/Ro60抗原；cDNA克隆；重组体
中国免疫学杂志000312 摘 要：目的：构建表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体，为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法：采用逆转录-PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro60 cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并经酶切电泳，DNA测序鉴定分析。结果：经鉴定，证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体。结论：SSA/Ro60表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro60的大量生产并用于诊断。
中国图书分类号：R392.11
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Construction of recombinant expressing autoantigen SSA/Ro60
DENG An-Mei ZHONG Ren-Qian KONG Xian-Tao
(Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003)
Abstract：Objective:In view of constructing recombinant expressing plasmid of autoantigen SSA/Ro.Methods:The SSA/Ro60 cDNA was cloned by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-2T.Results:The recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Conclusion:The recombinant expressing plasmid of autoantigen SSA/Ro is useful for diagnosi.
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Key words：SSA/Ro autoantigen Recombinant cDNA clone
系统性自身免疫病的特征之一是循环中出现一些抗核蛋白的自身抗体。多数自身抗体，除抗DNA抗体外，在自身免疫病的病理机制中并无直接作用。然而，特异性自身抗体与相应的自身免疫病病情高度相关。探讨自身免疫病中的抗原抗体作用有助于我们了解自身免疫病的发病机制，为疾病的早期诊断及治疗打下基础。
自身抗原SSA/Ro60可与干燥综合征(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫疾病患者的血清反应[1]，但其抗原表位精确定位、表位与疾病相关性的分析等方面尚存在分歧[2，3]。本课题旨在构建表达人自身抗原SSA/Ro60的重组体，进一步在大肠杆菌中表达重组抗原，为深入研究疾病的发病机制奠定了基础。
1 材料与方法
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1. 1 材料
1.1.1 质粒、菌株、酶及所用试剂 PGEX-2T质粒；JM109菌株(本中心保存)；AMV逆转录酶；Taq DNA多聚酶、EcoRI内切酶、BamHI 内切酶、T4 DNA连接酶 (Pharmacia)。
1. 2 用逆转录-PCR方法克隆SSA/Ro60的cDNA
1.2.1 PCR引物的设计与合成 检索EMBL库，根据引物设计的主要标准设计用于特异性扩增SSA/Ro60的一对引物。引物交中国科学院细胞研究所合成、纯化[4]。5'端引物为：
5’AAGGGATCCATGGAGGAATCTGTAAACCAA 3’，BamHI
3'端引物为：
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5’AAAGAATTCTCAAATGATTTATTTAGT 3’。
EcoRI
1.2.2 Hela细胞培养及其RNA的抽提 参照异硫氰酸胍酸法进行[5]。
1.2.3 逆转录反应 取细胞总RNA 10 mg，3'端引物0.8 μmol/L(终浓度，以下同)，70℃加热5 min，然后依次加入RNasin 20 μl，4种dNTP各1 mmol/L，AMV逆转录酶25 μl以及逆转录反应缓冲液，总体积25 μl，42℃保温1 h。
1.2.4 PCR扩增cDNA PCR反应体系：在上述逆转录反应产物25 μl中加入MgSO4 6 mmol/L，4种dNTP各200 mmol/L，5'端引物0.2 μmol/L以及Taq DNA聚合酶缓冲液，混匀后100℃加热5 min。冷却至72℃加入Taq DNA聚合酶2U。PCR热循环条件：变性94℃持续30 s，退火65℃持续30 s，延伸72℃持续2 min，共计30个循环；最后在72℃中延伸10 min。扩增产物经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳检测。
, 百拇医药
1.2.5 PCR产物酶切及回收 将PCR产物24 μl用BamHI内切酶进行单酶切，37℃2 h。加入EcoRI内切酶进行酶切37℃2 h。将经2次酶切产物经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，并用胶抽提试剂盒回收、纯化。
1.3 SSA/Ro60重组体的构建与鉴定
1.3.1 SSA/Ro60重组体的构建 用BamHI和EcoRI内切酶双酶切表达载体PGEX-2T(同1.2.5),并将上述SSA/Ro60 cDNA和PGEX-2T酶切回收产物经T4DNA连接酶作用，连接反应于室温过夜。
将上述连接产物9 μl用CaCl2法转导入JM109 菌株中。并涂布于Amp平板,37℃孵育过夜。
1.3.2 重组质粒的鉴定 挑取Amp平板上菌落于5 ml LB/Amp体液培养基中，37℃振摇过夜，次日提取质粒，并进行溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，以PGEX-2T质粒为对照，挑取重组克隆。
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将重组克隆的质粒用BamHI和EcoRI内酶切双酶切，并经溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳，鉴定出能切出1.58 kb酶切小片段的重组克隆。
1.3.3 DNA测序 将上述所选克隆用Taq酶Sanger双脱氧链末端终止法测序[5]。
2 结果
2.1 SSA/Ro60 cDNA的克隆 逆转录-PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约为1.58 kb的位置可见清晰的特异性扩增条带(图1)。
图1 SSA/Ro60重组克隆DNA电泳图
Fig.1 SSA/Ro60 recombinant DNA
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Note: 1.DNA marker;2. restriction map of the recombinant;3. vector PGEX-2T； 4.PCR product
2.2 酶切法和PCR法鉴定重组质粒 本研究用酶切法和PCR法证实载体PGEX-2T中含有以正确方向嵌入，符合预期长度的目的基因SSA/Ro60 cDNA(图1)。
2.3 DNA序列测定 DNA测序结果表明该克隆为SSA/Ro60 cDNA，与EMBL库中检索到的一致。
3 讨论
本课题在对靶基因(SSA/Ro60的核苷酸序列)进行cDNA克隆中，采取逆转录-PCR这一简捷有效途径代替以往用自身抗体或合成寡核苷酸探针筛选cDNA文章的较繁琐的经典基因克隆[5]。
, http://www.100md.com
设计引物时采用计算机软件进行辅助分析，选择了SSA/Ro60 cDNA中没有的，而表达载体PGEX-2T内有的单个酶切位点EcoRI和BamHI,利用双酶切位点将SSA/Ro60 cDNA定向插入PGEA-2T，避免了DNA插入的反向或串联、自联等问题。
选用PGEX-2T作为表达载体，其优点是：将目的基因与PGEX-2T定向克隆并导入大肠杆菌表达，可产生GST和Ro60的融合蛋白，分离纯化简便，可用谷胱甘肽亲合层析柱分离融合蛋白；而在GST和Ro60之间有凝血酶酶切位点，在体外可切除GST而得到Ro60抗原，可用于抗原表位研究，消除GST对Ro60抗原性检测的干扰。而细菌蛋白酶对重组抗原降解减少，因而表达产量较高。
据报道，重组SSA/Ro60抗原能特异识别病人抗血清，因而可用重组抗原作检测以辅助诊断，也可分析其片段的抗原性以了解其抗原表位。
下一步，我们将对构建的重组体诱导表达蛋白，并对其理化性质和生物学活性进行鉴定。我们希望通过对SSA/Ro60重组抗原的精确定位分析，从分子免疫学角度为某些自身免疫病的诊断和鉴别诊断提供依据；为制备重组抗原用于临床检测奠定基础。
, 百拇医药
作者简介：邓安梅，女，27岁，博士生，主要研究临床免疫学；
仲人前，男，34岁，博士，副研究员，主要研究临床免疫学；
孔宪涛，男，64岁，教授，主要研究临床免疫学
参考文献：
[1]Buyon J P. Neonatal Lupus:Bedside to bench and back.Scand J Rheumatol，1996;25(5):271
[2]Wahren M,Mellquist E,Vene S et al. Nuclear colocalization of the Ro 60 kDa autoantigen and a subset of U snRNP domains. Eur J Cell Biol，1996;70(3):189
, http://www.100md.com
[3]Routsias J G, Sakarellos D M, Tsikaris V et al. Structure, molecular and immunological properties of linear B-cell epitopes of Ro60 kD autoantigen. Scand J Immunol，1998; 47(3):280
[4]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993: 412-413
[5]金冬雁，黎孟枫，侯云德 et al译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1995: 629-640
收稿日期：1998-09-12
修改日期：1999-11-02, 百拇医药