安氟醚和异氟醚对大鼠脑薄片视上核神经元自发电活动的影响
作者：徐礼鲜 张惠 张洪凯 李军 张国良
单位：第四军医大学口腔医学院麻醉科，西安市，710032
关键词：安氟醚；异氟醚；视上核
临床麻醉学杂志000610
摘要 目的：了解吸入麻醉药安氟醚(Enf)和异氟醚(Iso)对大鼠下丘脑视上核(SO)神经元电生理的影响。方法：应用膜片钳技术，观察Enf和Iso对大鼠下丘脑薄片SO神经元自发电活动的影响。结果：Enf(3.0%)对SO神经元自发电活动有明显的兴奋作用，Iso(2.2%)对SO神经元自发电活动的兴奋作用与Enf基本相同。用正常人工脑脊液(ACSF)冲洗5分钟放电频率可恢复至给药前水平。结论：Enf和Iso对下丘脑SO电活动有可逆性的兴奋作用，表明SO是Enf和Iso在中枢的重要作用部位。
Effects of Enflurane and Isoflurane on Spontaneous Neural Discharge of the Supraoptic Nucleus Neurons of Rat Hypothalamic Slices
, 百拇医药
Xu Lixian，Zhang Hui，Zhang Hongkai，et al
(Department of Anesthesiology，Stomatological College，Fourth Military Medical University，Xian 710032)
Abstract Objective：To study the effects of enflurane (Enf) and isoflurane(Iso) on electrophysiology of supraoptic nucleus neurous.Methods：With whole patch-clamp technique，the effects of Enf and Iso were studied on spontaneous neural discharge of the supraoptic nucleus neurons from rat hypothalamic slices.Results：The frequencies of spontaneous neural discharge were increased obviously by Enf(3.0%) and Iso(2.2%)，which returned to the baseline by normal artifical cerebrospinal fluid wash for 5 minutes.Conclusions：The discharge of supraoptic nucleus can be excited reversiblely by Enf or Iso indicating that the supraoptic nucleu may be an important location during Iso or Enf anesthesia.
, 百拇医药
Key words Enflurane Isoflurane Supraoptic nucleus
视上核(supraoptic nucleus，SO)是丘脑下部最明显重要核团之一，跨越视束，在冠状切面上呈哑铃形。此核细胞密集数量多，以大细胞为主，接受广泛的传入纤维。SO的纤维可投射到丘脑室旁核(PV)、中脑脑导水管周围灰质(PAG)、蓝斑(LC)、中缝大核(NRM)及中缝背核(DR)和脊髓。SO以大细胞为主，为内分泌性神经元，除分泌加压素和催产素外，还分泌亮氨酸脑啡肽、强啡肽和β-内啡肽[1，2]。业已认为，SO拥有参与痛觉调控的结构和物质基础[3]。近年来我们研究发现吸入麻醉药安氟醚和异氟醚可诱导c-fos基因在SO神经元内表达，提示SO参与了全麻作用，但作用机理尚不清楚[4]。静脉麻醉剂氯羟安定和******钠能明显的抑制SO神经元自发电活动[5]。本文研究用全细胞膜片钳记录技术，探讨吸入麻醉药安氟醚 和异氟醚对SO神经元自发电活动的影响，为进一步研究吸入麻醉机制打下基础。
, 百拇医药
材料与方法
药物和仪器 安氟醚(Enf)和异氟醚(Iso)均为雅培公司产品；膜片钳放大器、PP-83拉制仪和振动切机为日本株式会社产品；玻璃微电极为上海脑研究所产品；SD大鼠由第四军医大学动物中心提供。
下丘脑薄片的制备 实验用SD大鼠，30～60天龄，雌雄不拘，断头，迅速取出全脑置于4℃人工脑脊液(ACSF)中，通入95%O2和5%的CO2混合气体，将其修成6mm×6mm×6mm含视上核的脑组织块，在振动切片机上制备300～400μm的下丘脑的薄片。脑片在ACSF中孵育至少1小时，然后移至标本小室，脑片固定在两层尼龙网之间，并完全浸没在氧合的ACSF中，灌流瓶中的ACSF由重力作用驱使以1～2ml/min的速度灌流脑片。
给药方式 将95%O2和5%的CO2混合气体经过不同麻醉气体挥发罐，并用麻醉气体监测仪控制Enf(1.5%、3%、4.5%)和Iso(1.1%、2.2%、3.3%)的浓度后通入ACSF溶液，由三通开关控制不同的浓度、不同药物的ACSF溶液灌流标本，观察给药前、给药期间和冲洗后的放电频率的变化，用药时间为3分钟，冲洗5～7分钟后记录和分析SO神经元放电频率的改变情况。
, 百拇医药
自发放电活动记录 记录电极尖端为1～2μm的玻璃微电极，电阻为7MΩ，电极内充液为(K-Gluconate 140mmol/L，MgCl22mmol/L，Hepes 10mmol/L，ATP 2mmol/L，pH7.2)。在解剖显微镜下可清楚地分辨出SO的位置，将微电极接近下丘脑SO神经元，在轻负压吸引下微电极可与细胞膜贴合引出膜静息电位和自发动作电位。信号经微电极放大器和前置放大器显示在示波器上，同时输入计算机，通过Pclamp软件进行信号处理。
结果
基本电生理学性质 在脑片上测得SO神经元膜电位为59±8.0mV(-45～-72mV，n＝30)，以神经元静息电位为基础给予阶跃电流刺激，记录相应的膜电位的变化，由此测得膜输入阻抗为535±129(330～840)MΩ，经clampfit拟合求得膜时间常数为32±9(20～53)ms(图1)。
Enf对SO神经元自发电活动的影响 Enf(1.5%、3%、4.5%)对神经元自发电活动均有一定的兴奋作用，但1.5%Enf仅有轻微的作用，作用不太明显；4.5%兴奋作用非常强，冲洗5分钟仍无明显恢复迹象；3%对SO神经元具有明显的兴奋效应，用正常ACSF冲洗5分钟可逐渐恢复到给药前水平(图2)，给药前中和冲洗后的频率分别为193.7±43.3、567.8±115.6、239.7±46.4分钟(表1)。
, 百拇医药
图1 视上核神经元全细胞膜片钳记录正常放电特征
图2 安氟醚对视上核神经元自发放电活动的影响表1 安氟醚对SO神经元自发放电的影响
(
±s)(n＝30) 组别
神经元自发放电频率(次/分)
用药前
用药后5min
冲洗后5min
1.5%Enf
202.6±38.4
, 百拇医药
255.3±48.1
215.2±72.5
3.0%Enf
193.7±43.5
567.8±115.6* △
239.7±46.4
4.5%Enf
184.8±51.3
689.7±86.4* △
647.8±67.5* △
与用药前比较，*P<0.01 与1.5%Enf比较，△P<0.01
, http://www.100md.com
Iso对SO神经元自发电活动的影响 经盲插成功30例实验结果表明，Iso(1.1%、2.2%、3.3%)对神经元自发电活动的兴奋作用与安氟醚基本相同，1.1%Iso仅有轻微的兴奋作用，统计差别不明显；而3个MAC的Iso(3.3%)兴奋作用强，冲洗5分钟仍恢复不太理想，2个MAC的Iso(2.2%)对SO神经元具有明显的兴奋效应，用正常ACSF冲洗5分钟可逐渐恢复到给药前水平(图3)，给药前中和冲洗后的频率分别为78.3±21.3、397.5±85.7、99.6±34.7分钟(表2)。
图3 异氟醚对视上核神经元自发放电的影响 表2 异氟醚对SO神经元自发放电的影响
(±s)(n＝30) 组别
, 百拇医药 神经元自发放电频率(次/分)
用药前
用药后5min
冲洗后5min
1.1%Isof
167.6±38.9
234.3±41.8
175.7±45.5
2.2%Isof
163.5±35.6
598.6±107.6* △
, http://www.100md.com 211.7±66.4
3.3%Isof
190.8±49.7
745.9±97.8* △
597.8±163.4* △
与用药前比较，*P<0.01 与1.1%Iso比较，△P<0.01讨论
近年来新开展的脑薄片全细胞记录技术，能保持神经元在体发育的程序及空间结构，有相对完整的突触联系。此外神经元没有受消化酶的破坏，细胞生物活性接近生理状态，比传统膜片钳更适用于药物对神经元电生理的研究。
安氟醚和异氟醚是临床上最常用的吸入麻醉药，以往实验发现吸入麻醉和静脉麻醉可使网状上行激活系统处于抑制状态，最终导致意识丧失。然而，现已了解网状系统主要是按功能划分的，属于生理范畴的功能整合系统，所涉及到的形态学内容包括神经通路和相关的神经核群，难以精确定位[6，7]。许多学者研究表明吸入麻醉药对抑制性和兴奋性突触后电位具有明显作用，在抑制兴奋性突触的同时可加强抑制性突触的作用[8，9]。近年来我们研究发现吸入麻醉与下丘脑许多功能神经核团有一定的关系，吸入麻醉后能诱发即刻早期基因c-fos在SO神经元内明显表达，提示SO参与了全麻过程[10]。有学者研究提示全身麻醉药对突触前和后膜K+、Na+和Ca均有一定的影响[11，12]。但对麻醉药诱导中枢c-fos基因表达的阳性核团神经元放电频率的变化尚未见报道。本研究用膜片钳技术发现安氟醚和异氟醚能使SO神经元自发放电频率明显增加，表明吸入麻醉药在本研究浓度范围内，对SO神经元有明显的兴奋作用。有学者研究表明，刺激SO能明显提高疼痛阈值[13，14]，同时发现β-内啡肽和亮氨酸脑啡肽释放增加，还发现SO和蓝斑内的催产素与精氨酸加压素含量明显增加。吸入麻醉药对SO神经元产生明显的兴奋作用，使内啡肽分泌增加，可能是吸入麻醉镇痛作用的重要机制；同时影响加压素和催产素的分泌，在临床麻醉中表现为心血管系统的改变，这些推测需进一步研究证实。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金科题(NO：39470674)
参考文献
1，Alonso G，Szafarcyk A，Assenmacher I.Radioautographic evidence that axons from the area of supraoptic nuclei in the rat project to extrahypothalamic brain regions.Neurosci Lett，1986，66：251.
2，Buijs RM，Van Vulpeu EHS，Geffard M.Ultrastructural localization of GABA in the supraoptic nucleus and neural lobe.Neuroscience，1987，20：347-352.
, http://www.100md.com 3，由振东，宋朝佑，王成海，等.蓝斑在视上核镇痛中的作用.生理学报，1995，47：320-323.
4，徐礼鲜，孙辉，张晓峰，等.甲氧氟烷、氟烷、安氟醚和异氟醚麻醉在间脑作用的定位研究.中华麻醉学杂志，1997，17：563.
5，徐礼鲜，张英民，李军，等.γ-OH和氯羟安定对视上核神经元放电活动的影响.中华麻醉学杂志，1998，18：541.
6，Franks NP，Lieb WR.Molecular and cellular mechanisms of general anesthesia.Nature，1994，367：607.
7，Kress HG.Molecular and cellular actions of inhalation anesthetics.Anesthesiol INS，1992，2：293.
, 百拇医药
8，Bleakman D，Jones MV，Harrison NL.The effects of four general anesthetics on intracellular[Ca]in cultured rat hippocampal neurons.Neuropharmacology，1995，34：541.
9，Bui js RM，Van Vulpeu EHS，Geffard M.Ultrastructural localization of GABA in the supraoptic nucleus and neural lobe.Neuroscience，1987，20：347.
10，徐礼鲜，李军，张国良，等.异氟醚、安氟醚、甲氧氟烷和氟烷在边缘系统作用的定位研究.第四军医大学学报，1997，18：539.
11，Forman SA，Miller KW，Yellen G.A discrete site for general anesthetics on a postsynaptic receptor.Mol-Pharmacol，1995，48：574.
, 百拇医药
12，FrankelC，?Urban-BW.?Molecular actions of racemic ketamine on human CNS sodium channels.Br J Anaesth，1992，69：292.
13，Alonos G，Szafardyk A， Assaenmache I.Radioautographic evidence that axons from the area of supraoptic nuclei in the rat project to extrahypothalamic brain regions.Neurosci Lett，1986，66：251.
14，You ZD，Song CY，Wang CH，et al.Role of locus coeruleus in analgesia caused by stimulation of supraoptic nucleus.Sheng Li Hsueh Pao，1995，47：320.
收稿：1999-07-16, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院麻醉科，西安市，710032
关键词：安氟醚；异氟醚；视上核
临床麻醉学杂志000610
摘要 目的：了解吸入麻醉药安氟醚(Enf)和异氟醚(Iso)对大鼠下丘脑视上核(SO)神经元电生理的影响。方法：应用膜片钳技术，观察Enf和Iso对大鼠下丘脑薄片SO神经元自发电活动的影响。结果：Enf(3.0%)对SO神经元自发电活动有明显的兴奋作用，Iso(2.2%)对SO神经元自发电活动的兴奋作用与Enf基本相同。用正常人工脑脊液(ACSF)冲洗5分钟放电频率可恢复至给药前水平。结论：Enf和Iso对下丘脑SO电活动有可逆性的兴奋作用，表明SO是Enf和Iso在中枢的重要作用部位。
Effects of Enflurane and Isoflurane on Spontaneous Neural Discharge of the Supraoptic Nucleus Neurons of Rat Hypothalamic Slices
, 百拇医药
Xu Lixian，Zhang Hui，Zhang Hongkai，et al
(Department of Anesthesiology，Stomatological College，Fourth Military Medical University，Xian 710032)
Abstract Objective：To study the effects of enflurane (Enf) and isoflurane(Iso) on electrophysiology of supraoptic nucleus neurous.Methods：With whole patch-clamp technique，the effects of Enf and Iso were studied on spontaneous neural discharge of the supraoptic nucleus neurons from rat hypothalamic slices.Results：The frequencies of spontaneous neural discharge were increased obviously by Enf(3.0%) and Iso(2.2%)，which returned to the baseline by normal artifical cerebrospinal fluid wash for 5 minutes.Conclusions：The discharge of supraoptic nucleus can be excited reversiblely by Enf or Iso indicating that the supraoptic nucleu may be an important location during Iso or Enf anesthesia.
, 百拇医药
Key words Enflurane Isoflurane Supraoptic nucleus
视上核(supraoptic nucleus，SO)是丘脑下部最明显重要核团之一，跨越视束，在冠状切面上呈哑铃形。此核细胞密集数量多，以大细胞为主，接受广泛的传入纤维。SO的纤维可投射到丘脑室旁核(PV)、中脑脑导水管周围灰质(PAG)、蓝斑(LC)、中缝大核(NRM)及中缝背核(DR)和脊髓。SO以大细胞为主，为内分泌性神经元，除分泌加压素和催产素外，还分泌亮氨酸脑啡肽、强啡肽和β-内啡肽[1，2]。业已认为，SO拥有参与痛觉调控的结构和物质基础[3]。近年来我们研究发现吸入麻醉药安氟醚和异氟醚可诱导c-fos基因在SO神经元内表达，提示SO参与了全麻作用，但作用机理尚不清楚[4]。静脉麻醉剂氯羟安定和******钠能明显的抑制SO神经元自发电活动[5]。本文研究用全细胞膜片钳记录技术，探讨吸入麻醉药安氟醚 和异氟醚对SO神经元自发电活动的影响，为进一步研究吸入麻醉机制打下基础。
, 百拇医药
材料与方法
药物和仪器 安氟醚(Enf)和异氟醚(Iso)均为雅培公司产品；膜片钳放大器、PP-83拉制仪和振动切机为日本株式会社产品；玻璃微电极为上海脑研究所产品；SD大鼠由第四军医大学动物中心提供。
下丘脑薄片的制备 实验用SD大鼠，30～60天龄，雌雄不拘，断头，迅速取出全脑置于4℃人工脑脊液(ACSF)中，通入95%O2和5%的CO2混合气体，将其修成6mm×6mm×6mm含视上核的脑组织块，在振动切片机上制备300～400μm的下丘脑的薄片。脑片在ACSF中孵育至少1小时，然后移至标本小室，脑片固定在两层尼龙网之间，并完全浸没在氧合的ACSF中，灌流瓶中的ACSF由重力作用驱使以1～2ml/min的速度灌流脑片。
给药方式 将95%O2和5%的CO2混合气体经过不同麻醉气体挥发罐，并用麻醉气体监测仪控制Enf(1.5%、3%、4.5%)和Iso(1.1%、2.2%、3.3%)的浓度后通入ACSF溶液，由三通开关控制不同的浓度、不同药物的ACSF溶液灌流标本，观察给药前、给药期间和冲洗后的放电频率的变化，用药时间为3分钟，冲洗5～7分钟后记录和分析SO神经元放电频率的改变情况。
, 百拇医药
自发放电活动记录 记录电极尖端为1～2μm的玻璃微电极，电阻为7MΩ，电极内充液为(K-Gluconate 140mmol/L，MgCl22mmol/L，Hepes 10mmol/L，ATP 2mmol/L，pH7.2)。在解剖显微镜下可清楚地分辨出SO的位置，将微电极接近下丘脑SO神经元，在轻负压吸引下微电极可与细胞膜贴合引出膜静息电位和自发动作电位。信号经微电极放大器和前置放大器显示在示波器上，同时输入计算机，通过Pclamp软件进行信号处理。
结果
基本电生理学性质 在脑片上测得SO神经元膜电位为59±8.0mV(-45～-72mV，n＝30)，以神经元静息电位为基础给予阶跃电流刺激，记录相应的膜电位的变化，由此测得膜输入阻抗为535±129(330～840)MΩ，经clampfit拟合求得膜时间常数为32±9(20～53)ms(图1)。
Enf对SO神经元自发电活动的影响 Enf(1.5%、3%、4.5%)对神经元自发电活动均有一定的兴奋作用，但1.5%Enf仅有轻微的作用，作用不太明显；4.5%兴奋作用非常强，冲洗5分钟仍无明显恢复迹象；3%对SO神经元具有明显的兴奋效应，用正常ACSF冲洗5分钟可逐渐恢复到给药前水平(图2)，给药前中和冲洗后的频率分别为193.7±43.3、567.8±115.6、239.7±46.4分钟(表1)。
, 百拇医药
图1 视上核神经元全细胞膜片钳记录正常放电特征
图2 安氟醚对视上核神经元自发放电活动的影响表1 安氟醚对SO神经元自发放电的影响
(
±s)(n＝30) 组别神经元自发放电频率(次/分)
用药前
用药后5min
冲洗后5min
1.5%Enf
202.6±38.4
, 百拇医药
255.3±48.1
215.2±72.5
3.0%Enf
193.7±43.5
567.8±115.6* △
239.7±46.4
4.5%Enf
184.8±51.3
689.7±86.4* △
647.8±67.5* △
与用药前比较，*P<0.01 与1.5%Enf比较，△P<0.01
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Iso对SO神经元自发电活动的影响 经盲插成功30例实验结果表明，Iso(1.1%、2.2%、3.3%)对神经元自发电活动的兴奋作用与安氟醚基本相同，1.1%Iso仅有轻微的兴奋作用，统计差别不明显；而3个MAC的Iso(3.3%)兴奋作用强，冲洗5分钟仍恢复不太理想，2个MAC的Iso(2.2%)对SO神经元具有明显的兴奋效应，用正常ACSF冲洗5分钟可逐渐恢复到给药前水平(图3)，给药前中和冲洗后的频率分别为78.3±21.3、397.5±85.7、99.6±34.7分钟(表2)。
图3 异氟醚对视上核神经元自发放电的影响 表2 异氟醚对SO神经元自发放电的影响
(
±s)(n＝30) 组别, 百拇医药 神经元自发放电频率(次/分)
用药前
用药后5min
冲洗后5min
1.1%Isof
167.6±38.9
234.3±41.8
175.7±45.5
2.2%Isof
163.5±35.6
598.6±107.6* △
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3.3%Isof
190.8±49.7
745.9±97.8* △
597.8±163.4* △
与用药前比较，*P<0.01 与1.1%Iso比较，△P<0.01讨论
近年来新开展的脑薄片全细胞记录技术，能保持神经元在体发育的程序及空间结构，有相对完整的突触联系。此外神经元没有受消化酶的破坏，细胞生物活性接近生理状态，比传统膜片钳更适用于药物对神经元电生理的研究。
安氟醚和异氟醚是临床上最常用的吸入麻醉药，以往实验发现吸入麻醉和静脉麻醉可使网状上行激活系统处于抑制状态，最终导致意识丧失。然而，现已了解网状系统主要是按功能划分的，属于生理范畴的功能整合系统，所涉及到的形态学内容包括神经通路和相关的神经核群，难以精确定位[6，7]。许多学者研究表明吸入麻醉药对抑制性和兴奋性突触后电位具有明显作用，在抑制兴奋性突触的同时可加强抑制性突触的作用[8，9]。近年来我们研究发现吸入麻醉与下丘脑许多功能神经核团有一定的关系，吸入麻醉后能诱发即刻早期基因c-fos在SO神经元内明显表达，提示SO参与了全麻过程[10]。有学者研究提示全身麻醉药对突触前和后膜K+、Na+和Ca均有一定的影响[11，12]。但对麻醉药诱导中枢c-fos基因表达的阳性核团神经元放电频率的变化尚未见报道。本研究用膜片钳技术发现安氟醚和异氟醚能使SO神经元自发放电频率明显增加，表明吸入麻醉药在本研究浓度范围内，对SO神经元有明显的兴奋作用。有学者研究表明，刺激SO能明显提高疼痛阈值[13，14]，同时发现β-内啡肽和亮氨酸脑啡肽释放增加，还发现SO和蓝斑内的催产素与精氨酸加压素含量明显增加。吸入麻醉药对SO神经元产生明显的兴奋作用，使内啡肽分泌增加，可能是吸入麻醉镇痛作用的重要机制；同时影响加压素和催产素的分泌，在临床麻醉中表现为心血管系统的改变，这些推测需进一步研究证实。
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国家自然科学基金科题(NO：39470674)
参考文献
1，Alonso G，Szafarcyk A，Assenmacher I.Radioautographic evidence that axons from the area of supraoptic nuclei in the rat project to extrahypothalamic brain regions.Neurosci Lett，1986，66：251.
2，Buijs RM，Van Vulpeu EHS，Geffard M.Ultrastructural localization of GABA in the supraoptic nucleus and neural lobe.Neuroscience，1987，20：347-352.
, http://www.100md.com 3，由振东，宋朝佑，王成海，等.蓝斑在视上核镇痛中的作用.生理学报，1995，47：320-323.
4，徐礼鲜，孙辉，张晓峰，等.甲氧氟烷、氟烷、安氟醚和异氟醚麻醉在间脑作用的定位研究.中华麻醉学杂志，1997，17：563.
5，徐礼鲜，张英民，李军，等.γ-OH和氯羟安定对视上核神经元放电活动的影响.中华麻醉学杂志，1998，18：541.
6，Franks NP，Lieb WR.Molecular and cellular mechanisms of general anesthesia.Nature，1994，367：607.
7，Kress HG.Molecular and cellular actions of inhalation anesthetics.Anesthesiol INS，1992，2：293.
, 百拇医药
8，Bleakman D，Jones MV，Harrison NL.The effects of four general anesthetics on intracellular[Ca]in cultured rat hippocampal neurons.Neuropharmacology，1995，34：541.
9，Bui js RM，Van Vulpeu EHS，Geffard M.Ultrastructural localization of GABA in the supraoptic nucleus and neural lobe.Neuroscience，1987，20：347.
10，徐礼鲜，李军，张国良，等.异氟醚、安氟醚、甲氧氟烷和氟烷在边缘系统作用的定位研究.第四军医大学学报，1997，18：539.
11，Forman SA，Miller KW，Yellen G.A discrete site for general anesthetics on a postsynaptic receptor.Mol-Pharmacol，1995，48：574.
, 百拇医药
12，FrankelC，?Urban-BW.?Molecular actions of racemic ketamine on human CNS sodium channels.Br J Anaesth，1992，69：292.
13，Alonos G，Szafardyk A， Assaenmache I.Radioautographic evidence that axons from the area of supraoptic nuclei in the rat project to extrahypothalamic brain regions.Neurosci Lett，1986，66：251.
14，You ZD，Song CY，Wang CH，et al.Role of locus coeruleus in analgesia caused by stimulation of supraoptic nucleus.Sheng Li Hsueh Pao，1995，47：320.
收稿：1999-07-16, 百拇医药