不同产地丹参中3种丹参酮含量变异
作者：李力 娄子洋 陈万生 张卫东 乔传卓
单位：李力(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；娄子洋(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；陈万生(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；张卫东(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；乔传卓(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)
关键词：丹参；丹参酮；色谱法，高效液相
第二军医大学学报000816[摘要] 目的：考察不同产地丹参种内3种丹参酮含量变异。方法：采用超声提取结合HPLC法对全国8个主产地的丹参脂溶性部分中丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ进行了含量测定。结果：3种丹参酮含量范围分别为：丹参酮ⅡA 0.10%～0.40%、隐丹参酮0.04%～0.46%、丹参酮Ⅰ0.03%～0.15%，且隐丹参酮及丹参酮Ⅰ在药材中的含量并不完全与丹参酮ⅡA的含量呈正相关。结论：丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ含量分别以四川中江、辽宁凌源和山东平邑所产的丹参最高，以上海崇明所产的丹参上述3项指标最低。
, 百拇医药
[中图分类号] R 284 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0753-03
Contents variety of three kinds of tanshinone among intraspecies of Salvia miltiorrhiza Bunge
LI Li LOU Zi-Yang CHEN Wan-Sheng ZHANG Wei-Dong QIAO Chuan-Zhuo
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
, http://www.100md.com [ABSTRACT] Objective: To investigate the content variety of 3 kinds of tanshinone among intraspecies of Salvia miltiorrhiza Bunge. Methods: HPLC method was applied to measure the liposoluble contents of Salvia miltiorrhiza Bunge. Results: The contents of tanshinone ⅡA, cryptotanshinone and tanshinone Ⅰ ranged from 0.10%-0.40%, 0.04%-0.46% and 0.03%-0.15%, respectively. The contents of these 3 components were not always in positive correlation. Conclusion: The highest contents of tanshinone ⅡA, cryptotanshinone and tanshinone Ⅰ are the products of Zhongjiang Sichuan, Lingyuan Liaoning and Pingyi Shandong. The sample of Chongming Shanghai has the lowest content of these 3 ingredients.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] Salvia miltiorrhiza Bunge; tanshinone; chromatography, high performance liquid
丹参系唇形科鼠尾草属植物(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根，为常用的活血化瘀中药，其性微寒、味苦、无毒，有活血通经、凉血消肿、除烦清心之功效。《本草纲目》上有丹参治“恶疮疥癣，瘿敖肿毒丹毒，排脓止痛，生长肌肉”等记载[1]。现代研究表明，此作用在于丹参脂溶性部分的抗菌活性[2]。近年来已有以丹参酮为主要原料的外用和内服制剂治疗临床感染性疾病[3]。为控制药材质量，阐明不同产地丹参化学成分含量的差异，本研究采用超声提取结合HPLC法同时测定丹参中3种丹参酮的含量。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 美国Waters高效液相色谱仪，包括510泵，2487检测器，Rheodyne7725i进样阀，CDMC-4A数据处理机(上海计算技术研究所), Branson1200超声清洗器。甲醇为分析纯，隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ对照品购自中国药品生物制品检定所。丹参药材分别实地采自辽宁、河北、山东、河南、陕西、四川、安徽和上海，60℃干燥12 h，粉碎，过60目筛。
, 百拇医药
1.2 色谱条件 色谱柱：YWG C18(250 mm×4.5 mm，10 μm，大连依利特公司)；流动相：甲醇∶水(78∶22)，流速：1.0 ml/min; 灵敏度：0.1 AUFS；检测波长: 254 nm; 进样量：20 μl。数据处理方法为外标峰面积测定法。
1.3 样品液制备 精密称取各产地药材粉末3份，每份约100 mg，分别加入10 ml溶剂(氯仿∶乙醇1∶1),超声提取20 min, 2 000 r/min离心5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，取5 ml，用甲醇定容至25 ml的量瓶中待测。
1.4 样品测定 分别吸取对照品溶液和样品溶液，依上述色谱条件测定，用外标峰面积测定法计算药材中3种丹参酮的含量。
2 结 果
2.1 流动相比例的选择 选择甲醇-水为流动相，以待测液为样品，考察流动相中甲醇含量对丹参酮 ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的保留时间、色谱峰形及分离度的影响。结果表明，随甲醇含量的增高，上述3个化合物的出峰时间缩短，但与杂质峰的分离度下降。综合考虑三方面因素，选择甲醇∶水(78∶22)为最适流动相配比。此时色谱峰分离良好(图1)，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的出峰时间分别为13，18和22 min。
, 百拇医药
图 1 标准品(A)和样品(B)的HPLC色谱图
Fig 1 HPLC chromatogram of standard(A) and sample(B)
a: Cryptotanshinone； b: TanshinoneⅠ； c: Tanshinone ⅡA
2.2 线性关系考察 精密称取丹参酮 ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ各10 mg，用二氯甲烷溶解，用流动相稀释成20.00，10.00，2.00，1.00，0.50，0.25 μg/ml梯度溶液。取20 μl进样，以丹参酮的量(X)与峰面积值(Y)进行线性回归，得标准曲线方程，(1)丹参酮ⅡA：Y=-220.74+645.6 X， r=0.999，线性范围为5.75～460 ng；(2)隐丹参酮：Y=1 086.79+548.04 X， r=0.999，线性范围为12～384 ng；(3)丹参酮Ⅰ：Y=16.31+105.42 X，r=0.999，线性范围为5.5～88 ng。
, http://www.100md.com
2.3 精密度实验 分别取质量浓度为1.00 μg/ml的丹参酮ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ标准溶液，各重复测定5次，相对标准差分别为0.31%,0.63%, 0.48%。
2.4 稳定性实验 分别取质量浓度为1.00 μg/ml的丹参酮ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ标准溶液，于日间2，4和8 h测定，得相对标准差分别为0.32%，0.56%和0.43%。
2.5 加样回收率实验 精密称取约100 mg已知含量的丹参样品，精确加入丹参酮 ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ适量，按药材提取方法进行提取和定量分析，得丹参酮ⅡA的加样回收率为(97.25±0.67)%，隐丹参酮为(98.02±1.70)%，丹参酮Ⅰ为(95.70±1.44)%。
2.6 提取方法的考察 实验采用4个因素3个水平正交设计考察了超声提取时间、提取次数、提取溶剂量及二氯甲烷与乙醇组成比例对药材中丹参酮 ⅡA提取率的影响。方差分析结果表明，提取时间、提取次数和提取溶剂量对丹参酮ⅡA的提取量有非常显著的影响(P<0.01)，提取溶剂种类对提取结果影响不大(P>0.05)。结果分析表明，以二氯甲烷∶乙醇(1∶1)10 ml为提取溶剂,超声20 min,提取1次的提取条件最优。
, 百拇医药
2.7 药材的含量测定结果 采自全国8个原产地的丹参药材测定结果见表1，其中不同产地丹参药材中丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量差异较大，丹参酮Ⅰ的含量变异不大，隐丹参酮及丹参酮Ⅰ在药材中的含量并不完全与丹参酮ⅡA的含量呈正相关。丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ分别以四川中江、辽宁凌源和山东平邑所产丹参含量最高，以上海崇明所产丹参3项指标最低。
表 1 不同产地丹参中3种丹参酮的含量
Tab 1 Contents of 3 kinds of tanshinone in the root of
Salvia miltiorrhiza of different places
(n=3，x±s，%) Sourse of sample
Tanshinone
, 百拇医药
ⅡA
Tanshinone
Ⅰ
Cryptotanshinone
Lingyuan,Liaoning
0.23±0.01
0.07±0.01
0.46±0.02
Pingyi,Shandong
0.40±0.02
0.10±0.01
, 百拇医药 0.33±0.01
Lingbao,Henan
0.33±0.01
0.04±0.01
0.13±0.01
Bozhou,Anhui
0.15±0.01
0.04±0.01
0.06±0.01
Zhongjiang,Sichuan
0.43±0.03
, 百拇医药
0.15±0.01
0.39±0.02
Xingtang,Hebei
0.18±0.01
0.05±0.01
0.08±0.01
Pucheng,Shanxi
0.11±0.01
0.04±0.01
0.06±0.01
Chongming,Shanghai
, 百拇医药
0.10±0.01
0.03±0.01
0.04±0.01
3 讨 论
丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ是丹参的主要活性成分，应用HPLC法测定丹参中丹参酮的含量已有文献报道[4～6]，但未见应用超声提取结合HPLC法在同一条件下同时测定药材中3种成分的研究。为建立一种更为便捷的药材质量控制方法，我们参照文献[7，8]，对丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的提取、HPLC测定条件进行了优化。本研究建立的提取、测定方法，以二氯甲烷∶乙醇(1∶1) 10 ml为提取溶剂，将10 mg药材粉末超声提取20 min，3种成分提取完全且快捷。应用YWG C18色谱柱，选择甲醇∶水(78∶22)为流动相，3种成分在液相色谱图上分离度良好，回收率高。本法简便可靠，可用于丹参药材中丹参酮成分的常规提取测定。
, 百拇医药
中国药典(1995年版)规定，丹参药材的质量控制以丹参酮ⅡA的含量作为指标，不同产地丹参药材的含量测定结果显示，丹参药材中丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量差异较大，其中丹参酮ⅡA以四川、山东、河南、辽宁所产的丹参含量较高，隐丹参酮以辽宁、四川、山东所产的丹参含量较高，而丹参酮Ⅰ的含量变异不大，提示四川、山东、河南、辽宁所产的丹参质优。有文献报道[1]，丹参酮的抗菌活性主要为隐丹参酮等，而丹参酮ⅡA并无抗菌活性，我们的含量测定结果表明，丹参酮ⅡA含量并不全部与隐丹参酮的含量呈正相关，因此在以丹参抗菌活性为用药目的时，隐丹参酮的含量应为主要质量控制指标。
[作者简介] 李 力(1968-)，男(汉族)，博士生.
[参 考 文 献]
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会 主编. 中华本草[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998. 1650-1671.
, http://www.100md.com
[2] 高玉桂, 宋玉梅, 杨友义,等. 丹参酮的药理[J]. 药学学报, 1979，14(2)：75-81.
[3] 秦万章. 丹参在皮肤科中的应用[J]. 中华皮肤科杂志，1989，22(4)：283-285.
[4] 陈 幸，黎万寿，夏文娟，等.四川中江丹参与其他产地丹参化学成分的比较研究[J]. 中国中药杂志，1997，22(9)：522-524.
[5] 王 曙，孙毅毅，贾运涛. 丹参脂溶性成分提取工艺初探[J]. 华西医科大学学报，1996，27(2)：203-206.
[6] 吴剑峰，杨安平，李海燕，等. 正交试验法筛选酒炙丹参的最佳炮制条件[J].中药材， 1999，22(6)：294-295.
[7] 傅 翔，张汉明，丁如贤. 菘蓝组织培养物中靛蓝、靛玉红含量的变化[J]. 第二军医大学学报，2000，21(1)：33，37.
[8] 郭美丽，张芝玉，张汉明，等. 不同栽培居群红花各器官的组织构造和化学成分含量[J]. 第二军医大学学报，1999，20(7)：441-444.
[收稿日期] 2000-02-24
[修回日期] 2000-06-08, http://www.100md.com
单位：李力(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；娄子洋(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；陈万生(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；张卫东(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)；乔传卓(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433.)
关键词：丹参；丹参酮；色谱法，高效液相
第二军医大学学报000816[摘要] 目的：考察不同产地丹参种内3种丹参酮含量变异。方法：采用超声提取结合HPLC法对全国8个主产地的丹参脂溶性部分中丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ进行了含量测定。结果：3种丹参酮含量范围分别为：丹参酮ⅡA 0.10%～0.40%、隐丹参酮0.04%～0.46%、丹参酮Ⅰ0.03%～0.15%，且隐丹参酮及丹参酮Ⅰ在药材中的含量并不完全与丹参酮ⅡA的含量呈正相关。结论：丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ含量分别以四川中江、辽宁凌源和山东平邑所产的丹参最高，以上海崇明所产的丹参上述3项指标最低。
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[中图分类号] R 284 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0753-03
Contents variety of three kinds of tanshinone among intraspecies of Salvia miltiorrhiza Bunge
LI Li LOU Zi-Yang CHEN Wan-Sheng ZHANG Wei-Dong QIAO Chuan-Zhuo
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
, http://www.100md.com [ABSTRACT] Objective: To investigate the content variety of 3 kinds of tanshinone among intraspecies of Salvia miltiorrhiza Bunge. Methods: HPLC method was applied to measure the liposoluble contents of Salvia miltiorrhiza Bunge. Results: The contents of tanshinone ⅡA, cryptotanshinone and tanshinone Ⅰ ranged from 0.10%-0.40%, 0.04%-0.46% and 0.03%-0.15%, respectively. The contents of these 3 components were not always in positive correlation. Conclusion: The highest contents of tanshinone ⅡA, cryptotanshinone and tanshinone Ⅰ are the products of Zhongjiang Sichuan, Lingyuan Liaoning and Pingyi Shandong. The sample of Chongming Shanghai has the lowest content of these 3 ingredients.
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[KEY WORDS] Salvia miltiorrhiza Bunge; tanshinone; chromatography, high performance liquid
丹参系唇形科鼠尾草属植物(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根，为常用的活血化瘀中药，其性微寒、味苦、无毒，有活血通经、凉血消肿、除烦清心之功效。《本草纲目》上有丹参治“恶疮疥癣，瘿敖肿毒丹毒，排脓止痛，生长肌肉”等记载[1]。现代研究表明，此作用在于丹参脂溶性部分的抗菌活性[2]。近年来已有以丹参酮为主要原料的外用和内服制剂治疗临床感染性疾病[3]。为控制药材质量，阐明不同产地丹参化学成分含量的差异，本研究采用超声提取结合HPLC法同时测定丹参中3种丹参酮的含量。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 美国Waters高效液相色谱仪，包括510泵，2487检测器，Rheodyne7725i进样阀，CDMC-4A数据处理机(上海计算技术研究所), Branson1200超声清洗器。甲醇为分析纯，隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ对照品购自中国药品生物制品检定所。丹参药材分别实地采自辽宁、河北、山东、河南、陕西、四川、安徽和上海，60℃干燥12 h，粉碎，过60目筛。
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1.2 色谱条件 色谱柱：YWG C18(250 mm×4.5 mm，10 μm，大连依利特公司)；流动相：甲醇∶水(78∶22)，流速：1.0 ml/min; 灵敏度：0.1 AUFS；检测波长: 254 nm; 进样量：20 μl。数据处理方法为外标峰面积测定法。
1.3 样品液制备 精密称取各产地药材粉末3份，每份约100 mg，分别加入10 ml溶剂(氯仿∶乙醇1∶1),超声提取20 min, 2 000 r/min离心5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，取5 ml，用甲醇定容至25 ml的量瓶中待测。
1.4 样品测定 分别吸取对照品溶液和样品溶液，依上述色谱条件测定，用外标峰面积测定法计算药材中3种丹参酮的含量。
2 结 果
2.1 流动相比例的选择 选择甲醇-水为流动相，以待测液为样品，考察流动相中甲醇含量对丹参酮 ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的保留时间、色谱峰形及分离度的影响。结果表明，随甲醇含量的增高，上述3个化合物的出峰时间缩短，但与杂质峰的分离度下降。综合考虑三方面因素，选择甲醇∶水(78∶22)为最适流动相配比。此时色谱峰分离良好(图1)，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的出峰时间分别为13，18和22 min。
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图 1 标准品(A)和样品(B)的HPLC色谱图
Fig 1 HPLC chromatogram of standard(A) and sample(B)
a: Cryptotanshinone； b: TanshinoneⅠ； c: Tanshinone ⅡA
2.2 线性关系考察 精密称取丹参酮 ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ各10 mg，用二氯甲烷溶解，用流动相稀释成20.00，10.00，2.00，1.00，0.50，0.25 μg/ml梯度溶液。取20 μl进样，以丹参酮的量(X)与峰面积值(Y)进行线性回归，得标准曲线方程，(1)丹参酮ⅡA：Y=-220.74+645.6 X， r=0.999，线性范围为5.75～460 ng；(2)隐丹参酮：Y=1 086.79+548.04 X， r=0.999，线性范围为12～384 ng；(3)丹参酮Ⅰ：Y=16.31+105.42 X，r=0.999，线性范围为5.5～88 ng。
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2.3 精密度实验 分别取质量浓度为1.00 μg/ml的丹参酮ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ标准溶液，各重复测定5次，相对标准差分别为0.31%,0.63%, 0.48%。
2.4 稳定性实验 分别取质量浓度为1.00 μg/ml的丹参酮ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ标准溶液，于日间2，4和8 h测定，得相对标准差分别为0.32%，0.56%和0.43%。
2.5 加样回收率实验 精密称取约100 mg已知含量的丹参样品，精确加入丹参酮 ⅡA，隐丹参酮和丹参酮Ⅰ适量，按药材提取方法进行提取和定量分析，得丹参酮ⅡA的加样回收率为(97.25±0.67)%，隐丹参酮为(98.02±1.70)%，丹参酮Ⅰ为(95.70±1.44)%。
2.6 提取方法的考察 实验采用4个因素3个水平正交设计考察了超声提取时间、提取次数、提取溶剂量及二氯甲烷与乙醇组成比例对药材中丹参酮 ⅡA提取率的影响。方差分析结果表明，提取时间、提取次数和提取溶剂量对丹参酮ⅡA的提取量有非常显著的影响(P<0.01)，提取溶剂种类对提取结果影响不大(P>0.05)。结果分析表明，以二氯甲烷∶乙醇(1∶1)10 ml为提取溶剂,超声20 min,提取1次的提取条件最优。
, 百拇医药
2.7 药材的含量测定结果 采自全国8个原产地的丹参药材测定结果见表1，其中不同产地丹参药材中丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量差异较大，丹参酮Ⅰ的含量变异不大，隐丹参酮及丹参酮Ⅰ在药材中的含量并不完全与丹参酮ⅡA的含量呈正相关。丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹参酮Ⅰ分别以四川中江、辽宁凌源和山东平邑所产丹参含量最高，以上海崇明所产丹参3项指标最低。
表 1 不同产地丹参中3种丹参酮的含量
Tab 1 Contents of 3 kinds of tanshinone in the root of
Salvia miltiorrhiza of different places
(n=3，x±s，%) Sourse of sample
Tanshinone
, 百拇医药
ⅡA
Tanshinone
Ⅰ
Cryptotanshinone
Lingyuan,Liaoning
0.23±0.01
0.07±0.01
0.46±0.02
Pingyi,Shandong
0.40±0.02
0.10±0.01
, 百拇医药 0.33±0.01
Lingbao,Henan
0.33±0.01
0.04±0.01
0.13±0.01
Bozhou,Anhui
0.15±0.01
0.04±0.01
0.06±0.01
Zhongjiang,Sichuan
0.43±0.03
, 百拇医药
0.15±0.01
0.39±0.02
Xingtang,Hebei
0.18±0.01
0.05±0.01
0.08±0.01
Pucheng,Shanxi
0.11±0.01
0.04±0.01
0.06±0.01
Chongming,Shanghai
, 百拇医药
0.10±0.01
0.03±0.01
0.04±0.01
3 讨 论
丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ是丹参的主要活性成分，应用HPLC法测定丹参中丹参酮的含量已有文献报道[4～6]，但未见应用超声提取结合HPLC法在同一条件下同时测定药材中3种成分的研究。为建立一种更为便捷的药材质量控制方法，我们参照文献[7，8]，对丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的提取、HPLC测定条件进行了优化。本研究建立的提取、测定方法，以二氯甲烷∶乙醇(1∶1) 10 ml为提取溶剂，将10 mg药材粉末超声提取20 min，3种成分提取完全且快捷。应用YWG C18色谱柱，选择甲醇∶水(78∶22)为流动相，3种成分在液相色谱图上分离度良好，回收率高。本法简便可靠，可用于丹参药材中丹参酮成分的常规提取测定。
, 百拇医药
中国药典(1995年版)规定，丹参药材的质量控制以丹参酮ⅡA的含量作为指标，不同产地丹参药材的含量测定结果显示，丹参药材中丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量差异较大，其中丹参酮ⅡA以四川、山东、河南、辽宁所产的丹参含量较高，隐丹参酮以辽宁、四川、山东所产的丹参含量较高，而丹参酮Ⅰ的含量变异不大，提示四川、山东、河南、辽宁所产的丹参质优。有文献报道[1]，丹参酮的抗菌活性主要为隐丹参酮等，而丹参酮ⅡA并无抗菌活性，我们的含量测定结果表明，丹参酮ⅡA含量并不全部与隐丹参酮的含量呈正相关，因此在以丹参抗菌活性为用药目的时，隐丹参酮的含量应为主要质量控制指标。
[作者简介] 李 力(1968-)，男(汉族)，博士生.
[参 考 文 献]
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会 主编. 中华本草[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998. 1650-1671.
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[2] 高玉桂, 宋玉梅, 杨友义,等. 丹参酮的药理[J]. 药学学报, 1979，14(2)：75-81.
[3] 秦万章. 丹参在皮肤科中的应用[J]. 中华皮肤科杂志，1989，22(4)：283-285.
[4] 陈 幸，黎万寿，夏文娟，等.四川中江丹参与其他产地丹参化学成分的比较研究[J]. 中国中药杂志，1997，22(9)：522-524.
[5] 王 曙，孙毅毅，贾运涛. 丹参脂溶性成分提取工艺初探[J]. 华西医科大学学报，1996，27(2)：203-206.
[6] 吴剑峰，杨安平，李海燕，等. 正交试验法筛选酒炙丹参的最佳炮制条件[J].中药材， 1999，22(6)：294-295.
[7] 傅 翔，张汉明，丁如贤. 菘蓝组织培养物中靛蓝、靛玉红含量的变化[J]. 第二军医大学学报，2000，21(1)：33，37.
[8] 郭美丽，张芝玉，张汉明，等. 不同栽培居群红花各器官的组织构造和化学成分含量[J]. 第二军医大学学报，1999，20(7)：441-444.
[收稿日期] 2000-02-24
[修回日期] 2000-06-08, http://www.100md.com