瘢痕涂膜质量标准的研究
作者：王玉珍 陈再兴 孟宪生 王东 龙沛霞
单位：王玉珍 陈再兴 孟宪生 王东 龙沛霞 辽宁中医学院(沈阳 110032)
关键词：瘢痕涂膜；丹参酮ⅡA；薄层扫描法
瘢痕涂膜质量标准的研究 摘 要 采用薄层色谱法对瘢痕涂膜中五倍子、苦参、冰片、甘草等成分进行鉴别，薄层扫描法测定丹参酮ⅡA的含量，加样回收率为95.4%，RSD=2.1%(n=6)。
瘢痕涂膜系由丹参、川芎、五倍子、苦参、冰片等十二味中药经科学方法提取精制成新型外用新药，用于预防和辅助治疗增生挛缩性瘢痕。经药效学试验和临床观察，疗效显著。为更好地控制本品的内在质量，保证疗效，笔者采用薄层色谱法对其中五倍子等4味药进行化学成分鉴别，用薄层扫描法测定其有效成分丹参酮ⅡA的含量，为本品建立一个较完善的控制质量的标准[1，2]。
, 百拇医药
1 仪器与试药
CS-930薄层扫描仪(日本岛津)，硅胶G、硅胶GF254(薄层层析用，青岛海洋化工厂)，没食子酸、氧化苦参碱、槐定碱、冰片、甘草酸铵、丹参酮ⅡA对照品由中国药品生物制品检定所提供，瘢痕涂膜由鞍钢华泰药业公司提供，所用试剂均为分析纯。
2 薄层鉴别
2.1 五倍子中没食子酸的鉴别
2.1.1 对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加乙醇制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
2.1.2 阴性对照溶液的制备：按处方取除被测药材外的各味药材，照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液(以下各阴性制照溶液的制备方法相同)。
, 百拇医药 2.1.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》95版一部附录35页)试验，吸取含量测定项下的供试品溶液5 μL，对照品溶液3 μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(15∶5∶1)为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相同的位置上，显相同的蓝黑色斑点。
2.2 苦参中氧化苦参碱和槐定碱的鉴别
2.2.1 供试品溶液的制备：取本品20 g置玻板上，铺成薄膜，晾干后剪碎，加入0.2%盐酸溶液100 mL，超声处理1 h，倾出上清液，加浓氨试液，调 pH 8～10，用氯仿提取3次，每次20 mL,合并氯仿提取液，蒸干，残渣加氯仿0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。
2.2.2 对照品溶液的制备：取氧化苦参碱和槐定碱对照品，加乙醇制成各含0.2 mg/mL混合溶液，作为对照品溶液。
, 百拇医药
2.2.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》95版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液25 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液(3∶5∶1.5∶0.5)的下层溶液为展开剂，展开，展距约15 cm，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同的两个红橙色斑点。
2.3 冰片的鉴别
2.3.1 供试品溶液的制备：取本品4 g，置于玻板上，铺成薄膜，晾干后剪碎，置于具塞锥形瓶中，加乙醚10 mL，密塞，振摇，放置过夜，倾出上清液，作为供试品溶液。
2.3.2 对照品溶液的制备：取冰片对照品，加甲醇-氯仿(1∶1)混合液制成5 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
2.3.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各4 μL，分别点于同一以羧甲基纤维基纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30℃～60℃)-醋酸乙酯-氯仿(22∶2∶6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110℃烘数分钟。供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显两个相同的紫红色斑点。
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2.4 甘草酸铵的鉴别
2.4.1 供试品溶液的制备：取本品40 g慢慢滴加水40 mL，边加边搅拌，滤过，滤液用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次10 mL，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。
2.4.2 对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品，加甲醇制成2 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
2.4.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-乙醇(2∶6∶7)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 mm)下检视。供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。见图1。
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A-没食子酸 B-氧化苦参碱 C-槐定碱 D-冰片 E-甘草酸铵 1-供试品 2-阴性对照
图1 薄层色谱图
3 丹参酮ⅡA的含量测定
3.1 薄层层析及扫描条件：薄层板：含3%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板，厚0.3 mm，105℃～110℃活化30 min；展开剂：石油醚(60℃～90℃)-苯-醋酸乙酯(15∶5∶1)，饱和10 min，展距8 cm；反射法锯齿扫描；λs=480 nm,λR=700 nm;Sx=3。
3.2 丹参酮ⅡA提取方法的选择：丹参酮ⅡA为丹参中脂溶性成分，溶于乙醇、醋酸乙酯、乙醚等溶剂。本品所用成膜材料聚乙烯醇缩丁醛也溶于乙醇和醋酸乙醋，但不溶于乙醚，故选用乙醚做提取溶剂。提取方法：将样品铺成薄膜，挥散溶剂，分别用乙醚①冷浸24 h；②超声提取30 min；③索氏提取器提取至无色；第④种方法是取样后，直接往样品中加乙醚至基质析出，放置，取上清液进行测定。用上述4种方法提取后，测定丹参酮ⅡA的含量，试验结果表明，用第④种方法提取丹参酮ⅡA效率高。
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3.3 供试品溶液的制备：取本品20 g，精密称定，逐步滴加乙醚50 mL，边加边搅拌，定量转移至100 mL棕色量瓶中，加乙醚稀释至刻度，充分振摇，放置过夜。精密量取上清液50 mL，挥散溶剂至3 mL，滴加乙醚20 mL，边加边搅，定量转移至50 mL棕色量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，放置4 h。精密量取上清液25 mL，用水15 mL洗涤，取乙醚层，蒸干，残渣用氯仿-无水乙醇(4∶1)混合液溶解，定量转移至2 mL棕色量瓶中，用上述混合液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
3.4 对照品溶液的制备：取丹参酮ⅡA对照品，加乙醇溶解并制成0.5 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
3.5 线性关系的考查：吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，点于薄层板上，按上述薄层色谱条件展开，扫描，以丹参酮ⅡA点样量为横坐标，以吸收度积分值为纵坐标作图，得一直线，回归方程为：Y=346.7+16053.2 X,r=0.9988。测定结果表明，丹参酮ⅡA在0.50～2.50 μg范围内，具有良好的线性关系。由于标准曲线不通过原点，定量时应采用外标二点法。
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3.6 稳定性试验：取供试品溶液10 μL，点于薄层板上，按上述色谱条件展开，取出，晾干后立即扫描，每隔1 h测定1次，试验结果表明，丹参酮ⅡA斑点吸收度积分值在2 h处明显减小。若将薄层板从层析缸中取出晾干后，立即覆盖一玻璃板，重复上述试验，测定结果表明丹参酮ⅡA斑点在5 h内稳定。
供试品溶液稳定性试验：将供试品溶液按0、2、4、6、8、24 h时间隔测定丹参酮ⅡA的含量，结果表明，在24 h内供试品溶液中丹参酮ⅡA的含量基本无变化(RSD=1.6%)。
3.7 精密度试验：在同一薄层板上和不同薄 层板上各点6个同样量(4 μL)对照品溶液，按上述条件展开、扫描测定，计算吸收度积分值的RSD，同板为1.2%，异板为2.9%。
3.8 样品含量测定：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液6 μL，对照品溶液1 与2 μL，分别交叉点于同一薄层板上，按上述条件展开，取出，晾干，扫描，测定斑点吸收度积分值并计算其含量，结果见表1。
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表1 样品丹参酮ⅡA含量斑点测定结果
批 号
含量(%)
RSD(%)
950704
0.0057
2.8
950705
0.0050
2.1
950801
0.0046
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3.3
950802
0.0042
3.0
3.9 回收率测定：取已知含量的样品约10 g，精密称定，分别精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液(0.910 mg/mL) 1.0 mL，按含量测定项下方法称定，计算平均回收率为95.4%，RSD=2.1%(n=6)。
4 讨论
4.1 由于本品粘度大，基质对测定干扰严重。在薄层鉴别和含量测定时，供试品溶液的提取、分离、纯化是经反复试验、筛选确定的，可以排除基质干扰，测定结果可靠。
4.2 为全面控制本品质量，对其相对体积质量、pH值、乙醇量和水溶性浸出物进行了测定。
参 考 文 献
1 王宝琴，等.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994：242
2 刘 燕，等.中国中药杂志，1990，15(3)：31
(1998-07-06 收稿), 百拇医药
单位：王玉珍 陈再兴 孟宪生 王东 龙沛霞 辽宁中医学院(沈阳 110032)
关键词：瘢痕涂膜；丹参酮ⅡA；薄层扫描法
瘢痕涂膜质量标准的研究 摘 要 采用薄层色谱法对瘢痕涂膜中五倍子、苦参、冰片、甘草等成分进行鉴别，薄层扫描法测定丹参酮ⅡA的含量，加样回收率为95.4%，RSD=2.1%(n=6)。
瘢痕涂膜系由丹参、川芎、五倍子、苦参、冰片等十二味中药经科学方法提取精制成新型外用新药，用于预防和辅助治疗增生挛缩性瘢痕。经药效学试验和临床观察，疗效显著。为更好地控制本品的内在质量，保证疗效，笔者采用薄层色谱法对其中五倍子等4味药进行化学成分鉴别，用薄层扫描法测定其有效成分丹参酮ⅡA的含量，为本品建立一个较完善的控制质量的标准[1，2]。
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1 仪器与试药
CS-930薄层扫描仪(日本岛津)，硅胶G、硅胶GF254(薄层层析用，青岛海洋化工厂)，没食子酸、氧化苦参碱、槐定碱、冰片、甘草酸铵、丹参酮ⅡA对照品由中国药品生物制品检定所提供，瘢痕涂膜由鞍钢华泰药业公司提供，所用试剂均为分析纯。
2 薄层鉴别
2.1 五倍子中没食子酸的鉴别
2.1.1 对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加乙醇制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
2.1.2 阴性对照溶液的制备：按处方取除被测药材外的各味药材，照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液(以下各阴性制照溶液的制备方法相同)。
, 百拇医药 2.1.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》95版一部附录35页)试验，吸取含量测定项下的供试品溶液5 μL，对照品溶液3 μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(15∶5∶1)为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相同的位置上，显相同的蓝黑色斑点。
2.2 苦参中氧化苦参碱和槐定碱的鉴别
2.2.1 供试品溶液的制备：取本品20 g置玻板上，铺成薄膜，晾干后剪碎，加入0.2%盐酸溶液100 mL，超声处理1 h，倾出上清液，加浓氨试液，调 pH 8～10，用氯仿提取3次，每次20 mL,合并氯仿提取液，蒸干，残渣加氯仿0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。
2.2.2 对照品溶液的制备：取氧化苦参碱和槐定碱对照品，加乙醇制成各含0.2 mg/mL混合溶液，作为对照品溶液。
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2.2.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》95版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液25 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液(3∶5∶1.5∶0.5)的下层溶液为展开剂，展开，展距约15 cm，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同的两个红橙色斑点。
2.3 冰片的鉴别
2.3.1 供试品溶液的制备：取本品4 g，置于玻板上，铺成薄膜，晾干后剪碎，置于具塞锥形瓶中，加乙醚10 mL，密塞，振摇，放置过夜，倾出上清液，作为供试品溶液。
2.3.2 对照品溶液的制备：取冰片对照品，加甲醇-氯仿(1∶1)混合液制成5 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
2.3.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各4 μL，分别点于同一以羧甲基纤维基纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30℃～60℃)-醋酸乙酯-氯仿(22∶2∶6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110℃烘数分钟。供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显两个相同的紫红色斑点。
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2.4 甘草酸铵的鉴别
2.4.1 供试品溶液的制备：取本品40 g慢慢滴加水40 mL，边加边搅拌，滤过，滤液用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次10 mL，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。
2.4.2 对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品，加甲醇制成2 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
2.4.3 薄层层析：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-乙醇(2∶6∶7)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 mm)下检视。供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。见图1。
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A-没食子酸 B-氧化苦参碱 C-槐定碱 D-冰片 E-甘草酸铵 1-供试品 2-阴性对照
图1 薄层色谱图
3 丹参酮ⅡA的含量测定
3.1 薄层层析及扫描条件：薄层板：含3%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板，厚0.3 mm，105℃～110℃活化30 min；展开剂：石油醚(60℃～90℃)-苯-醋酸乙酯(15∶5∶1)，饱和10 min，展距8 cm；反射法锯齿扫描；λs=480 nm,λR=700 nm;Sx=3。
3.2 丹参酮ⅡA提取方法的选择：丹参酮ⅡA为丹参中脂溶性成分，溶于乙醇、醋酸乙酯、乙醚等溶剂。本品所用成膜材料聚乙烯醇缩丁醛也溶于乙醇和醋酸乙醋，但不溶于乙醚，故选用乙醚做提取溶剂。提取方法：将样品铺成薄膜，挥散溶剂，分别用乙醚①冷浸24 h；②超声提取30 min；③索氏提取器提取至无色；第④种方法是取样后，直接往样品中加乙醚至基质析出，放置，取上清液进行测定。用上述4种方法提取后，测定丹参酮ⅡA的含量，试验结果表明，用第④种方法提取丹参酮ⅡA效率高。
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3.3 供试品溶液的制备：取本品20 g，精密称定，逐步滴加乙醚50 mL，边加边搅拌，定量转移至100 mL棕色量瓶中，加乙醚稀释至刻度，充分振摇，放置过夜。精密量取上清液50 mL，挥散溶剂至3 mL，滴加乙醚20 mL，边加边搅，定量转移至50 mL棕色量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀，放置4 h。精密量取上清液25 mL，用水15 mL洗涤，取乙醚层，蒸干，残渣用氯仿-无水乙醇(4∶1)混合液溶解，定量转移至2 mL棕色量瓶中，用上述混合液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
3.4 对照品溶液的制备：取丹参酮ⅡA对照品，加乙醇溶解并制成0.5 mg/mL溶液，作为对照品溶液。
3.5 线性关系的考查：吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，点于薄层板上，按上述薄层色谱条件展开，扫描，以丹参酮ⅡA点样量为横坐标，以吸收度积分值为纵坐标作图，得一直线，回归方程为：Y=346.7+16053.2 X,r=0.9988。测定结果表明，丹参酮ⅡA在0.50～2.50 μg范围内，具有良好的线性关系。由于标准曲线不通过原点，定量时应采用外标二点法。
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3.6 稳定性试验：取供试品溶液10 μL，点于薄层板上，按上述色谱条件展开，取出，晾干后立即扫描，每隔1 h测定1次，试验结果表明，丹参酮ⅡA斑点吸收度积分值在2 h处明显减小。若将薄层板从层析缸中取出晾干后，立即覆盖一玻璃板，重复上述试验，测定结果表明丹参酮ⅡA斑点在5 h内稳定。
供试品溶液稳定性试验：将供试品溶液按0、2、4、6、8、24 h时间隔测定丹参酮ⅡA的含量，结果表明，在24 h内供试品溶液中丹参酮ⅡA的含量基本无变化(RSD=1.6%)。
3.7 精密度试验：在同一薄层板上和不同薄 层板上各点6个同样量(4 μL)对照品溶液，按上述条件展开、扫描测定，计算吸收度积分值的RSD，同板为1.2%，异板为2.9%。
3.8 样品含量测定：照薄层色谱法(《中国药典》1995年版一部附录35页)试验，吸取供试品溶液6 μL，对照品溶液1 与2 μL，分别交叉点于同一薄层板上，按上述条件展开，取出，晾干，扫描，测定斑点吸收度积分值并计算其含量，结果见表1。
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表1 样品丹参酮ⅡA含量斑点测定结果
批 号
含量(%)
RSD(%)
950704
0.0057
2.8
950705
0.0050
2.1
950801
0.0046
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3.3
950802
0.0042
3.0
3.9 回收率测定：取已知含量的样品约10 g，精密称定，分别精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液(0.910 mg/mL) 1.0 mL，按含量测定项下方法称定，计算平均回收率为95.4%，RSD=2.1%(n=6)。
4 讨论
4.1 由于本品粘度大，基质对测定干扰严重。在薄层鉴别和含量测定时，供试品溶液的提取、分离、纯化是经反复试验、筛选确定的，可以排除基质干扰，测定结果可靠。
4.2 为全面控制本品质量，对其相对体积质量、pH值、乙醇量和水溶性浸出物进行了测定。
参 考 文 献
1 王宝琴，等.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994：242
2 刘 燕，等.中国中药杂志，1990，15(3)：31
(1998-07-06 收稿), 百拇医药