IL-2 重组毒素的克隆、表达及对IL-2R+淋巴细胞的特异性细胞毒效应
作者：毕美霞 杨渝珍 舒平 韩玲
单位：毕美霞(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 杨渝珍(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 舒平(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 韩玲(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)；杨渝珍(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室，武汉 430030)
关键词：重组毒素；白细胞介素2；绿脓杆菌外毒素；免疫抑制
中国免疫学杂志000301 摘 要：目的：为了探讨肿瘤细胞的靶向性杀伤途径。方法：采用PCR-Cloning技术和DNA重组技术，构建了2类IL-2-PE40’嵌合基因的表达载体，分别由IPTG和温度(42℃)诱导表达，并对表达产物进行了酶切片段大小、电泳迁移率、分子量、IL-2和PE40’组分抗原性及细胞学效应的检测。结果：发现重组毒素对表面表达IL-2受体的活化T淋巴细胞具有明显杀伤效应，并有抑制混合淋巴细胞反应的作用。结论：该IL-2-PE40’融合蛋白确实具有明显的特异性免疫抑制效应。
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中国图书分类号：R392.11 Q784
The cloning，expressing of IL-2-PE40’ chimeric gene and cytotoxic effect on the activated IL-2R+ lymphocytes
BI Mei-Xia
(Department of Ethology,Institute of Oncology,Peking Union Medical College & Chinese Academy Medical Science,Beijing 100021.)
YANG Yu-Zhen
(Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
, 百拇医药
SHU Ping
(Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract：b：To find a therapeutic pathway special to kill tumour cells.Methods:The PCR-cloning technique was used to construct three prokaryotic expressing vectors into which chimeric IL-2-PE40’ gene fragment was inserted and induced to express by IPTG or 42℃ respectively.The SDS-PAGE、ELISA、cytological and enzymological assay were also used to identify the different characteristic of the expressed product.Results:It was found that IL-2-PE40’ fusion protein was very toxic to the activated IL-2R+ T-lymphocytes and able to inhibit mixed lymphocytes reaction in vitro.Conclusion:The IL-2-PE40’ fusion constructed had obvious inhibition to body immune function.
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Key words：Recombination toxin IL-2 Pseudomonas exotoxin Immune inhibition
PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的毒素蛋白，其分子由3个结构域组成。利用DNA重组技术,用IL-2的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain la)后所构建成的嵌合基因[1]，所表达的融合蛋白能特异性地作用于IL-2受体阳性细胞(IL-2R+)，由受体介导的内吞途径进入细胞内，使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化失活，导致细胞死亡。IL-2重组毒素有望作为一种新型的特异性免疫抑制剂，用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病的治疗[2，3]。本课题研究了IL-2重组毒素的克隆、表达及表达产物的特异性细胞杀伤效应。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及细胞系 pUC19及pTLIL-2克隆载体为本室保存；表达载体pRSET(A)、(B)、(C) 为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学科学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)均为本组自存；绿脓杆菌产外毒素标准株PA103由美籍华人张延龄教授惠赠。
1.1.2 试剂 基因工程实验所用的各种试剂均购于华美生物工程公司，IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供，PA103抗血清由军事医学科学院微生物及流行病研究所购得。
1.1.3 仪器 PE480 DNA热循环仪、CO2培养箱及基因工程实验所需仪器设备。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体Y1、Y2、Y3的构建 我们分别设计了2对引物，序列如下：P1 5’-CCGctgcagAGTCATCGCCTGCACTTT-3',P2 5'-CCGgaattcTTACTTCAG-GTCCTCGC-3',5'端分别加入Pst I和EcoR I 的酶切位点，用于扩增和克隆PE基因的I b+II+III区的DNA片段；第2对引物的序列为：P3 5’-CTCgaattccatatgGCACCTACTTCAAGT-3',P4 5'-GGCActgcagTGTTGAGATCATGCTTTGAC-3', 5'端分别加入EcoR I+Nde I和Pst I的酶切位点，用于扩增和克隆IL-2的DNA片段，见图1。嵌合基因表达载体pBIP40'(简称Y1)的构建及鉴定见文献[4]。嵌合基因表达载体pBV220-IP40'、pBV221-IP40'(简称Y2、Y3)为先用EcoR I酶切Y1和载体pBV220或pBV221，去磷酸化处理后，进行连接及转化实验，用菌落PCR方法筛选阳性菌落，再经酶切鉴定，筛出含正向插入片段的质粒。
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图1 Y1、Y2、Y3载体构建图
Fig.1 The construction of vector Y1，Y2，Y3
1.2.2 重组毒素的诱导表达及表达产物的鉴定 加入IPTG诱导Y1载体表达，Y2和Y3为温敏载体，升温至42℃诱导表达。于3、6 h和过夜3个时间点分别收集菌液，超声破菌，进行SDS-PAGE电泳分析，离心后收集上清和沉淀，进行ELISA检测[5]。
1.2.3 重组毒素IL-2-PE40'初纯品的制备 超声破菌后,离心收集包涵体,按文献[6]进行变性、复性，在最后得到的上清中加入复性液,对 0.01 mmol/L的PBS透析48 h，期间共换液6次。于透析前、中、后分别取样,加到培养的HL60细胞中, 共同孵育6、12、24、48 h,同时设PBS、盐酸胍、RPMI1640等作为对照,观察纯化过程中所使用的化学试剂对细胞有无直接毒性作用,以确定进行细胞学实验时应该采用的最大无毒浓度。
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1.2.4 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 取健康人抗凝外周血,按常规制备转化的淋巴母细胞，悬浮后加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长，继续培养3 d，换液后按2×106 ml-1的密度，以100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中，分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'初纯品孵育，于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用，为维持活化淋巴细胞的正常生长，曾经使用过0、1、5、10 U/孔不同浓度的rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的rIL-2的维持浓度。
1.2.5 IL-2-PE40'初纯品对混合淋巴细胞杀伤效应的测定 取2份健康人外周血，分离单个核细胞，按常规方法进行单向和双向混合淋巴细胞培养，分别加入IL-2-PE40'初制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI1640稀释)、同样处理的未转化菌(简称空白菌)的胞浆原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl于混合细胞培养孔中，一式3份，同时设PBS与RPMI1640对照，培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。
, 百拇医药
2 结果
2.1 IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的鉴定 诱导表达后转化菌的SDS-PAGE电泳显示在5.5 kD处有一新的融合蛋白条带(图2)，空载菌中则无此条带。由于我们设计的毒素片段比文献报道的大些，故以PE40’表示，薄层扫描显示该蛋白的表达量为18%～20%，用ELISA方法鉴定表达产物的免疫原性，证明确有IL-2和PE组份，并多以包涵体的方式存在，详见文献[5]。
图2 IL-2-PE40’嵌合基因表达产物的SDS-PAGE图谱
Fig.2 The SDS-PAGE of expressing products of IL-2-PE40’ chimeric gene
Note:Line 1(O/N)、2(6 h)、3(3 h):the expressing product of vector Y1 in E.coli;line 5(O/N)、6(6 h)、7(3 h):the expressing product of vector Y2/Y3 in E.coli;line 4:protein bands of standard molecular weight;line 8:cytosol protein of untransformed bacteria as a blank control.The arrow directs the band of fusion protein
, 百拇医药
2.2 IL-2-PE40'初纯品最大无毒量的确定 结果表明，透析48 h后的初纯品对细胞生长基本无影响，与细胞共孵育6、12、24、48 h后，细胞活度分别为90%、85%、80%、60%，与同时设立的RPMI1640对照组的细胞活度基本相同。未经透析或透析不彻底的初纯品中由于盐酸胍存在，孵育后48 h可致细胞全部死亡。由此可确定透析48 h后样品中盐酸胍已基本去除，其浓度即指定为它的最大无毒浓度。
2.3 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 表1可见在不同IL-2浓度下(10、5、1、0 U/孔，96孔)，以透析后的原液杀伤效应最大，48 h仍有一定的杀伤作用，而1∶2、1∶4稀释后，杀伤效应也依次降低。
表1 IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(
±s，OD570，n=6)
, 百拇医药
Tab.1 Killing effect of IL-2-PE40' on activated lymphocytes (±s，OD570，n=6) Groups
Dilution degree
Undilution(98 μg/ml)
1∶0
1∶2
1∶4
Incubation time
(A)
6 h
, 百拇医药
24 h
48 h
0.80±0.002
0.82±0.020
1.00±0.010
0.62±0.0201)
0.36±0.0201)
0.23±0.0141)
0.70±00.0182)
0.65±0.0301)
, 百拇医药
0.50±0.0221)
0.77±0.030
0.72±0.0192)
0.66±0.0152)
(B)
6 h
24 h
48 h
0.80±0.005
0.81±0.010
1.00±0.030
, 百拇医药
0.68±0.0051)
0.42±0.0211)
0.38±0.0181)
0.79±0.005
0.65±0.0211)
0.55±0.0151)
0.82±0.010
0.70±0.0202)
0.60±0.0272)
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(C)
6 h
24 h
48 h
0.80±0.002
0.83±0.010
0.88±0.001
0.62±0.0181)
0.46±0.0201)
0.41±0.0051)
0.78±0.008
, 百拇医药
0.61±0.0091)
0.52±0.0141)
0.80±0.005
0.72±0.011
0.70±0.0091)
(D)
6 h
24 h
48 h
0.75±0.002
0.67±0.022
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0.65±0.010
0.62±0.0181)
0.47±0.0091)
0.40±0.0081)
0.67±0.0112)
0.59±0.0301)
0.51±0.0111)
0.74±0.014
0.66±0.015
0.62±0.0142)
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Note:The culture medium of (A)、(B)、(C)、(D) group contains 10、5、1、0 U/well rIL-2 respectively.Compared with control,1) P<0.001,2)P<0.01
2.4 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞培养的抑制作用 加PBS或RPMI1640的对照组，反映细胞活性的OD570值分别为0.51～0.58和0.78，而加入重组毒素初纯原液的实验组，单向和双向混合培养的淋巴细胞OD值分别降至0.28和0.47；加入1∶2稀释的重组毒素后，OD值则为0.45和0.53，略有升高，但仍低于对照组，结果说明重组毒素对混合淋巴细胞反应均有明显的抑制作用(P<0.01和P<0.001)。3 讨论
我们利用PCR-Cloning技术，构建了2类分别由IPTG和温度诱导的原核表达载体pBIP40'和V220-IP40'/pBV221-IP40'，并对其表达产物进行了酶切、电泳、抗原活性、生物学活性等方面的检测和鉴定。在对表达产物的初纯品进行细胞杀伤效应研究时，为排除各种杂质的干扰，我们设计了多种不同的实验，证明盐酸胍对细胞的毒性最大，必须充分透析样品至少48 h，以排除残留盐酸胍的毒性作用。
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活化后的淋巴母细胞表面表达IL-2受体，细胞的增殖和生长均需依赖IL-2，表2的结果也说明当细胞对照中不加IL-2时(0 U/ml)，6～48 h期间，细胞生长不良，加入rIL-2后，细胞才能维持生长，考虑到IL-2和IL-2-PE40'都能与IL-2R竞争结合，因此，加入的rIL-2的浓度不能过高，本实验中使用的IL-2-PE40'的浓度远远大于rIL-2的浓度，在竞争中完全占优势。
混合淋巴细胞反应可以测定受体和供体之间HLA抗原相容程度和移植后排斥反应的强烈程度，IL-2-PE40'对单向和双向混合淋巴细胞反应均有抑制作用，综合以上结果，肯定了IL-2-PE40'的免疫抑制效果[7]，但整体实验效果还有待深入研究。
编辑：许四平
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39370701)
, 百拇医药 作者简介：毕美霞, 女, 26岁，博士生；
指导教师，杨渝珍，女,教授,研究方向为分子免疫和分子肿瘤
作者单位：舒平(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室，武汉 430030)
参考文献：
[1]Haya L G,David F,Vijay C et al.Cytotoxic activity of an interleukin-2-pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia Coli.Proc Natl Acad Sci USA,1988；85:1922
[2]John P C,Haya L G,Robert L et al. Chimeric cytotoxin IL-2-PE40' delays and mitigates adjuvant-induced arthritis in rats.Proc Natl Acad Sci USA,1989;86:287
, 百拇医药
[3]Kozak R W,Haya L G,Jonesl P K et al.IL-2-PE40 prevents the development of tumours in mice injected with IL-2 receptor expressing EL4 transfected tumour cells. J Immunol,1991;145:2766
[4]杨渝珍，舒 平，祁学忠 et al.重组毒素IL-2-PE40'的克隆和初步表达.武汉大学学报(自然科学)，1996；生物工程专刊：121
[5]毕美霞，杨渝珍，韩 玲 et al.用ELISA鉴定原核细胞中IL-2-PE40'的表达产物. 同济医科大学学报，1998；27(3)：238
[6]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1995：379-384
[7]Robert L,Haya L G,Le H P et al.Selective immunosuppression of activated T cell with the chimeric toxin IL-2-PE40'inhibition of experimental autoimmune uneoretinitis.J Immunol,1989;143:3498
收稿日期：1998-08-09
修改日期：1999-11-10, 百拇医药
单位：毕美霞(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 杨渝珍(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 舒平(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)； 韩玲(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室，北京100021)；杨渝珍(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室，武汉 430030)
关键词：重组毒素；白细胞介素2；绿脓杆菌外毒素；免疫抑制
中国免疫学杂志000301 摘 要：目的：为了探讨肿瘤细胞的靶向性杀伤途径。方法：采用PCR-Cloning技术和DNA重组技术，构建了2类IL-2-PE40’嵌合基因的表达载体，分别由IPTG和温度(42℃)诱导表达，并对表达产物进行了酶切片段大小、电泳迁移率、分子量、IL-2和PE40’组分抗原性及细胞学效应的检测。结果：发现重组毒素对表面表达IL-2受体的活化T淋巴细胞具有明显杀伤效应，并有抑制混合淋巴细胞反应的作用。结论：该IL-2-PE40’融合蛋白确实具有明显的特异性免疫抑制效应。
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中国图书分类号：R392.11 Q784
The cloning，expressing of IL-2-PE40’ chimeric gene and cytotoxic effect on the activated IL-2R+ lymphocytes
BI Mei-Xia
(Department of Ethology,Institute of Oncology,Peking Union Medical College & Chinese Academy Medical Science,Beijing 100021.)
YANG Yu-Zhen
(Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
, 百拇医药
SHU Ping
(Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract：b：To find a therapeutic pathway special to kill tumour cells.Methods:The PCR-cloning technique was used to construct three prokaryotic expressing vectors into which chimeric IL-2-PE40’ gene fragment was inserted and induced to express by IPTG or 42℃ respectively.The SDS-PAGE、ELISA、cytological and enzymological assay were also used to identify the different characteristic of the expressed product.Results:It was found that IL-2-PE40’ fusion protein was very toxic to the activated IL-2R+ T-lymphocytes and able to inhibit mixed lymphocytes reaction in vitro.Conclusion:The IL-2-PE40’ fusion constructed had obvious inhibition to body immune function.
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Key words：Recombination toxin IL-2 Pseudomonas exotoxin Immune inhibition
PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的毒素蛋白，其分子由3个结构域组成。利用DNA重组技术,用IL-2的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain la)后所构建成的嵌合基因[1]，所表达的融合蛋白能特异性地作用于IL-2受体阳性细胞(IL-2R+)，由受体介导的内吞途径进入细胞内，使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化失活，导致细胞死亡。IL-2重组毒素有望作为一种新型的特异性免疫抑制剂，用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病的治疗[2，3]。本课题研究了IL-2重组毒素的克隆、表达及表达产物的特异性细胞杀伤效应。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及细胞系 pUC19及pTLIL-2克隆载体为本室保存；表达载体pRSET(A)、(B)、(C) 为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学科学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)均为本组自存；绿脓杆菌产外毒素标准株PA103由美籍华人张延龄教授惠赠。
1.1.2 试剂 基因工程实验所用的各种试剂均购于华美生物工程公司，IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供，PA103抗血清由军事医学科学院微生物及流行病研究所购得。
1.1.3 仪器 PE480 DNA热循环仪、CO2培养箱及基因工程实验所需仪器设备。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体Y1、Y2、Y3的构建 我们分别设计了2对引物，序列如下：P1 5’-CCGctgcagAGTCATCGCCTGCACTTT-3',P2 5'-CCGgaattcTTACTTCAG-GTCCTCGC-3',5'端分别加入Pst I和EcoR I 的酶切位点，用于扩增和克隆PE基因的I b+II+III区的DNA片段；第2对引物的序列为：P3 5’-CTCgaattccatatgGCACCTACTTCAAGT-3',P4 5'-GGCActgcagTGTTGAGATCATGCTTTGAC-3', 5'端分别加入EcoR I+Nde I和Pst I的酶切位点，用于扩增和克隆IL-2的DNA片段，见图1。嵌合基因表达载体pBIP40'(简称Y1)的构建及鉴定见文献[4]。嵌合基因表达载体pBV220-IP40'、pBV221-IP40'(简称Y2、Y3)为先用EcoR I酶切Y1和载体pBV220或pBV221，去磷酸化处理后，进行连接及转化实验，用菌落PCR方法筛选阳性菌落，再经酶切鉴定，筛出含正向插入片段的质粒。
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图1 Y1、Y2、Y3载体构建图
Fig.1 The construction of vector Y1，Y2，Y3
1.2.2 重组毒素的诱导表达及表达产物的鉴定 加入IPTG诱导Y1载体表达，Y2和Y3为温敏载体，升温至42℃诱导表达。于3、6 h和过夜3个时间点分别收集菌液，超声破菌，进行SDS-PAGE电泳分析，离心后收集上清和沉淀，进行ELISA检测[5]。
1.2.3 重组毒素IL-2-PE40'初纯品的制备 超声破菌后,离心收集包涵体,按文献[6]进行变性、复性，在最后得到的上清中加入复性液,对 0.01 mmol/L的PBS透析48 h，期间共换液6次。于透析前、中、后分别取样,加到培养的HL60细胞中, 共同孵育6、12、24、48 h,同时设PBS、盐酸胍、RPMI1640等作为对照,观察纯化过程中所使用的化学试剂对细胞有无直接毒性作用,以确定进行细胞学实验时应该采用的最大无毒浓度。
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1.2.4 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 取健康人抗凝外周血,按常规制备转化的淋巴母细胞，悬浮后加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长，继续培养3 d，换液后按2×106 ml-1的密度，以100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中，分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'初纯品孵育，于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用，为维持活化淋巴细胞的正常生长，曾经使用过0、1、5、10 U/孔不同浓度的rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的rIL-2的维持浓度。
1.2.5 IL-2-PE40'初纯品对混合淋巴细胞杀伤效应的测定 取2份健康人外周血，分离单个核细胞，按常规方法进行单向和双向混合淋巴细胞培养，分别加入IL-2-PE40'初制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI1640稀释)、同样处理的未转化菌(简称空白菌)的胞浆原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl于混合细胞培养孔中，一式3份，同时设PBS与RPMI1640对照，培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。
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2 结果
2.1 IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的鉴定 诱导表达后转化菌的SDS-PAGE电泳显示在5.5 kD处有一新的融合蛋白条带(图2)，空载菌中则无此条带。由于我们设计的毒素片段比文献报道的大些，故以PE40’表示，薄层扫描显示该蛋白的表达量为18%～20%，用ELISA方法鉴定表达产物的免疫原性，证明确有IL-2和PE组份，并多以包涵体的方式存在，详见文献[5]。
图2 IL-2-PE40’嵌合基因表达产物的SDS-PAGE图谱
Fig.2 The SDS-PAGE of expressing products of IL-2-PE40’ chimeric gene
Note:Line 1(O/N)、2(6 h)、3(3 h):the expressing product of vector Y1 in E.coli;line 5(O/N)、6(6 h)、7(3 h):the expressing product of vector Y2/Y3 in E.coli;line 4:protein bands of standard molecular weight;line 8:cytosol protein of untransformed bacteria as a blank control.The arrow directs the band of fusion protein
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2.2 IL-2-PE40'初纯品最大无毒量的确定 结果表明，透析48 h后的初纯品对细胞生长基本无影响，与细胞共孵育6、12、24、48 h后，细胞活度分别为90%、85%、80%、60%，与同时设立的RPMI1640对照组的细胞活度基本相同。未经透析或透析不彻底的初纯品中由于盐酸胍存在，孵育后48 h可致细胞全部死亡。由此可确定透析48 h后样品中盐酸胍已基本去除，其浓度即指定为它的最大无毒浓度。
2.3 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 表1可见在不同IL-2浓度下(10、5、1、0 U/孔，96孔)，以透析后的原液杀伤效应最大，48 h仍有一定的杀伤作用，而1∶2、1∶4稀释后，杀伤效应也依次降低。
表1 IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(
±s，OD570，n=6), 百拇医药
Tab.1 Killing effect of IL-2-PE40' on activated lymphocytes (
±s，OD570，n=6) GroupsDilution degree
Undilution(98 μg/ml)
1∶0
1∶2
1∶4
Incubation time
(A)
6 h
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24 h
48 h
0.80±0.002
0.82±0.020
1.00±0.010
0.62±0.0201)
0.36±0.0201)
0.23±0.0141)
0.70±00.0182)
0.65±0.0301)
, 百拇医药
0.50±0.0221)
0.77±0.030
0.72±0.0192)
0.66±0.0152)
(B)
6 h
24 h
48 h
0.80±0.005
0.81±0.010
1.00±0.030
, 百拇医药
0.68±0.0051)
0.42±0.0211)
0.38±0.0181)
0.79±0.005
0.65±0.0211)
0.55±0.0151)
0.82±0.010
0.70±0.0202)
0.60±0.0272)
, http://www.100md.com
(C)
6 h
24 h
48 h
0.80±0.002
0.83±0.010
0.88±0.001
0.62±0.0181)
0.46±0.0201)
0.41±0.0051)
0.78±0.008
, 百拇医药
0.61±0.0091)
0.52±0.0141)
0.80±0.005
0.72±0.011
0.70±0.0091)
(D)
6 h
24 h
48 h
0.75±0.002
0.67±0.022
, http://www.100md.com
0.65±0.010
0.62±0.0181)
0.47±0.0091)
0.40±0.0081)
0.67±0.0112)
0.59±0.0301)
0.51±0.0111)
0.74±0.014
0.66±0.015
0.62±0.0142)
, http://www.100md.com
Note:The culture medium of (A)、(B)、(C)、(D) group contains 10、5、1、0 U/well rIL-2 respectively.Compared with control,1) P<0.001,2)P<0.01
2.4 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞培养的抑制作用 加PBS或RPMI1640的对照组，反映细胞活性的OD570值分别为0.51～0.58和0.78，而加入重组毒素初纯原液的实验组，单向和双向混合培养的淋巴细胞OD值分别降至0.28和0.47；加入1∶2稀释的重组毒素后，OD值则为0.45和0.53，略有升高，但仍低于对照组，结果说明重组毒素对混合淋巴细胞反应均有明显的抑制作用(P<0.01和P<0.001)。3 讨论
我们利用PCR-Cloning技术，构建了2类分别由IPTG和温度诱导的原核表达载体pBIP40'和V220-IP40'/pBV221-IP40'，并对其表达产物进行了酶切、电泳、抗原活性、生物学活性等方面的检测和鉴定。在对表达产物的初纯品进行细胞杀伤效应研究时，为排除各种杂质的干扰，我们设计了多种不同的实验，证明盐酸胍对细胞的毒性最大，必须充分透析样品至少48 h，以排除残留盐酸胍的毒性作用。
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活化后的淋巴母细胞表面表达IL-2受体，细胞的增殖和生长均需依赖IL-2，表2的结果也说明当细胞对照中不加IL-2时(0 U/ml)，6～48 h期间，细胞生长不良，加入rIL-2后，细胞才能维持生长，考虑到IL-2和IL-2-PE40'都能与IL-2R竞争结合，因此，加入的rIL-2的浓度不能过高，本实验中使用的IL-2-PE40'的浓度远远大于rIL-2的浓度，在竞争中完全占优势。
混合淋巴细胞反应可以测定受体和供体之间HLA抗原相容程度和移植后排斥反应的强烈程度，IL-2-PE40'对单向和双向混合淋巴细胞反应均有抑制作用，综合以上结果，肯定了IL-2-PE40'的免疫抑制效果[7]，但整体实验效果还有待深入研究。
编辑：许四平
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39370701)
, 百拇医药 作者简介：毕美霞, 女, 26岁，博士生；
指导教师，杨渝珍，女,教授,研究方向为分子免疫和分子肿瘤
作者单位：舒平(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室，武汉 430030)
参考文献：
[1]Haya L G,David F,Vijay C et al.Cytotoxic activity of an interleukin-2-pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia Coli.Proc Natl Acad Sci USA,1988；85:1922
[2]John P C,Haya L G,Robert L et al. Chimeric cytotoxin IL-2-PE40' delays and mitigates adjuvant-induced arthritis in rats.Proc Natl Acad Sci USA,1989;86:287
, 百拇医药
[3]Kozak R W,Haya L G,Jonesl P K et al.IL-2-PE40 prevents the development of tumours in mice injected with IL-2 receptor expressing EL4 transfected tumour cells. J Immunol,1991;145:2766
[4]杨渝珍，舒 平，祁学忠 et al.重组毒素IL-2-PE40'的克隆和初步表达.武汉大学学报(自然科学)，1996；生物工程专刊：121
[5]毕美霞，杨渝珍，韩 玲 et al.用ELISA鉴定原核细胞中IL-2-PE40'的表达产物. 同济医科大学学报，1998；27(3)：238
[6]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1995：379-384
[7]Robert L,Haya L G,Le H P et al.Selective immunosuppression of activated T cell with the chimeric toxin IL-2-PE40'inhibition of experimental autoimmune uneoretinitis.J Immunol,1989;143:3498
收稿日期：1998-08-09
修改日期：1999-11-10, 百拇医药